Name: Les analyses microscopiques de Criblage à haut débit des facteurs de lhôte impliqués dans Brucella Linfection des cellules HeLa (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 29 s
Description: Apprenez un criblage à haut débit par microscopie pour identifier les facteurs de l'hôte impliqués dans l'infection de cellules HeLa par Brucella. Cette méthode utilise des écrans siRNA et une analyse d'images automatisée.

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Ce travail a été soutenu par les subventions 51RT 0_126008 et 51RTP0_151029 pour le projet de recherche et de développement technologique (RTD) InfectX et TargetInfectX, respectivement, dans le cadre de SystemsX.ch, l’Initiative suisse pour la biologie des systèmes. Nous reconnaissons les subventions 310030B_149886 du Fonds national suisse de la recherche scientifique (FNS). Les travaux de S.H.L et A.C. ont été soutenus par le programme international de doctorat « Fellowships for Excellence » du Biozentrum. Simone Muntwiler est récompensée pour son assistance technique. Nous tenons à remercier Dirk Bumann pour la fourniture du pNF106 et Jean Celli pour le pJC43 et le pJC44.

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<li>Celli, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brucella+evades+macrophage+killing+via+VirB-dependent+sustained+interactions+with+the+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Brucella evades macrophage killing via VirB-dependent sustained interactions with the endoplasmic reticulum.</a> J Exp Med. 198, 545-556 (2003).</li>
<li>Porte, F., Liautard, J. P., Kohler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+acidification+of+phagosomes+containing+Brucella+suis+is+essential+for+intracellular+survival+in+murine+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Early acidification of phagosomes containing Brucella suis is essential for intracellular survival in murine macrophages.</a> Infect Immun. 67, 4041-4047 (1999).</li>
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<li>Kuhbacher, A., Gouin, E., Cossart, P., Pizarro-Cerda, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+InlC+secretion+to+investigate+cellular+infection+by+the+bacterial+pathogen+Listeria+monocytogenes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Imaging InlC secretion to investigate cellular infection by the bacterial pathogen Listeria monocytogenes.</a> J Vis Exp. , e51043(2013).</li>
<li>Kentner, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shigella+reroutes+host+cell+central+metabolism+to+obtain+high-flux+nutrient+supply+for+vigorous+intracellular+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Shigella reroutes host cell central metabolism to obtain high-flux nutrient supply for vigorous intracellular growth.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 9929-9934 (2014).</li>
<li>Celli, J., Salcedo, S. P., Gorvel, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brucella+coopts+the+small+GTPase+Sar1+for+intracellular+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Brucella coopts the small GTPase Sar1 for intracellular replication.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 1673-1678 (2005).</li>
<li>von Bargen, K., Gorvel, J. P., Salcedo, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Internal+affairs%3A+investigating+the+Brucella+intracellular+lifestyle%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+microbiology+reviews%22%5BJournal%5D)">Internal affairs: investigating the Brucella intracellular lifestyle.</a> FEMS microbiology reviews. 36, 533-562 (2012).</li>
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</ol>

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Les pathogènes bactériens ont développé de nombreuses stratégies pour manipuler les cellules hôtes eucaryotes à leur avantage. Les agents pathogènes à l’origine d’infections aiguës présentent souvent une prolifération rapide qui s’accompagne d’une alarme importante du système immunitaire et d’une perte de viabilité des cellules infectées. En revanche, Brucella et d’autres agents pathogènes qui causent des infections chroniques parviennent à établir des interactions durables au sein des cellules hôtes. Par conséq...

Espèces de Brucella sont, les agents pathogènes intracellulaires facultatifs Gram négatif appartenant à la classe des α-protéobactéries. Ils provoquent des avortements et l&#39;infertilité chez leurs hôtes naturels tels que les bovins, les chèvres, les moutons ou entraînant des pertes économiques sévères dans les zones endémiques. La brucellose est l&#39; une des maladies zoonotiques les plus importants dans le monde entier causant plus d&#39; un demi - million de nouvelles infections humaines par an 1. La transmission à l&#39;homme est le plus souvent causée par un contact direct avec des animaux infectés ou par ingestion d&#39;aliments contaminés tels que le lait non pasteurisé. Les symptômes de la maladie fébrile sont non spécifiques, ce qui provoque des difficultés pour le diagnostic de la brucellose. Si non traitée, les patients peuvent développer une infection chronique avec des symptômes plus graves tels que l&#39; arthrite, l&#39; endocardite et la neuropathie 2. Au niveau cellulaire Brucella est capable d&#39;envahir les cellules phagocytaires et non phagocytaires et reproduit dans un intracellulairecompartiment connu sous le nom de la vacuole Brucella (BCV). Internalisation des bactéries nécessite des réarrangements du cytosquelette d&#39;actine par Rac, Rho, et l&#39; activation directe de Cdc42 3. A l&#39; intérieur de la cellule hôte eucaryote, la BCV trafique le long de la voie endocytique et en dépit de l&#39;interaction avec les lysosomes, les bactéries parviennent à éviter une dégradation 4. L&#39; acidification de la BCV par le vésiculaire ATPase est nécessaire pour induire l&#39;expression du système IV de sécrétion de type bactérien (T4SS) 5. On croit que les effecteurs bactériennes sécrétées par le T4SS sont essentiels pour Brucella pour établir son créneau réplicative, depuis la suppression de la T4SS 6 ou l&#39; inhibition de l&#39;ATPase plomb vésiculaire à des défauts dans la mise en place de la niche intracellulaire 7. Les bactéries ne se répliquent pas pendant la phase de la traite jusqu&#39;à ce qu&#39;ils parvenir à un compartiment vacuolaire ER dérivé 8. Une fois la prolifération intracellulaire se produit, la BCV se trouve dans classociation OSE avec des marqueurs tels que l&#39; ER calnexine et le glucose-6-phosphatase 6. Les mécanismes moléculaires par lesquels Brucella pénètre dans les cellules, évite la dégradation lysosomale, et enfin se réplique dans un compartiment ER-like demeurent largement inconnus. Les facteurs de l&#39; hôte impliqués dans différentes étapes de l&#39; infection ont principalement été identifiés par des approches ciblées ou un écran à petite échelle petits ARN interférents (siRNA) effectuée dans les cellules de drosophile 9. Ceux - ci ont mis en lumière la contribution des facteurs d&#39;accueil individuels au cours de l&#39; infection à Brucella , mais nous sommes encore loin d&#39;une compréhension globale de l&#39;ensemble du processus. Ici, les protocoles qui permettent l&#39;identification des facteurs de l&#39;hôte humain en utilisant à grande échelle l&#39;interférence ARN (ARNi) criblage en combinaison avec automatisée de microscopie par fluorescence à champ large et analyse d&#39;image automatisée sont présentés. La transfection inverse de siRNA de cellules HeLa On procède comme described tôt 10,11 avec des modifications mineures. Le dosage de point final couvre une grande partie du cycle de vie intracellulaire Brucella , sauf la sortie et l&#39;infection des cellules voisines. Pour caractériser davantage les résultats identifiés dans l&#39;essai de point final, un protocole modifié pour identifier les facteurs qui interviennent dans les étapes précoces de l&#39;infection est utilisée. Une souche de Brucella abortus qui exprime constitutivement la GFP est utilisée pour l&#39;essai de point d&#39; extrémité , où les bactéries sont autorisés à infecter les cellules pendant deux jours. Pendant ce temps, les bactéries pénètrent dans les cellules, le trafic à la niche réplicative dérivés d&#39;ER, et de reproduire dans l&#39;espace péri-nucléaire. Les niveaux élevés de signal GFP peuvent ensuite être utilisés pour détecter de manière fiable les cellules individuelles contiennent des bactéries qui se répliquant. Pour étudier l&#39; entrée Brucella dans un dosage à haut débit, il est important de pouvoir distinguer entre les bactéries intracellulaires et extracellulaires. La méthode présentée ici circumvents anticorps différentiel coloration des bactéries intracellulaires et extracellulaires. Il est basé sur une souche de Brucella exprimant une GFP inductible par la tetracycline en combinaison avec l&#39; expression constitutive de la DsRed. La présence d&#39;un marqueur DsRed constitutif permet l&#39;identification de toutes les bactéries présentes dans l&#39;échantillon. expression de la GFP est induite par l&#39;addition de tetracycline anhydrotétracycline analogue non toxique (ATC) en même temps que l&#39;inactivation des bactéries extracellulaires par la gentamicine (Gm). Bien que la cellule imperméable aux antibiotiques Gm tue les bactéries extracellulaires, Atc peut entrer dans la cellule hôte et induire l&#39;expression de la GFP sélectivement dans des bactéries intracellulaires. Cette double rapporteur permet la séparation solide des bactéries intracellulaires simples (GFP et DsRed signaux) provenant de bactéries extracellulaires (uniquement de signaux DsRed) en utilisant la microscopie à champ large. Afin d&#39;atteindre l&#39; expression de GFP détectable par intracellulaire Brucella nous avons constaté que 4 heures d&#39;induction par l&#39; ATC se traduit par un relisignal de mesure. Induction des systèmes similaires pour exprimer sélectivement GFP dans des bactéries intracellulaires a été utilisé auparavant pour étudier Shigella intracellulaire 12.

<table><tbody><tr><td>Gélose de soja tryptique (TSA)</td><td>BD</td><td>236950</td><td></td></tr><tr><td>Bouillon de soja tryptique (TSB)</td><td>Fluka</td><td>22092</td><td></td></tr><tr><td>Sulfate de kanamycine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60615</td><td></td></tr><tr><td>Lait</td><td></td><td></td><td></td>écrémé</tr><tr><td>250 ml Flacon à bouchon à vis</td><td>Corning</td><td>8396</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5796</td><td></td></tr><tr><td>Fœtal Sérum de veau (FCS)</td><td>Gibco</td><td>10270</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA inactivée par la chaleur (0,5 %)</td><td>Gibco</td><td>15400-054</td><td>Solution mère 10x, diluée 1:10 dans PBS</td></tr><tr><td>Scepte 2.0 Compteur de cellules</td><td>Merck Milipore</td><td>PHCC20060</td><td>Des dispositifs de comptage de cellules alternatifs peuvent être utilisés</td></tr><tr><td>Greiner CELLSTAR Plaque à 384 puits</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2062</td><td></td></tr><tr><td>Feuille d’aluminium pelable</td><td>Costar</td><td>6570</td><td></td></tr><tr><td>Distributeur de réactifs : « Multidrop 384 Reactive Dispenser"Thermo</td> <td>Scientific</td><td>5840150</td><td>Distributeur de réactifs alternatif peut être utilisé.</td></tr><tr><td>Réactif de transfection : « Lipofectamine RNAiMAX</td><td>Invitrogen</td><td>13778-150</td><td></td></tr><tr><td>Laveur de plaques automatisé : « Laveur de plaques ELx50-16"BioTek</td><td></td> <td>ELX5016</td><td>Ce laveur de plaques contient un collecteur à 16 canaux adapté aux plaques à 384 puits. Il s’insère dans une armoire de biosécurité et dispose d’un couvercle recouvrant la plaque pendant le lavage, ce qui réduit le risque de production d’aérosols. D’autres rondelles de plaques avec des caractéristiques similaires pourraient être utilisées.</td></tr><tr><td>gentamicine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1397</td><td></td></tr><tr><td>Chlorhydrate d’anhydrotétracycline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>37919</td><td>100 &#956 ; g/ml de solution dans de l’éthanol à 100 % est maintenue à -20 & ° C protégé de la lumière dans une feuille d’aluminium</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>20012</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td>Dissoudre dans 0,2 M Tampon HEPES, pH 7,4. Conserver à -20 &deg ; C et décongeler fraîchement la veille de l’utilisation. Attention, le PFA est toxique par inhalation, en contact avec la peau et en cas d’ingestion.</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Roche</td><td>10236276001</td><td></td></tr><tr><td>SiRNA brouillé</td><td>Dharmacon</td><td>D-001810-10</td><td></td></tr><tr><td>Kif11 siRNA</td><td>Dharmacon</td><td>L-003317-00</td><td></td></tr><tr><td>ARPC3 siRNA</td><td>Dharmacon</td><td>L-005284-00</td><td></td></tr><tr><td>Brucella abortus 2308</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pJC43 (apHT ::GFP)</td><td></td><td></td><td>Celli et al.12</td></tr><tr><td>pAC042.08 (apht ::d sRed, tetO ::tetR-GFP)</td><td></td><td></td><td>Construction : pJC44 4 a été digéré avec EcoRI suivi de la génération d’extrémités émoussées avec l’enzyme Klenov et d’une digestion ultérieure avec SalI. TetR-GFP a été amplifié à partir de pNF106 à l’aide des amorces prAC090 et prAC092. Après digestion avec SalI, le produit TetR-GFP a été ligaturé au vecteur pJC44 digéré.</td></tr><tr><td>Primer prAC090</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>TTT TTG AAT TCT GGC AAT TCC GAC GTC TAA GAA ACC</td></tr><tr><td>Primer prAC092</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>TTT TTG TCG ACT TTG TCC TAC TCA GGA GAG CGT</td></tr><tr><td>TC HeLa CCL-2</td><td>ATCC</td><td>CCL-2</td><td></td></tr><tr><td>ImageXpress Micro</td><td>Molecular Devices&nbsp ;</td><td>IXM IMAGING MSCOPE</td><td>Microscope d’imagerie cellulaire automatisé équipé d’une platine Z motorisée de précision. D’autres systèmes pour la microscopie automatisée et d’autres composants pour le matériel et les logiciels spécifiés ci-dessous peuvent être utilisés.</td></tr><tr>Dispositifs moléculaires <td>laser à mise au point automatique à grande vitesse</td><td>&nbsp ;</td><td>1-2300-1037</td><td></td></tr><tr><td>Objectif CFI Super Fluor 10X</td><td>Nikon·</td><td>MRF00100</td><td>N.A 0.50, L.D 1.20 mm, Prisme DIC : 10X,</td></tr><tr><td>Photométrie à ressort CoolSNAP HQ Caméra CCD monochrome</td><td>Dispositifs moléculaires</td><td>1-2300-1060</td><td>1 392 x 1 040 pixels d’imagerie, 6,45 x 6,45 et micro ; m pixels, 12 bits numérisation</td></tr><tr><td>Logiciel MetaXpress</td><td>Molecular Devices&nbsp ;</td><td>9500-0100</td><td></td></tr><tr><td>LUI-Spectra-X-7</td><td>Lumencor</td><td>SPECTRA X V-XXX-YZ</td><td>Moteur d’éclairage. Les sources lumineuses suivantes sont utilisées : violet (DAPI), cyan (GFP), vert/jaune (RFP)</td></tr><tr><td>Excitateur monobande pour DAPI</td><td>Semrock</td><td>FF01-377/50-25</td><td></td></tr><tr><td>Émetteur monobande pour DAPI</td><td>Semrock</td><td>FF02-447/60-25</td><td></td></tr><tr><td>Dichroïque monobande pour DAPI</td><td>Semrock</td><td>FF409-Di03-25x36</td><td></td></tr><tr><td>Excitateur monobande pour GFP</td><td>Semrock</td><td>FF02-472/30-25</td><td></td></tr><tr><td>Émetteur monobande pour GFP</td><td>Semrock</td><td>FF01-520/35-25</td><td></td></tr><tr><td>Dichroïque monobande pour GFP</td><td>Semrock</td><td>FF495-Di03-25x36</td><td></td></tr><tr><td>Excitateur monobande pour RFP</td><td>Semrock</td><td>FF01-562/40-25</td><td></td></tr><tr><td>Émetteur monobande pour RFP</td><td>Semrock</td><td>FF01-624/40-25</td><td></td></tr><tr><td>Dichroïque monobande pour RFP</td><td>Semrock</td><td>FF593-Di03-25x36</td><td></td></tr></tbody></table>

les analyses microscopiques de criblage à haut débit des facteurs de l&#39;hôte impliqués dans<em&gt; brucella</em&gt; l&#39;infection des cellules hela

Microscopy-based Assays for High-throughput Screening of Host Factors Involved in Brucella Infection of Hela Cells

Espèces de Brucella sont des agents pathogènes intracellulaires facultatifs qui infectent les animaux comme leurs hôtes naturels. La transmission aux humains est le plus souvent causée par un contact direct avec des animaux infectés ou par ingestion d&#39;aliments contaminés et peut conduire à des infections chroniques graves. Brucella peut envahir les cellules phagocytaires professionnels et non-professionnels et réplique au sein du réticulum endoplasmique (RE) de vacuoles -derived. Les facteurs de l&#39; hôte requis pour l&#39; entrée Brucella dans des cellules hôtes, éviter la dégradation lysosomale, et la réplication dans le compartiment ER-like demeurent largement inconnus. Nous décrivons ici deux essais pour identifier les facteurs de l&#39; hôte impliqués dans Brucella l&#39; entrée et la réplication dans les cellules HeLa. Les protocoles décrivent l&#39;utilisation de l&#39;interférence ARN, alors que les méthodes de criblage alternatives pourraient être appliquées. Les essais sont basés sur la détection de bactéries marquées par fluorescence dans les cellules hôtes marquées par fluorescence en utilisant automatiséla microscopie à champ large. Les images fluorescentes sont analysées à l&#39;aide d&#39;un pipeline d&#39;analyse d&#39;image normalisée dans CellProfiler qui permet l&#39;infection par simple pointage à base de cellules. Dans l&#39;essai de point final, la réplication intracellulaire est mesurée deux jours après l&#39;infection. Cela permet aux bactéries de trafic vers leur niche réplicative où la prolifération est lancé autour de 12 heures après l&#39; entrée bactérienne. Brucella qui ont établi avec succès une niche intracellulaire aura ainsi fortement proliféré à l&#39; intérieur des cellules hôtes. Comme les bactéries intracellulaires grandement plus nombreux que les bactéries non réplicatifs extracellulaires ou intracellulaires individuels, une souche exprimant constitutivement GFP peut être utilisé. Le signal de la GFP solide est ensuite utilisé pour identifier les cellules infectées. En revanche, pour le dosage d&#39;entrée, il est essentiel de faire la distinction entre les bactéries intracellulaires et extracellulaires. Ici, un codage de déformation pour une GFP inductible par la tétracycline est utilisée. Inductionde la GFP avec l&#39;inactivation simultanée des bactéries extracellulaires par la gentamicine permet la différenciation entre intracellulaire et extracellulaire des bactéries en fonction du signal de la GFP, seules les bactéries intracellulaires étant capable d&#39;exprimer la GFP. Ceci permet la détection des bactéries intracellulaires robuste unique avant la prolifération intracellulaire est initiée.

La figure 1A représente un exemple d&#39;analyse d&#39;image utilisé pour identifier automatiquement les cellules infectées dans l&#39;essai de point final. Les noyaux des cellules HeLa colorées avec du DAPI ont été identifiées, une péri-noyau d&#39;une largeur de 8 pixels entourant le noyau et un corps de cellule de Voronoi par extension du noyau par 25 pixels ont été calculés. Etant donné que les bactéries prolifèrent principalement dans l&#39;espace péri-nucléaire, l&...

Deux tests de dépistage à haut débit par microscopie des facteurs de l’hôte impliqués dans l’infection à Brucella sont décrits. Le test d’entrée détecte les facteurs de l’hôte nécessaires à l’entrée de Brucella et le test final ceux nécessaires à la réplication intracellulaire. Bien qu’il soit applicable à d’autres approches, le criblage de siRNA dans les cellules HeLa est utilisé pour illustrer les protocoles.

Les analyses microscopiques de Criblage à haut débit des facteurs de l&#39;hôte impliqués dans<em&gt; Brucella</em&gt; L&#39;infection des cellules HeLa

Brucella species are facultative intracellular pathogens that infect animals as their natural hosts. Transmission to humans is most commonly caused by ...

L'objectif général de ce test basé sur la microscopie à haut débit est d'identifier les facteurs de l'hôte impliqués dans l'infection des cellules HeLa par Brucella. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des interactions hôte-pathogène, telles que l'identification de protéines de l'hôte qui favorisent ou empêchent la colonisation par le pathogène intracellulaire Brucella. Le principal avantage de cette technique réside dans le fait que le flux de travail semi-automatisé, de la préparation en laboratoire jusqu'à l'analyse des images, permet l'utilisation de robots et la mise en place d'expériences à haut débit de manière efficace.Ainsi, cette méthode peut fournir des informations sur les interactions entre Brucella et l'hôte à l'aide de cribles par ARNsi. La majeure partie du protocole peut être appliquée à d'autres stratégies de criblage. Par exemple, ou aux bibliothèques d'ARNsi.Après avoir cultivé les cellules HeLa et préparé les plaques de criblage avec des siARN selon le protocole décrit dans le texte, décongeler une plaque noire de 384 puits par centrifugation à 300 × g et à température ambiante pendant 20 minutes. Préparer le milieu de transfection en utilisant du DMEM à température ambiante sans FCS. Diluer le réactif de transfection au 1/200 et mélanger soigneusement avant utilisation.À l’aide d’un distributeur de réactif, ajouter 25 microlitres de milieu de transfection dans chaque puits de la plaque 384 puits et mélanger les solutions en déplaçant la plaque d’avant en arrière. Incuber la plaque à température ambiante pendant une heure afin de permettre la formation des complexes entre le ARNi et le réactif de transfection. Pendant ce temps, préparer les cellules HeLa en aspirant le milieu de culture et en ajoutant 2,5 millilitres de trypsine 0,05 % EDTA dans du PBS pour laver une fois les cellules subconfluentes d’un flacon de 75 centimètres carrés.Ensuite, ajoutez 1,5 millilitre de trypsine fraîche et transférez le flacon à 37 degrés Celsius pendant deux à trois minutes, jusqu'à ce que les cellules deviennent arrondies. Utilisez 10 millilitres de DMEM préchauffé à 60 % de FCS pour remettre les cellules en suspension. Puis, utilisez un compteur cellulaire automatisé pour dénombrer les cellules avant de préparer une suspension cellulaire de 10 000 cellules par millilitre dans du DMEM contenant 16 % de FCS.Ajouter 50 microlitres de suspension cellulaire dans chaque puits du réactif de transfection. Cela donne un total de 500 cellules par puits. Déplacer la plaque d'avant en arrière pour répartir uniformément les cellules.Ensuite, laissez la plaque à température ambiante pendant cinq à dix minutes pour permettre aux cellules de se déposer. Scellez la plaque avec du parafilm. Incubez-la ensuite dans un incubateur humide sur une plaque d'aluminium préchauffée à 37 degrés Celsius avec 5 % de CO2 pendant 72 heures.Travailler avec l'agent pathogène de classe trois B. abortus est dangereux et les réglementations locales de biosécurité doivent être respectées, y compris le port d'une combinaison de protection, de gants protecteurs, d'un masque et de lunettes de protection. Un jour avant l'infection, inoculer la quantité préalablement déterminée de culture initiale de B. abortus dans 50 millilitres de milieu TSB KM. Dans un flacon vissable de 250 millilitres.Utilisez du parafilm pour sceller la bouteille et faites croître les bactéries toute la nuit à 37 degrés Celsius et à 100 tr/min sur un agitateur jusqu'à une densité optique à 600 de 0,8 à 1,1. Mesurez la densité optique à 600 de la culture bactérienne. Préparez ensuite le milieu d'infection en diluant la culture bactérienne dans du DMEM contenant 10 % de FCS afin d'obtenir la multiplicité d'infection souhaitée.Ou MOI. À l’aide d’un laveur de plaques automatisé, remplacer le milieu de transfection par 50 microlitres de milieu d’infection. Dans la hotte, transférer la plaque dans le porte-rotor et centrifuger la plaque de 384 puits à 400 × g et à 4 °C pendant 20 minutes.Ensuite, utiliser du film parafilm pour sceller la plaque et l'incuber sur une plaque en aluminium préchauffée à 37 degrés Celsius et 5 % CO2 pendant quatre heures. Après l'incubation, utiliser un laveur automatique de plaques, puis laver les cellules avec du DMEM contenant 10 % de FCS et 100 microgrammes par millilitre de dentrimysine ou de GM afin d'inactiver les bactéries extracellulaires. Ensuite, utiliser du film parafilm pour sceller à nouveau la plaque et la replacer sur la plaque en aluminium préchauffée dans l'incubateur pendant 40 heures supplémentaires pour le dosage final.Pour fixer les cellules, commencez par laver les puits avec du PBS. Ensuite, remplacez le PBS par 50 microlitres de PFA à 3,7 %, à pH 7,4.Et incuber les cellules à température ambiante pendant 20 minutes. Après l'incubation, utiliser 50 microlitres de PBS pour remplacer le milieu de fixation. Pour colorer les échantillons à l'aide du laveur automatique de plaques, commencer par utiliser 50 microlitres de Triton X-100 à 1 % dans du PBS pendant 10 minutes afin de perméabiliser les cellules.Après avoir lavé les cellules trois fois à l’aide de PBS, ajoutez 50 microlitres de PBS contenant un microgramme par millilitre de DAPI et incubez à température ambiante pendant 30 minutes. Ensuite, lavez les cellules trois fois au PBS avant de les protéger de la lumière. Transférez la plaque vers le microscope automatisé.Configurer les paramètres du microscope. Sélectionner l'objectif 10-X. Puis choisir le format de plaque correspondant à la plaque de 384 puits.Acquérir neuf sites par puits. Sélectionner Activer la mise au point basée sur le laser. Et, effectuer la mise au point sur le fond de la plaque et du puits.Ensuite, définissez le premier puits acquis comme puits initial pour la recherche de l'échantillon et pour tous les sites d'autofocalisation. Puis, dans le canal DAPI, réglez manuellement le décalage Z pour la mise au point. Appuyez ensuite sur Trouver l'échantillon pour régler la mise au point sur le fond du puits.À l'aide de la fonction d'exposition automatique, obtenez une bonne estimation du temps d'exposition. Corrigez manuellement le temps d'exposition pour le canal DAPI afin de garantir une large plage dynamique avec une faible sur-exposition. Utilisez ce temps d'exposition pour acquérir des images de plusieurs sites répartis sur toute la plaque.Et ajustez manuellement le temps d'exposition jusqu'à ce que les pixels les plus brillants atteignent environ 80 % de la luminosité maximale sur les sites. Répétez les étapes pour régler la mise au point et le temps d'exposition, respectivement pour tous les autres canaux. Ensuite, démarrez l'acquisition de la plaque complète.Pour le test en point final, utilisez les canaux DAPI et GFP pour imager la plaque entière. Pour effectuer une analyse d'image sur les cellules marquées dans le test en point final, après avoir calculé un modèle d'ombrage, sélectionnez dans les paramètres de sortie affichés le dossier d'entrée contenant les images et un dossier de sortie destiné aux résultats. Ensuite, définissez le texte commun aux images, puis chargez les modèles d'ombrage.Cliquez sur Démarrer le mode test et assurez-vous que la pause et les paramètres d'affichage pour tous les modules sont désactivés. Activez la pause et le paramètre d'affichage pour le module neuf ImageMath. Le symbole de pause activé apparaîtra en jaune.La fonction d'affichage activée apparaîtra sous forme d'un œil ouvert. Ensuite, cliquez sur Exécuter pour lancer l'analyse jusqu'au module neuf. Dans le module neuf, ajustez le paramètre multiplier la deuxième image par une valeur qui permet de supprimer le signal DAPI dans Brucella sans affecter celui des noyaux.Pour tester les valeurs du module, appuyez sur Étape. Cliquez avec le bouton droit sur l'image nouvellement ouverte et réglez le contraste de l'image sur logarithmique normalisé. Revenez plusieurs fois en arrière jusqu'au module neuf.Ajustez le paramètre de multiplication de la deuxième image et parcourez à nouveau le module jusqu'à ce que le signal de Brucella soit complètement supprimé, tout en minimisant simultanément les zones noires indiquant une soustraction excessive. La recherche de bons paramètres pour certains modules nécessite une optimisation progressive des paramètres. Il est essentiel de parcourir plusieurs fois les modules, d'essayer différentes valeurs et d'observer leur effet sur le résultat affiché.Activer la pause et l'affichage pour le module 10. Identifier les objets primaires. Régler la limite inférieure du seuil suffisamment élevée pour que les noyaux soient segmentés et que le fond soit ignoré.Pour identifier une bonne valeur de pas, survolez le module, puis cliquez avec le bouton droit sur l'image d'entrée et affichez l'histogramme, dont le pic indique généralement le fond. À partir de l'intensité du fond, augmentez le paramètre jusqu'à obtenir une segmentation satisfaisante des noyaux, comme illustré sur l'image de sortie. L'objectif du pipeline d'analyse d'image est d'identifier les cellules contenant des bactéries en cours de réplication.Cela est obtenu en définissant des seuils différents pour le signal du pathogène dans le noyau, le péri-noyau et le corps cellulaire de Voronoi. Activez la pause et l'affichage pour le module 15. Filtrez les objets, comme indiqué précédemment, puis appuyez sur Exécuter.Définissez la valeur minimale du paramètre suffisamment élevée pour que seules les cellules présentant une Brucella clairement visible dans le noyau soient conservées, tandis que toutes les autres sont éliminées par filtrage. Pour déterminer une valeur appropriée, parcourez le module et affichez l'image en sortie. Augmentez progressivement la valeur jusqu'à ce que seules les cellules avec une Brucella clairement visible au niveau du noyau soient conservées.Après avoir filtré les cellules contenant des bactéries dans la région péri-nucléaire et le corps cellulaire de Voronoi dans les modules 16 et 17 conformément au protocole décrit, quittez le mode test et décochez tous les symboles d'œil situés à côté des modules afin de vous assurer qu'aucun module n'affiche son résultat avant l'exécution de l'analyse complète. Enfin, cliquez sur Analyser les images pour démarrer l'analyse. Une fois l'analyse terminée, examinez les images PNG résultantes ainsi que le tableau CSV pour vérifier que l'analyse a fonctionné de manière fiable sur l'ensemble de la plaque.Réalisez le test d'entrée et l'évaluation de l'infection conformément au protocole écrit. Cette figure montre un exemple d'analyse d'image utilisé pour identifier automatiquement les cellules infectées dans le test de point final. Les noyaux des cellules HeLa marqués au DAPI ont été identifiés.Un péry-noyau d'une largeur de huit pixels entourant le noyau, ainsi qu'un corps de cellule de Voronoi obtenu par extension du noyau de 25 pixels, ont été calculés. Une cellule était considérée comme infectée si le signal du pathogène dépassait le seuil correspondant dans au moins un compartiment.Brucella nécessite des réarrangements de l'actine pour une interaction réussie avec les cellules hôtes. Ainsi, l'épuisement de ARP23 constitue un contrôle positif approprié pour le criblage par ARNsi. L'épuisement de ARPC3 a réduit le nombre de cellules contenant des bactéries en prolifération deux jours après l'infection.Par rapport aux cellules contrôles traitées avec une séquence désordonnée. L'analyse automatisée des images a quantifié une diminution de l'infection chez les cellules HeLa appauvries en ARPC3 par rapport aux cellules contrôles sur ce graphique. L'appauvrissement en ARPC3 a également révélé une réduction de l'infection par Brucella dans le test d'entrée par rapport aux cellules contrôles.Comme on le voit par le nombre réduit de Brucella intracellulaires représentées en jaune. Enfin, la quantification de l'infection par analyse automatisée d'images a confirmé que le nombre de cellules infectées ainsi que le nombre de bactéries intracellulaires dans les cellules infectées étaient réduits suite à l'épuisement d'ARPC3. Une fois maîtrisé, ce protocole peut fournir des résultats d'analyse d'images dans un délai d'une semaine et demie après le début de l'expérience.Lors de la réalisation de cette procédure, il est important d'examiner attentivement les résultats de l'analyse d'image afin de s'assurer que les paramètres choisis fonctionnent correctement sur l'ensemble de la plaque. Après cette procédure, d'autres méthodes, comme l'imagerie de cellules vivantes, peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires. Par exemple, lorsque vous étudiez le trafic intracellulaire, un facteur hôte particulier interagit-il avec Brucella ?Ou comment l'épuisement d'un gène affecte la dynamique intracellulaire de l'infection. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la biologie des infections pour explorer les facteurs de l'hôte nécessaires à l'infection par Brucella dans un test sur cellules HeLa. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment identifier les facteurs de l'hôte qui favorisent ou empêchent la colonisation réussie des cellules HeLa par le pathogène intracellulaire Brucella abortus.N'oubliez pas que le travail avec Brucella abortus peut être extrêmement dangereux et que les réglementations locales en matière de biosécurité doivent être strictement respectées.

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Recherche

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

Source : Casanova, A., et al. Essais basés sur la microscopie pour le criblage à haut débit des facteurs de l’hôte impliqués dans l’infection par Brucella des cellules hela. J. Vis. Exp. (2016)Cette vidéo démontre l’imagerie à haut débit de l’infection par Brucella abortus dans les cellules épithéliales avec un knockdown STING médié par le SIRNA afin d’étudier le rôle de la détection de l’ADN cytosolique dans la réplication bactérienne intracellulaire et la réponse immunitaire innée de l’hôte.

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High Throughput, en temps réel, à double lecture Test de intracellulaires activité antimicrobienne et eucaryotes cytotoxicité cellulaire

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