La détection des protéines liant l'ARN par In vitro ARN Pull-down en adipocytes Culture

L’objectif global de cette expérience est de récupérer les protéines de liaison à l’ARN d’un transcrit d’ARN à partir de tissu adipeux brun. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans ce domaine, telles que : quels sont les mécanismes de régulation de l’ARN codant à longue durée de vie et des protéines d’ARN associées. Le principal avantage de cette tactique est qu’elle est facile à réaliser.

L’ARN utilisé pour démontrer cette procédure est un fragment de la région non traduite du récepteur antigénique 3-Prime, ci-après dénommée AR 3-Prime UTR. Commencez par amplifier l’oligo AR T7 et la séquence partielle de l’ADN de la luciférase de la luciole du plasmide psiCHECK-2. Les amorces et les paramètres utilisés sont détaillés dans le document d’accompagnement.

Après l’amplification, utilisez les produits de la PCR comme matrices pour synthétiser des ARN biotinylés à l’aide d’un kit de transcription in vitro, en suivant les instructions du fabricant. Ensuite, incubez le mélange à 37 degrés Celsius pendant quatre heures. Après la transcription in vitro, ajoutez un microlitre de Dnase à la réaction et incubez-la à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes pour dégrader l’ADN matrice.

Ensuite, portez le volume total à 60 microlitres avec de l’eau. Appliquez les ARN biotinylés sur les colonnes de purification pour éliminer le sel et les nucléotides non incorporés. Ensuite, après avoir mesuré la concentration d’ARN, stockez la RNase à moins 80 degrés Celsius pour les tests ultérieurs.

Le jour de l’essai, décongeler l’ARN biotinylé congelé sur de la glace. Ensuite, pour vous assurer que l’ARN d’intérêt a la bonne structure secondaire, chauffez 50 microlitres de celui-ci à 90 degrés Celsius pendant deux minutes. Réfrigérer sur de la glace pendant deux minutes.

Ensuite, ajoutez 50 microlitres de tampon de structure d’ARN 2X et laissez l’ARN se replier à température ambiante pendant 30 minutes. Ensuite, mettez en suspension les billes magnétiques enrobées de streptavidine dans leur flacon d’origine en les faisant brièvement vortexer. Ensuite, transférez 150 microlitres de billes remises en suspension dans un tube de 1,5 millilitre.

Placez le tube dans un support magnétique pendant une minute pour séparer les billes magnétiques et le surnageant. À l’aide d’une pipette, retirez et jetez le surnageant. Conservez la pastille de perle.

Lavez les perles une fois en remettant en suspension la pastille de perle dans un millilitre du tampon de liaison et de lavage 1X recommandé par le fabricant, puis placez le tube sur un rotateur pendant cinq minutes à température ambiante. Laver avec le tampon A et le tampon B deux fois. Après l’incubation, jeter le surnageant et conserver la pastille de perle.

Ensuite, mettez en suspension la bille de bille dans 300 microlitres de tampon de lavage et de liaison 2X. Divisez les billes en trois tubes de 1,5 millilitre avec 100 microlitres de billes par tube. Ajoutez 100 microlitres d’eau sans RNase, 100 microlitres d’ARN luciférase biotinylé et 100 microlitres d’ARN AR 3-Prime UTR biotinylé.

Incuber chaque mélange de billes pendant une heure à température ambiante avec rotation. Ensuite, placez les tubes sur l’aimant pendant une minute. Retirez et jetez le surnageant.

Conservez les granulés de perles. Ensuite, lavez les perles deux fois, en remettant à chaque fois les billes en suspension avec 400 microlitres de tampon de lavage et de liaison 1X, puis en les plaçant sur le rotateur pendant cinq minutes à température ambiante. Placez les tubes sur un aimant pendant une minute.

Ensuite, retirez et jetez tout le surnageant. Remettre en suspension chaque pastille de bille dans 50 microlitres de tampon d’isolement nucléaire. En prévision de la prochaine partie du protocole, assurez-vous que tous les tampons, ainsi que les homogénéisateurs en verre de dénonciation, sont refroidis sur de la glace.

La préparation du lysat cellulaire doit se dérouler sur de la glace. Pour chaque test d’extraction d’ARN à effectuer, préparez une boîte de 15 centimètres de préadipocytes différenciés provenant de souris C57 Black Six de type sauvage âgées de trois semaines. Quatre à cinq jours plus tard, pour récolter les cellules, ajoutez 10 à 15 millilitres de PBF, puis utilisez un grattoir pour retirer les cellules de la boîte.

Transférez-les dans un tube de 50 millilitres puis granulez-les par centrifugation à 200 fois G pendant cinq minutes à température ambiante. Après l’essorage, utilisez une pipette d’un millilitre pour aspirer et jeter le surnageant. Ensuite, remettez en suspension la pastille cellulaire dans deux millilitres de tampon hypotonique et incubez les cellules sur de la glace pendant quinze minutes.

Transférez les cellules dans un homogénéisateur en verre de 15 millilitres et cisaillez mécaniquement les cellules sur de la glace en 20 coups. Granuler les noyaux cellulaires par centrifugation à 3300 fois G pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius. Après l’essorage, transférez le surnageant dans des tubes de 1,5 millilitre et conservez le granulé sur de la glace pour une utilisation ultérieure.

Au surnageant, ajoutez du chlorure de potassium à 3 molaires pour obtenir une concentration finale de 150 millimolaires. Faites tourner à 20 000 fois G pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius. Après la centrifugation, il y aura une couche lipidique sur le dessus.

Utilisez une pipette d’un millilitre pour le retirer soigneusement. Ensuite, prélevez le surnageant de lysat cellulaire citoplasmique. Ensuite, à l’aide d’une pipette d’un millilitre, remettre en suspension la pastille de noyaux dans un millilitre de tampon d’isolement nucléaire et transférer dans un homogénéisateur en verre de 15 millilitres.

Cisailler mécaniquement les noyaux sur la glace en 100 coups. Granulez les débris nucléaires par centrifugation à 20 000 fois G pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius. Recueillir le surnageant sous forme de lysat cellulaire nucléaire.

Ceux-ci peuvent être combinés avec le lysat cytoplasmique recueilli plus tôt ou conservés séparément pour des applications ultérieures. Ici, les échantillons sont combinés dans un rapport de un pour un. Ajouter un inhibiteur de RNase au lysat cellulaire non fractionné pour obtenir une concentration finale de 0,5 unité par microlitre.

Ensuite, mettez de côté 100 microlitres de lysat cellulaire sur de la glace comme contrôle d’entrée pour le western blot. Divisez le lysat cellulaire en trois aliquotes égales avec un millilitre de lysat cellulaire dans chaque tube de 1,5 millilitre et incubez avec des billes vierges d’ARN luciférase conjuguées et AR 3-Prime UTR, respectivement, pendant trois heures à quatre degrés Celsius avec rotation. Après l’incubation, placez les tubes sur l’aimant pendant une minute.

À l’aide d’une pipette d’un millilitre, on recueille le surnageant, puis on isole l’ARN et on évalue l’intégrité de l’ARN, comme décrit dans le document d’accompagnement. Gardez les granulés de perles sur de la glace. Lavez les perles magnétiques six fois.

À chaque fois, mettez les billes en suspension dans un millilitre de tampon d’isolement nucléaire contenant 40 unités d’inhibiteur de RNase et 0,25 % d’igepal. Faites pivoter les tubes pendant deux minutes à température ambiante. Placez les tubes dans un support magnétique pour séparer les billes magnétiques et le surnageant.

Au bout d’une minute, aspirez et jetez le surnageant, puis placez les granulés de perles sur de la glace. Pour éluer les complexes protéiques d’ARN des billes pour le western blot, il faut d’abord remettre en suspension chaque pastille de bille dans 75 microlitres de tampon d’isolement nucléaire. Ensuite, ajoutez 25 microlitres de tampon de chargement par transfert western 4X.

contenant des SDS, pour obtenir un volume total de 100 microlitres. Enfin, faites bouillir les billes dans cette solution de 100 microlitres à 95 degrés Celsius pendant cinq minutes. Effectuer un western blot pour vérifier la RBP comme décrit dans le document d’accompagnement.

Dans cette expérience, un fragment d’ARN du récepteur antigénique a été utilisé comme appât pour capturer sa protéine de liaison, HuR. Un appât d’ARN luciférase de luciférase de luciole non lié à la protéine HuR et une aliquote de billes de streptavidine vierges non conjuguées ont servi de témoins négatifs. Les interactions entre les protéines de l’ARN peuvent se produire soit dans le noyau, soit dans le cytoplasme, et ce protocole de pull-down peut être appliqué aux lysats de cellules nucléaires ou cytoplasmiques totales ou fractionnées.

L’analyse par western blot a montré la protéine HuR dans le lysat cellulaire non fractionné, ou entrée, à l’aide de l’anticorps monoclonal. La fraction d’élusion de l’ARN du récepteur de l’antigène a également donné un résultat positif, indiquant la présence de la protéine HuR dans le lysat adipocytaire en utilisant les billes conjuguées à l’ARN du récepteur de l’antigène pour le test de réduction de l’ARN. La fraction d’élution de l’ARN de la luciférase et l’échantillon de billes à blanc ont donné des résultats négatifs, indiquant que les interactions non spécifiques n’étaient pas détectables avec cette approche.

Pris ensemble, ces résultats suggèrent que l’interaction entre le fragment d’ARN du récepteur de l’antigène et la protéine HuR était spécifique. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de récupérer les protéines de liaison à l’ARN à partir d’un transcrit d’ARN du tissu adipeux brun. Une fois maîtrisé, cela peut être fait en 24 heures, si cela est effectué correctement.