Name: Kinetic Mesure et visualisation en temps réel de Reprogrammation somatique (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: Découvrez la mesure cinétique et la visualisation en temps réel de la reprogrammation somatique en cellules iPSC. Cette méthode utilise la cytométrie en flux pour suivre les marqueurs de pluripotence et améliorer la recherche en biologie des cellules souches.

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Les auteurs remercient Tchad MacArthur pour des discussions utiles.

<ol><li>Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cells%3A+past%2C+present%2C+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cells: past, present, and future.</a> Cell Stem Cell. 10, 678-684 (2012).</li>
<li>Robinton, D. A., Daley, G. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+promise+of+induced+pluripotent+stem+cells+in+research+and+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The promise of induced pluripotent stem cells in research and therapy.</a> Nature. 481, 295-305 (2012).</li>
<li>Kamata, M., Liang, M., Liu, S., Nagaoka, Y., Chen, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+cell+monitoring+of+hiPSC+generation+and+differentiation+using+differential+expression+of+endogenous+microRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Live cell monitoring of hiPSC generation and differentiation using differential expression of endogenous microRNAs.</a> PLoS One. 5, e11834(2010).</li>
<li>Vendrell, M., Zhai, D., Er, J. C., Chang, Y. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+strategies+in+fluorescent+probe+development%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Rev%22%5BJournal%5D)">Combinatorial strategies in fluorescent probe development.</a> Chem Rev. 112, 4391-4420 (2012).</li>
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<li>Xu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immortalized+fibroblast-like+cells+derived+from+human+embryonic+stem+cells+support+undifferentiated+cell+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Immortalized fibroblast-like cells derived from human embryonic stem cells support undifferentiated cell growth.</a> Stem Cells. 22, 972-980 (2004).</li>
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<li>Singh, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+live+alkaline+phosphatase+substrate+for+identification+of+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Rev%22%5BJournal%5D)">Novel live alkaline phosphatase substrate for identification of pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Rev. 8, 1021-1029 (2012).</li>
<li>Naujok, O., Lenzen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critical+re-evaluation+of+CD24-positivity+of+human+embryonic+stem+cells+differentiated+into+pancreatic+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Rev%22%5BJournal%5D)">A critical re-evaluation of CD24-positivity of human embryonic stem cells differentiated into pancreatic progenitors.</a> Stem Cell Rev. 8, 779-791 (2012).</li>
<li>Ramirez, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brief+report%3A+benchmarking+human+pluripotent+stem+cell+markers+during+differentiation+into+the+three+germ+layers+unveils+a+striking+heterogeneity%3A+all+markers+are+not+equal%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Brief report: benchmarking human pluripotent stem cell markers during differentiation into the three germ layers unveils a striking heterogeneity: all markers are not equal.</a> Stem Cells. 29, 1469-1474 (2011).</li>
<li>Huang, H. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+cell+adhesion+molecule+%28EpCAM%29+complex+proteins+promote+transcription+factor-mediated+pluripotency+reprogramming%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Epithelial cell adhesion molecule (EpCAM) complex proteins promote transcription factor-mediated pluripotency reprogramming.</a> J Biol Chem. 286, 33520-33532 (2011).</li>
<li>Kolle, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+human+embryonic+stem+cell+surface+markers+by+combined+membrane-polysome+translation+state+array+analysis+and+immunotranscriptional+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Identification of human embryonic stem cell surface markers by combined membrane-polysome translation state array analysis and immunotranscriptional profiling.</a> Stem Cells. 27, 2446-2456 (2009).</li>
<li>Thyagarajan, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creation+of+engineered+human+embryonic+stem+cell+lines+using+phiC31+integrase%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Creation of engineered human embryonic stem cell lines using phiC31 integrase.</a> Stem Cells. 26, 119-126 (2008).</li>
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Tous les auteurs [RHQ, JSTA, KS, et UL] sont des employés de Thermo Fisher Scientific, qui produit certains des réactifs et des instruments utilisés dans cet article.

Cette étude fournit des stratégies de surveillance et de suivi du processus de reprogrammation à l’aide de la cytométrie en flux et de l’analyse basée sur l’imagerie en temps réel. Les étapes critiques du protocole sont le lancement de la reprogrammation, la mesure de la progression de la reprogrammation en fonction de l’expression des marqueurs et la surveillance en temps réel de la reprogrammation. N’importe quelle méthode de reprogrammation de votre choix peut être utilisée, mais nous nous concentrons ici sur la repro...

les cellules de patients dérivées induites souches pluripotentes (CISP) sont des outils prometteurs pour la thérapie cellulaire et le criblage de médicaments. Elles fournissent une source autologue de cellules pour la thérapie. En outre, ils englobent un très large éventail de fonds génétiques, ce qui permet une analyse détaillée in vitro de maladies génétiques au - delà des lignes de courant les cellules souches embryonnaires (ESC) permettrait. Des progrès récents ont conduit au développement de plusieurs procédés pour produire iPSCs, y compris une reprogrammation avec le virus Sendai, des plasmides épisomiques ou ARNm 1,2. Notamment, les différentes méthodes de reprogrammation sont associés à des niveaux d&#39;efficacité et de sécurité différents, et sont susceptibles de différer d&#39;autres façons qui influent sur leur pertinence pour diverses applications. Avec la disponibilité d&#39;une variété de technologies de reprogrammation, il est devenu important de développer des méthodes pour évaluer le processus de reprogrammation. La plupart des méthodes existantes reposent sur l&#39;inspection qualitative de la morphologie ou la colorationavec des colorants et des anticorps spécifiques de cellules souches. Une méthode développée récemment fait appel à des journalistes de fluorescence lentiviraux qui sont sensibles aux miARN spécifiques à la CFP ou des ARNm spécifiques de cellules différenciées 3. Ces méthodes de surveillance facilitent la sélection et l&#39;optimisation des techniques de reprogrammation pour des situations différentes. Par exemple, CDy1 a été utilisé comme une sonde fluorescente pour le début de CSPi afin de dépister des modulateurs de reprogrammation 4. La capacité d&#39;observer et de comparer les différentes expériences de reprogrammation est également critique pour une meilleure compréhension du processus lui-même. Par exemple, on sait maintenant que certains types de cellules somatiques sont plus faciles à reprogrammer 5 que d&#39; autres, et que les cellules passent par des états intermédiaires pendant la reprogrammation 6-8. Malheureusement, les mécanismes sous-jacents du processus de reprogrammation ne sont pas encore complètement compris et, par conséquent, les différences exactes entre les méthodes de reprogrammation restent également à defined. Ainsi, les méthodes de suivi, d&#39;évaluation et de comparaison des événements de reprogrammation continuent d&#39;être critique pour le domaine des cellules souches. Les méthodes décrites dans ce protocole permettent le suivi et l&#39;évaluation du processus de reprogrammation et illustrent la façon dont ces techniques peuvent être utilisées pour comparer les différents ensembles de réactifs de reprogrammation. La première approche consiste à cytométrie en flux analyse en utilisant des combinaisons d&#39;anticorps dirigés contre la cellule positive et négative souches pluripotentes (PSC) des marqueurs. Le second couple d&#39;approche imagerie en temps réel et la mesure de la confluence totale (la surface couverte pour cent par les cellules) et la confluence des signaux de marqueur (la surface couverte pour cent par les signaux fluorescents).

<table><tbody><tr><td>DMEM, hyperglucose, GlutaMAXSupplément, pyruvate</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10569-010</td><td></td></tr><tr><td>Sérum fœtal de bovin, qualifié pour les cellules souches embryonnaires, origine américaine</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16141-061</td><td></td></tr><tr><td>Solution d’acides aminés non essentiels MEM (100x)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA (0,05 %), rouge de phénol.</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Souris (ICR) Fibroblastes embryonnaires inactivés</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A24903</td><td></td></tr><tr><td>Facteur d’attachement Protéine (1x)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S-006-100</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12, supplément GlutaMAX</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10565-018</td><td></td></tr><tr><td>KnockOut Sérum de remplacement</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td>10828010</tr><tr><td>2-Mercaptoéthanol (55 mM)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>Colgénase, type IV, poudre</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17104-019</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Select Enzyme (1x), sans rouge de phénol.</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12563-011</td><td></td></tr><tr><td>DPBS, sans calcium, sans magnésium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Geltrex sans LDV, qualifié hESC, matrice de membrane basale</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1413302</td><td></td></tr><tr><td>Essential 8 Medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1517001</td><td></td></tr><tr><td>FGF-Basic (AA 1-155) Protéine humaine recombinante</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PHG0264</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 0,5 m EDTA, pH 8,0</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15575-020</td><td></td></tr><tr><td>Albumine bovine fraction V (solution à 7,5 %)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15260-037</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1 M)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline-Streptomycine (10 000 U/ml)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>InSolution Y-27632</td><td>EMD Millipore</td><td>688001</td><td></td></tr><tr><td>Kit de reprogrammation CytoTune-iPS Sendai</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1378001</td><td></td></tr><tr><td>Kit de reprogrammation CytoTune-iPS 2.0 Sendai</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A16517</td><td></td></tr><tr><td>Countess II Compteur de cellules automatisé</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AMQAX1000</td><td></td></tr><tr><td>Countess Lames de chambre de comptage de cellules</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C10228</td><td></td></tr><tr><td>BJ ATCC Fibroblastes du prépuce humain, néonatal</td><td>ATCC</td><td>CRL-2522</td><td></td></tr><tr><td>DF1 Fibroblaste dermique humain adulte</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>BG01V/hOG Cellules variantes hESC hOct4-GFP Cellules rapporteures</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R7799-105</td><td></td></tr><tr><td>IncuCyte ZOOM</td><td>Essen BioScience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SSEA-4 Anticorps, conjugué Alexa Fluor 647 (MC813-70)</td><td>Anticorps Thermo Fisher Scientific</td><td>SSEA421</td><td></td></tr><tr><td>SSEA-4, conjugué Alexa Fluor 488 (eBioMC-813-70 (MC-813-70))</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A14810</td><td></td></tr><tr><td>SSEA-4 Anticorps (MC813-70)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>41-4000</td><td></td></tr><tr><td>TRA-1-60 Anticorps (cl.A)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>&nbsp ; 41-1000</td><td></td></tr><tr><td>CD44 Anticorps anti-humain/souris (clone IM7), conjugué PE-Cy5</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A27094</td><td></td></tr><tr><td>CD44 Alexa Fluor 488 Kit de conjugué pour l’imagerie de cellules vivantes</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A25528</td><td></td></tr><tr><td>CD44 Anticorps anti-humain/souris CD44 (clone IM7)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>RM-5700 (n’est plus disponible)</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps secondaire anti-IgG (H+L) de chèvre, conjugué Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>&nbsp ; A-11029</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps secondaire anti-Rat IgG (H+L) de chèvre, conjugué Alexa Fluor 594</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>&nbsp ; A-11007</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatase alcaline Coloration vivante</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A14353</td><td></td></tr><tr><td>TRA-1-60 Alexa Fluor 488 Kit de conjugué pour l’imagerie de cellules vivantes</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A25618</td><td></td></tr><tr><td>CD24 Souris Anti-Human mAb (clone SN3), conjugué FITC</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>MHCD2401</td><td></td></tr><tr><td>anticorps anti-microglobuline bêta-2, conjugué FITC (B2M-01)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A15737</td><td></td></tr><tr><td>EpCAM / CD326 Anticorps conjugué FITC (VU-1D9)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A15755</td><td></td></tr><tr><td>CD73 / NT5E Anticorps (7G2)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>41-0200</td><td></td></tr><tr><td>VECTOR Kit de substrat de phosphatase alcaline rouge (AP)</td><td>Vector Laboratories</td><td>SK-5100</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Axio Observer.Z1 microscope&nbsp ;</td><td>Carl Zeiss</td><td>491912-0003-000</td><td></td></tr><tr><td>Logiciel d’analyse de données FlowJo</td><td>FLOJO, LLC</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Attune Cytomètre de focalisation acoustique, Laser bleu/rouge</td><td>Thermo Fisher</td><td>Utilisation scientifique Attune NXT&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>S3e\ Trieur de cellules (488/561 nm)</td><td>BIO-RAD</td><td>1451006</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 12 x 75 mm Tube avec capuchon de crépine</td><td>Corning</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 15 ml, haute clarté, bouchon à vis à joint en forme de dôme</td><td>Corning</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>Falcon T-75 Flacon</td><td>Corning</td><td>353136</td><td></td></tr><tr><td>Falcon T-175 Flacon</td><td>Corning</td><td>353112</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Antenne 6 puits</td><td>Corning</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>Heraeus Heracell CO2 Incubateur roulant</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>51013669</td><td></td></tr><tr><td>Tubes Microfuge antiadhésifs, sans RNase, 1,5 ml</td><td></td><td>AM12450</td><td></td></tr><tr><td>Mélangeur d’échantillons HulaMixer</td><td></td><td>15920D</td><td></td></tr></tbody></table>

kinetic mesure et visualisation en temps réel de reprogrammation somatique

Kinetic Measurement and Real Time Visualization of Somatic Reprogramming

La reprogrammation somatique a permis la conversion de cellules adultes en cellules souches pluripotentes induites (iPSC) à partir de divers antécédents génétiques et phénotypes de maladies. Des progrès récents ont permis d’identifier des méthodes plus efficaces et plus sûres pour l’introduction de facteurs de reprogrammation. Cependant, il existe peu d’outils pour surveiller et suivre la progression de la reprogrammation. Les méthodes actuelles de surveillance de la reprogrammation reposent sur l’inspection qualitative de la morphologie ou de la coloration avec des colorants et des anticorps spécifiques aux cellules souches. Les outils permettant de disséquer la progression de la génération d’iPSC peuvent aider à mieux comprendre le processus dans différentes conditions à partir de diverses sources cellulaires. 
Cette étude présente des approches clés pour la mesure cinétique de la progression de la reprogrammation à l’aide de la cytométrie en flux ainsi que pour la surveillance en temps réel par imagerie. Pour mesurer la cinétique de la reprogrammation, une analyse de flux a été effectuée à des moments discrets à l’aide d’anticorps dirigés contre des marqueurs de cellules souches pluripotentes positifs et négatifs. La combinaison de la visualisation en temps réel et de l’analyse des flux permet l’étude quantitative de la reprogrammation à différentes étapes et fournit une comparaison plus précise des différents systèmes et méthodes. L’analyse en temps réel, basée sur l’image, a été utilisée pour la surveillance continue des fibroblastes lorsqu’ils sont reprogrammés dans un système de milieu sans mangeoire. La cinétique de formation des colonies a été mesurée sur la base de la confluence dans les canaux de contraste de phase ou de fluorescence après coloration avec un colorant phosphatase alcaline vivant ou des anticorps contre SSEA4 ou TRA-1-60. Les résultats ont indiqué que la mesure de la confluence fournit des mesures semi-quantitatives pour suivre la progression de la reprogrammation.

Surveillance Kinetics Reprogrammation par cytométrie en flux CD44 est un marqueur de fibroblaste alors SSEA4 est un marqueur PSC 6,10. Comme prévu à partir de ce modèle d&#39;expression, par cytométrie de flux de fibroblastes BJ montre un SSEA4 - CD44 + population qui facilite la création de portes quadrants en combinaison avec l&#39;échantillon souillures. Au cours de reprogr...

Le protocole présenté dans cette étude décrit des procédés pour la surveillance en temps réel de la progression de la reprogrammation par l&#39;intermédiaire de la mesure cinétique des marqueurs de cellules souches pluripotentes positives et négatives à l&#39;aide de l&#39;analyse de cytométrie en flux. Le protocole comprend également l&#39;évaluation fondée sur l&#39;imagerie-de la morphologie, et le marqueur ou l&#39;expression rapporteur lors de la génération iPSC.

Kinetic Mesure et visualisation en temps réel de Reprogrammation somatique

Somatic reprogramming has enabled the conversion of adult cells to induced pluripotent stem cells (iPSC) from diverse genetic backgrounds and disease ...

L'objectif général de ces procédures est de visualiser et de suivre la progression de la reprogrammation des cellules somatiques en cellules souches pluripotentes induites, ou CSPI. Cette méthode peut être utilisée pour répondre à des questions essentielles dans le domaine des CSPI, telles que la manière dont les cinétiques de reprogrammation et les efficacités de reprogrammation sont modifiées par les tissus somatiques utilisés, les technologies de reprogrammation appliquées, ainsi que par les combinaisons de matrices et de milieux employées. Le principal avantage de cette méthode réside dans son utilisation de marqueurs de surface cellulaire pour observer les transitions des cellules somatiques vers les CSPI, ce qui permet de surveiller en temps réel les événements de reprogrammation à l’aide de cette technologie.Le septième jour suivant la transduction, laver les fibroblastes avec deux millilitres de DPBS par puits et ajouter 0,5 millilitre d'EDTA à 05 % à 37 degrés Celsius dans chaque puits, puis incuber pendant trois à cinq minutes à 37 degrés Celsius. Lorsque les cellules sont devenues arrondies, arrêter la réaction avec deux millilitres de milieu pour fibroblastes à 37 degré

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