Les analyses microscopiques de Criblage à haut débit des facteurs de l'hôte impliqués dans Brucella L'infection des cellules HeLa

L’objectif global de ce test basé sur la microscopie à haut débit est d’identifier les facteurs de l’hôte impliqués dans l’infection à Brucella des cellules HeLa. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l’interaction hôte-pathogène, telles que l’identification des protéines de l’hôte qui favorisent ou empêchent la colonisation par l’agent pathogène intracellulaire Brucella. Le principal avantage de cette technique est que le flux de travail semi-automatisé du laboratoire vétérinaire à l’analyse des images permet aux robots et aux hauts débits efficaces de créer des expériences.

Cette méthode peut donc fournir un aperçu des interactions entre l’hôte de Brucella à l’aide de criblages de siRNA. La plupart du protocole peut être appliqué à d’autres stratégies de dépistage. Par exemple, ou des banques d’ARNi.

Après la culture des cellules HeLa et la préparation de plaques de criblage avec des ARNi conformément au protocole de texte, décongelez une plaque noire de 384 puits par centrifugation à 300 fois G et à température ambiante pendant 20 minutes. Préparez le milieu de transfection en utilisant du dmem à température ambiante sans FCS. Diluer le réactif de transfection un à 200 et mélanger soigneusement avant utilisation.

À l’aide d’un distributeur de réactifs, ajoutez 25 microlitres de fluide de transfection dans chaque puits de la plaque à 384 puits et mélangez les solutions en déplaçant la plaque d’avant en arrière. Incuber la plaque à température ambiante pendant une heure pour permettre la formation du complexe réactif de transfection de siRNA. Pendant ce temps, préparez les cellules HeLa en aspirant le milieu de culture et en ajoutant 2,5 millilitres de 0,05 % de trypsine EDTA dans du PBS pour laver une fois les cellules sous-confluentes d’un flacon de 75 centimètres carrés.

Ajoutez ensuite 1,5 millilitre de trypsine fraîche et transférez le ballon à 37 degrés Celsius pendant deux à trois minutes jusqu’à ce que les cellules s’arrondissent. Utilisez 10 millilitres de dmem 60 % FCS préchauffé pour remettre les cellules en suspension. Ensuite, utilisez un compteur de cellules automatisé pour compter les cellules avant de préparer une suspension cellulaire de 10 000 cellules par millilitre en dmem avec 16 % de FCS.

Ajoutez 50 microlitres de suspension cellulaire dans chaque puits de réactif de transfection. Ce qui donne 500 cellules par puits. Déplacez la plaque d’avant en arrière pour répartir uniformément les cellules.

Ensuite, laissez la plaque à température ambiante pendant cinq à 10 minutes pour permettre aux cellules de se stabiliser. Utilisez du parafilm pour sceller la plaque. Et incubez-le dans un incubateur humide sur une plaque d’aluminium préchauffée à 37 degrés Celsius avec 5 %C02 pendant 72 heures.

Travailler avec l’agent pathogène de classe trois B.abortus est dangereux et les réglementations locales en matière de biosécurité doivent être respectées, ce qui comprend le port d’une combinaison de protection, de gants de protection, d’un masque et de lunettes de protection. Un jour, avant l’infection, inoculez la quantité précédemment déterminée de culture de démarrage de B. abortus dans 50 millilitres de milieu TSB KM. Dans une bouteille à bouchon à vis de 250 millilitres.

Utilisez du parafilm pour sceller la bouteille et faites pousser des bactéries pendant la nuit à 37 degrés Celsius et 100 tr/min sur un agitateur à une densité optique de 600,8 à 1,1. Mesurer la densité optique 600 de la culture bactérienne. Et préparez le milieu d’infection en diluant la culture bactérienne dans dmem 10 %FCS pour obtenir la multiplicité d’infection souhaitée.

Ou, MOI. À l’aide d’un laveur de plaques automatisé, remplacez le milieu de transfection par 50 microlitres de milieu d’infection. À l’intérieur de la hotte, transférez la plaque dans la cage de centrifugation et centrifugez la plaque à 384 puits à 400 fois G et quatre degrés Celsius pendant 20 minutes.

Ensuite, utilisez du parafilm pour sceller la plaque et incubez-la sur une plaque d’aluminium préchauffée à 37 degrés Celsius et 5 % C02 pendant quatre heures. Après l’incubation avec le laveur de plaques automatisé, utilisez du dmem avec 10 % de FCS contenant 100 microgrammes par millilitre de dentrimysen ou GM pour laver les cellules afin d’inactiver les bactéries extracellulaires. Ensuite, utilisez du parafilm pour sceller la plaque et replacez-la sur la plaque d’aluminium préchauffée dans l’incubateur pendant encore 40 heures pour le test final.

Pour réparer les cellules, utilisez d’abord du PBS pour laver les puits. Ensuite, remplacez le PBS par 50 microlitres de 3,7 % de PFA. En 2 à pH 7,4.

Et incubez les cellules à température ambiante pendant 20 minutes. Après l’incubation, utilisez 50 microlitres de PBS pour remplacer le milieu de fixation. Pour colorer les échantillons avec le laveur de plaques automatisé, commencez par utiliser 50 microlitres de 1 % Triton X-100 dans du PBS pendant 10 minutes pour perméabiliser les cellules.

Après avoir utilisé du PBS pour laver les cellules trois fois, ajoutez 50 microlitres de PBS avec un microgramme par millilitre de DAPI et incubez à température ambiante pendant 30 minutes. Ensuite, utilisez du PBS pour laver les cellules trois fois avant de les protéger de la lumière. Transférez la plaque dans le microscope automatisé.

Configurez les paramètres du microscope. Sélectionnez le 10-X subjectif. Sélectionnez ensuite le format de plaque correspondant à la plaque 384 puits.

Acquérir neuf sites par puits. Sélectionnez Activer la mise au point laser. Et, concentrez-vous sur l’assiette et le fond du puits.

Ensuite, définissez le premier puits acquis comme puits initial pour trouver l’échantillon et tous les sites pour l’autofocus du site. Ensuite, pour le canal DAPI, ajustez manuellement le décalage Z de la mise au point. Ensuite, appuyez sur Trouver un échantillon pour mettre l’accent sur le fond du puits.

À l’aide de la fonction AutoExposure, obtenez une bonne estimation du temps d’exposition. Corrigez manuellement le temps d’exposition du canal DAPI pour assurer une large plage dynamique avec une faible surexposition. Utilisez ce temps d’exposition pour imager plusieurs sites sur la plaque.

Et ajustez le temps d’exposition manuellement jusqu’à ce que les pixels les plus lumineux atteignent environ 80 % de la luminosité maximale sur les sites. Répétez les étapes pour régler la mise au point et le temps d’exposition, en conséquence pour tous les autres canaux. Ensuite, commencez l’acquisition de la plaque complète.

Pour le dosage du point final, utilisez les canaux DAPI et GFP pour imager la plaque entière. Pour exécuter une analyse d’image sur des cellules colorées dans le test du point final, après avoir calculé un modèle d’ombrage, conformément au protocole de texte sous Afficher les paramètres de sortie, sélectionnez le dossier d’entrée avec les images et un dossier de sortie avec les résultats. Ensuite, définissez le texte que les images ont en commun et chargez les modèles d’ombrage.

Cliquez sur Démarrer le mode test et assurez-vous que les paramètres de pause et d’affichage de tous les modules sont désactivés. Activez le paramètre de pause et d’affichage pour le module neuf ImageMath. Le symbole de pause activé apparaîtra en jaune.

La fonction d’affichage activée apparaîtra comme un œil ouvert. Ensuite, cliquez sur Exécuter pour exécuter l’analyse jusqu’au module neuf. Dans le module neuf, ajustez le paramètre multiplier la deuxième image par une valeur qui supprimera le signal DAPI à Brucella sans supprimer les noyaux.

Pour tester les valeurs du module, appuyez sur Step. Faites un clic droit sur l’image nouvellement ouverte et réglez le contraste de l’image sur log normalisé. À plusieurs reprises, revenez au module neuf.

Ajustez le paramètre, multipliez la deuxième image par et enjambez à nouveau le module jusqu’à ce que le signal Brucella soit complètement supprimé, tandis que les zones noires qui indiquent une sursoustraction sont minimisées. Trouver de bons paramètres pour certains modules nécessite d’optimiser progressivement les paramètres. Il est certainement important d’enjamber à plusieurs reprises les modules, d’essayer différentes valeurs et d’observer l’effet sur le résultat affiché.

Activez la pause et l’affichage pour le module 10. Identifiez les objets principaux. Définissez la limite inférieure du paramètre sur le seuil, suffisamment élevée pour que les noyaux soient segmentés et que l’arrière-plan soit ignoré.

Pour identifier une bonne valeur, passez sur le module, puis cliquez avec le bouton droit de la souris sur l’image d’entrée et affichez l’histogramme où le pic indique généralement l’arrière-plan. À partir de l’intensité de fond, augmentez le paramètre jusqu’à ce que la bonne segmentation des noyaux soit obtenue comme indiqué dans l’image de sortie. L’objectif du pipeline d’analyse d’images est d’identifier les cellules qui contiennent des bactéries répliquantes.

Ceci est réalisé en fixant différents seuils pour le signal de l’agent pathogène dans le noyau, le péri-noyau et le corps cellulaire de Voronoï. Activez la pause et l’affichage pour le module 15. Filtrez les objets, comme indiqué précédemment, puis appuyez sur Exécuter.

Réglez la valeur minimale du paramètre suffisamment élevée pour que seules les cellules avec Brucella clairement visible dans le noyau soient conservées et que toutes les autres soient filtrées. Pour identifier une bonne valeur, passez par-dessus le module et affichez l’image de sortie. Augmentez la valeur progressivement jusqu’à ce que seules les cellules avec Brucella clairement visible au niveau du noyau soient conservées.

Après avoir filtré les cellules avec des bactéries dans le périnoyau et le corps cellulaire de Voronoï dans les modules 16 et 17 selon le protocole texte, quittez le mode de test et décochez tous les symboles oculaires à côté des modules pour vous assurer qu’aucun des modules ne s’affiche avant d’exécuter l’analyse complète. Enfin, appuyez sur Analyser les images pour démarrer l’analyse. Une fois l’analyse terminée, inspectez les images PNG résultantes ainsi que la feuille de calcul CSV pour vous assurer que l’analyse a fonctionné de manière fiable sur l’ensemble de la plaque.

Effectuez le test d’entrée et le scoring de l’infection selon le protocole texte. Cette figure montre un exemple d’analyse d’image utilisée pour identifier automatiquement les cellules infectées dans le test final. Des cellules HeLa colorées au DAPI ont été identifiées.

Un péri-noyau de huit pixels de largeur entourant le noyau. Et un corps cellulaire de Voronoï par extension du noyau, de 25 pixels, a été calculé. Une cellule était considérée comme infectée si le signal de l’agent pathogène dépassait le seuil correspondant dans au moins un compartiment.

Brucella nécessite des réarrangements agissants pour réussir l’engagement des cellules hôtes. Ainsi, la déplétion d’ARP23 est un contrôle positif approprié pour le criblage de siRNA. La déplétion d’ARPC3 a réduit le nombre de cellules avec des bactéries proliférantes deux jours après l’infection.

Par rapport aux cellules contrôlées traitées brouillées. L’analyse d’image automatisée a permis de quantifier une diminution de l’infection des cellules HeLa appauvries en ARPC3 par rapport aux cellules contrôlées dans ce graphique. La déplétion d’ARPC3 a également montré une réduction de l’infection à Brucella dans le test d’entrée par rapport aux cellules contrôlées.

Comme le montre le nombre réduit de Brucella intracellulaires représentés en jaune. Enfin, la quantification de l’infection par analyse d’images automatisée a confirmé que le nombre de cellules infectées ainsi que le nombre de bactéries intracellulaires dans les cellules infectées étaient réduits par l’épuisement de l’ARPC3. Une fois maîtrisé, ce protocole peut donner des résultats d’analyse d’images dans un délai d’une semaine et demie après le début de l’expérience.

Lors de cette procédure, il est important d’examiner attentivement les résultats de l’analyse d’image pour s’assurer que les paramètres choisis fonctionnent bien sur l’ensemble de la plaque. Après cette procédure, d’autres méthodes telles que l’imagerie des cellules vivantes peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires. Comme lorsque vous faites du trafic, un certain facteur d’hôte interagit avec Brucella.

Ou comment l’épuisement d’un gène affecte la dynamique intracellulaire de l’infection. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la biologie des infections pour explorer les facteurs de l’hôte nécessaires à l’infection à Brucella dans un test sur cellules HeLa. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’identifier les facteurs de l’hôte qui favorisent ou empêchent la colonisation réussie des cellules HeLa par l’agent pathogène intracellulaire Brucella abortus.

N’oubliez pas que travailler avec Brucella abortus peut être extrêmement dangereux et que les réglementations locales en matière de biosécurité doivent être strictement respectées.