Kinetic Mesure et visualisation en temps réel de Reprogrammation somatique

L’objectif global de ces procédures est de visualiser et de suivre la progression de la reprogrammation des cellules somatiques en cellules souches pluripotentes induites ou iPSC. Cette méthode peut être utilisée pour répondre à des questions clés dans le domaine des iPSC, telles que la façon dont la cinétique de reprogrammation et l’efficacité de la reprogrammation sont modifiées par les tissus somatiques utilisés, les technologies de reprogrammation appliquées et les combinaisons de matrice et de milieu utilisées avec celle-ci. Le principal avantage de cette méthode est qu’elle utilise des marqueurs de surface cellulaire pour examiner les transitions des cellules somatiques en iPSC, de sorte que vous pouvez utiliser cette technologie pour pouvoir surveiller en temps réel les événements de reprogrammation.

Le septième jour après la transduction, lavez les fibroblastes avec deux millilitres de DPBS par puits et ajoutez 0,5 millilitre de 37 degrés Celsius 05 % EDTA dans chaque puits pour une incubation de trois à cinq minutes à 37 degrés Celsius. Lorsque les cellules se sont arrondies, arrêtez la réaction avec deux millilitres de milieu fibroblastique à 37 degrés Celsius par puits et pipetez doucement le milieu au fond de chaque puits pour déloger les cellules. Transférez les fibroblastes de chaque puits dans des tubes coniques individuels de 15 millilitres et collectez-les par centrifugation.

Remettez les granulés en suspension dans deux millilitres de milieu de fibroblaste frais à 37 degrés Celsius et comptez les cellules de chaque condition de culture. Ensuite, ensemencez une fois 10 à cinq cellules dans des puits conditionnés pré-préparés indépendants de l’alimentation dans une plaque de culture tissulaire à six puits et incubez les cellules transduites dans l’incubateur de culture cellulaire pendant la nuit. Le lendemain, remplacez le milieu dans chaque puits par le milieu approprié pour l’application sur cellule.

Ensuite, placez la plaque dans l’imageur et réglez le logiciel pour capturer des images continues de contraste de phase et fluorescentes pour chaque puits toutes les six à huit heures pendant les 14 jours suivants. À la fin de l’expérience de reprogrammation, lavez les puits une fois avec deux millilitres de milieu DMEM/F12 à 37 degrés Celsius. Jetez le lavage et étiquetez les cellules avec un millilitre par puits des anticorps primaires appropriés dans un milieu DMEM/F12 frais pendant 45 minutes à 37 degrés Celsius dans l’incubateur.

À la fin de l’incubation, lavez les cellules deux fois avec un milieu DMEM/F12 à 37 degrés Celsius. Ensuite, jetez le lavage et étiquetez les cellules avec un millilitre d’anticorps secondaires appropriés dans un milieu DMEM/F12 à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius. À la fin de l’incubation, laver les cellules deux fois de plus avec un milieu DMEM/F12.

Remplacez ensuite le lavage dans chaque puits par deux millilitres de milieu frais DMEM/F12 à 37 degrés Celsius. Placez la parabole dans l’imageur et ouvrez le logiciel d’imagerie. Pour configurer les numérisations sur le logiciel du système d’imagerie, sélectionnez d’abord la position du plateau à utiliser et le type de parabole à numériser.

Ensuite, sélectionnez Imagerie de puits entiers, le modèle de balayage des puits souhaités et les canaux fluorescents appropriés pour l’identification en temps réel des marqueurs de surface d’intérêt. Ensuite, étiquetez l’expérience à scanner et définissez les points temporels et les intervalles pour les échantillons à scanner chaque jour. Pour analyser un ensemble de tests analysés, sélectionnez l’expérience qui vous intéresse, puis sélectionnez Lancer une nouvelle tâche d’analyse.

Sélectionnez ensuite la définition de traitement appropriée pour le type d’analyse en fonction des canaux utilisés pour l’imagerie, par exemple, PSC Phase Colony Count. Nommez la tâche d’analyse. Et sélectionnez la plage horaire de l’analyse et les puits à analyser.

Lancez ensuite la tâche d’analyse. Pour mesurer les points de temps de reprogrammation souhaités à partir de puits individuels, lavez une fois le puits d’intérêt avec deux millilitres de DPBS. Remplacez ensuite le lavage par un millilitre de solution préchauffée à 37 degrés Celsius à 05 % trypsine-EDTA.

Après cinq minutes de 37 degrés Celsius, rincez la trypsine contre le fond du puits pour dissocier les cellules en une suspension unicellulaire et transférez les cellules dans un tube conique de 15 millilitres. À l’aide de trois millilitres de DPBS, lavez toutes les cellules restantes du puits et tirez-les dans le tube de 15 millilitres. Ajoutez 10 millilitres supplémentaires de DPBS aux cellules et faites-les tourner par centrifugation.

Remettez la pastille en suspension dans un millilitre de milieu DMEM/F12 pour le comptage. Diluez ensuite la suspension cellulaire à une concentration d’un fois dixième de six cellules par millilitre et aliquotez-un millilitre de cellules par tube pour le nombre approprié d’échantillons. Ensuite, étiquetez les cellules avec les anticorps primaires d’intérêt dans un millilitre de milieu DMEM/F12 pendant 30 à 45 minutes à température ambiante en mélangeant.

À la fin de l’incubation, lavez les cellules deux fois dans un milieu DMEM/F12 à 37 degrés Celsius. Remettez les pastilles en suspension dans un millilitre de DPBS et transférez les échantillons dans des tubes FACS individuels. Acquérir les profils de cytométrie en flux des plaques reprogrammées.

Transférez ensuite les fichiers FCS sur un ordinateur et importez-les dans le logiciel d’analyse approprié. Ouvrez le premier fichier de contrôle dans un nuage de points avant par côté et réglez l’axe des y sur une échelle logarithmique. Créez ensuite une porte polygonale autour de la population vivante.

Ensuite, créez un tracé de zone de diffusion latérale par hauteur de dispersion avec les cellules vivantes et définissez une porte rectangulaire pour exclure les doublets. Ensuite, utilisez ces portes pour analyser les fichiers d’échantillons expérimentaux sous les canaux fluorescents appropriés afin d’identifier les populations d’intérêt dans leurs quadrants respectifs. La reprogrammation des fibroblastes BJ avec la reprogrammation des virus Sendai génère des cellules SSEA4+CD44 à un rythme différent de la reprogrammation des fibroblastes DF1, démontrant qu’une comparaison précoce du pourcentage de cellules SSEA4+CD44 de type cellules souches pluripotentes peut être utilisée pour suivre la progression de la reprogrammation.

Dans le temps de la cytométrie en flux, les fibroblastes CD24-CD44+ et CD44+ négatifs EpCAM forment des populations doublement négatives qui se transforment ensuite en cellules souches pluripotentes CD24+CD44 et CD44 positives EpCAM respectivement, ce qui souligne davantage la progression de la reprogrammation. L’imagerie en temps réel des cultures en reprogrammation après le réensemencement démontre une formation progressive de colonies correspondant à une augmentation logarithmique de leur confluence et démontrant l’expression finale des marqueurs pluripotents positifs et négatifs des fibroblastes à la fin de la reprogrammation. De plus, l’utilisation d’un gène rapporteur permet de mesurer la confluence sous contraste de phase avec une augmentation plus progressive de la confluence GFP observée par rapport à la confluence totale.

En effet, dans cette expérience représentative, la confluence de la GFP au jour 19 était inférieure à la moitié de la confluence totale correspondant à la reprogrammation complète. Une fois maîtrisée, cette technique pourrait être utilisée pour élucider des informations sur les événements de reprogrammation et suivre la cinétique de la reprogrammation des fibroblastes humains. Cette technique pourrait également être utilisée pour examiner différents tissus de cellules somatiques de départ, les technologies de reprogrammation utilisées et les combinaisons de matrices moyennes pour élucider les événements de reprogrammation.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’utiliser la surveillance en temps réel et l’expression des marqueurs de surface cellulaire, afin de pouvoir suivre la reprogrammation des fibroblastes humains en iPSC.