Les analyses microscopiques de Criblage à haut débit des facteurs de l'hôte impliqués dans

L'objectif général de ce test basé sur la microscopie à haut débit est d'identifier les facteurs de l'hôte impliqués dans l'infection des cellules HeLa par Brucella. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des interactions hôte-pathogène, telles que l'identification de protéines de l'hôte qui favorisent ou empêchent la colonisation par le pathogène intracellulaire Brucella. Le principal avantage de cette technique réside dans le fait que le flux de travail semi-automatisé, de la préparation en laboratoire jusqu'à l'analyse des images, permet l'utilisation de robots et la mise en place d'expériences à haut débit de manière efficace.

Ainsi, cette méthode peut fournir des informations sur les interactions entre Brucella et l'hôte à l'aide de cribles par ARNsi. La majeure partie du protocole peut être appliquée à d'autres stratégies de criblage. Par exemple, ou aux bibliothèques d'ARNsi.

Après avoir cultivé les cellules HeLa et préparé les plaques de criblage avec des siARN selon le protocole décrit dans le texte, décongeler une plaque noire de 384 puits par centrifugation à 300 × g et à température ambiante pendant 20 minutes. Préparer le milieu de transfection en utilisant du DMEM à température ambiante sans FCS. Diluer le réactif de transfection au 1/200 et mélanger soigneusement avant utilisation.

À l’aide d’un distributeur de réactif, ajouter 25 microlitres de milieu de transfection dans chaque puits de la plaque 384 puits et mélanger les solutions en déplaçant la plaque d’avant en arrière. Incuber la plaque à température ambiante pendant une heure afin de permettre la formation des complexes entre le ARNi et le réactif de transfection. Pendant ce temps, préparer les cellules HeLa en aspirant le milieu de culture et en ajoutant 2,5 millilitres de trypsine 0,05 % EDTA dans du PBS pour laver une fois les cellules subconfluentes d’un flacon de 75 centimètres carrés.

Ensuite, ajoutez 1,5 millilitre de trypsine fraîche et transférez le flacon à 37 degrés Celsius pendant deux à trois minutes, jusqu'à ce que les cellules deviennent arrondies. Utilisez 10 millilitres de DMEM préchauffé à 60 % de FCS pour remettre les cellules en suspension. Puis, utilisez un compteur cellulaire automatisé pour dénombrer les cellules avant de préparer une suspension cellulaire de 10 000 cellules par millilitre dans du DMEM contenant 16 % de FCS.

Ajouter 50 microlitres de suspension cellulaire dans chaque puits du réactif de transfection. Cela donne un total de 500 cellules par puits. Déplacer la plaque d'avant en arrière pour répartir uniformément les cellules.

Ensuite, laissez la plaque à température ambiante pendant cinq à dix minutes pour permettre aux cellules de se déposer. Scellez la plaque avec du parafilm. Incubez-la ensuite dans un incubateur humide sur une plaque d'aluminium préchauffée à 37 degrés Celsius avec 5 % de CO2 pendant 72 heures.

Travailler avec l'agent pathogène de classe trois B. abortus est dangereux et les réglementations locales de biosécurité doivent être respectées, y compris le port d'une combinaison de protection, de gants protecteurs, d'un masque et de lunettes de protection. Un jour avant l'infection, inoculer la quantité préalablement déterminée de culture initiale de B. abortus dans 50 millilitres de milieu TSB KM. Dans un flacon vissable de 250 millilitres.

Utilisez du parafilm pour sceller la bouteille et faites croître les bactéries toute la nuit à 37 degrés Celsius et à 100 tr/min sur un agitateur jusqu'à une densité optique à 600 de 0,8 à 1,1. Mesurez la densité optique à 600 de la culture bactérienne. Préparez ensuite le milieu d'infection en diluant la culture bactérienne dans du DMEM contenant 10 % de FCS afin d'obtenir la multiplicité d'infection souhaitée.

Ou MOI. À l’aide d’un laveur de plaques automatisé, remplacer le milieu de transfection par 50 microlitres de milieu d’infection. Dans la hotte, transférer la plaque dans le porte-rotor et centrifuger la plaque de 384 puits à 400 × g et à 4 °C pendant 20 minutes.

Ensuite, utiliser du film parafilm pour sceller la plaque et l'incuber sur une plaque en aluminium préchauffée à 37 degrés Celsius et 5 % CO2 pendant quatre heures. Après l'incubation, utiliser un laveur automatique de plaques, puis laver les cellules avec du DMEM contenant 10 % de FCS et 100 microgrammes par millilitre de dentrimysine ou de GM afin d'inactiver les bactéries extracellulaires. Ensuite, utiliser du film parafilm pour sceller à nouveau la plaque et la replacer sur la plaque en aluminium préchauffée dans l'incubateur pendant 40 heures supplémentaires pour le dosage final.

Pour fixer les cellules, commencez par laver les puits avec du PBS. Ensuite, remplacez le PBS par 50 microlitres de PFA à 3,7 %, à pH 7,4.

Et incuber les cellules à température ambiante pendant 20 minutes. Après l'incubation, utiliser 50 microlitres de PBS pour remplacer le milieu de fixation. Pour colorer les échantillons à l'aide du laveur automatique de plaques, commencer par utiliser 50 microlitres de Triton X-100 à 1 % dans du PBS pendant 10 minutes afin de perméabiliser les cellules.

Après avoir lavé les cellules trois fois à l’aide de PBS, ajoutez 50 microlitres de PBS contenant un microgramme par millilitre de DAPI et incubez à température ambiante pendant 30 minutes. Ensuite, lavez les cellules trois fois au PBS avant de les protéger de la lumière. Transférez la plaque vers le microscope automatisé.

Configurer les paramètres du microscope. Sélectionner l'objectif 10-X. Puis choisir le format de plaque correspondant à la plaque de 384 puits.

Acquérir neuf sites par puits. Sélectionner Activer la mise au point basée sur le laser. Et, effectuer la mise au point sur le fond de la plaque et du puits.

Ensuite, définissez le premier puits acquis comme puits initial pour la recherche de l'échantillon et pour tous les sites d'autofocalisation. Puis, dans le canal DAPI, réglez manuellement le décalage Z pour la mise au point. Appuyez ensuite sur Trouver l'échantillon pour régler la mise au point sur le fond du puits.

À l'aide de la fonction d'exposition automatique, obtenez une bonne estimation du temps d'exposition. Corrigez manuellement le temps d'exposition pour le canal DAPI afin de garantir une large plage dynamique avec une faible sur-exposition. Utilisez ce temps d'exposition pour acquérir des images de plusieurs sites répartis sur toute la plaque.

Et ajustez manuellement le temps d'exposition jusqu'à ce que les pixels les plus brillants atteignent environ 80 % de la luminosité maximale sur les sites. Répétez les étapes pour régler la mise au point et le temps d'exposition, respectivement pour tous les autres canaux. Ensuite, démarrez l'acquisition de la plaque complète.

Pour le test en point final, utilisez les canaux DAPI et GFP pour imager la plaque entière. Pour effectuer une analyse d'image sur les cellules marquées dans le test en point final, après avoir calculé un modèle d'ombrage, sélectionnez dans les paramètres de sortie affichés le dossier d'entrée contenant les images et un dossier de sortie destiné aux résultats. Ensuite, définissez le texte commun aux images, puis chargez les modèles d'ombrage.

Cliquez sur Démarrer le mode test et assurez-vous que la pause et les paramètres d'affichage pour tous les modules sont désactivés. Activez la pause et le paramètre d'affichage pour le module neuf ImageMath. Le symbole de pause activé apparaîtra en jaune.

La fonction d'affichage activée apparaîtra sous forme d'un œil ouvert. Ensuite, cliquez sur Exécuter pour lancer l'analyse jusqu'au module neuf. Dans le module neuf, ajustez le paramètre multiplier la deuxième image par une valeur qui permet de supprimer le signal DAPI dans Brucella sans affecter celui des noyaux.

Pour tester les valeurs du module, appuyez sur Étape. Cliquez avec le bouton droit sur l'image nouvellement ouverte et réglez le contraste de l'image sur logarithmique normalisé. Revenez plusieurs fois en arrière jusqu'au module neuf.

Ajustez le paramètre de multiplication de la deuxième image et parcourez à nouveau le module jusqu'à ce que le signal de Brucella soit complètement supprimé, tout en minimisant simultanément les zones noires indiquant une soustraction excessive. La recherche de bons paramètres pour certains modules nécessite une optimisation progressive des paramètres. Il est essentiel de parcourir plusieurs fois les modules, d'essayer différentes valeurs et d'observer leur effet sur le résultat affiché.

Activer la pause et l'affichage pour le module 10. Identifier les objets primaires. Régler la limite inférieure du seuil suffisamment élevée pour que les noyaux soient segmentés et que le fond soit ignoré.

Pour identifier une bonne valeur de pas, survolez le module, puis cliquez avec le bouton droit sur l'image d'entrée et affichez l'histogramme, dont le pic indique généralement le fond. À partir de l'intensité du fond, augmentez le paramètre jusqu'à obtenir une segmentation satisfaisante des noyaux, comme illustré sur l'image de sortie. L'objectif du pipeline d'analyse d'image est d'identifier les cellules contenant des bactéries en cours de réplication.

Cela est obtenu en définissant des seuils différents pour le signal du pathogène dans le noyau, le péri-noyau et le corps cellulaire de Voronoi. Activez la pause et l'affichage pour le module 15. Filtrez les objets, comme indiqué précédemment, puis appuyez sur Exécuter.

Définissez la valeur minimale du paramètre suffisamment élevée pour que seules les cellules présentant une Brucella clairement visible dans le noyau soient conservées, tandis que toutes les autres sont éliminées par filtrage. Pour déterminer une valeur appropriée, parcourez le module et affichez l'image en sortie. Augmentez progressivement la valeur jusqu'à ce que seules les cellules avec une Brucella clairement visible au niveau du noyau soient conservées.

Après avoir filtré les cellules contenant des bactéries dans la région péri-nucléaire et le corps cellulaire de Voronoi dans les modules 16 et 17 conformément au protocole décrit, quittez le mode test et décochez tous les symboles d'œil situés à côté des modules afin de vous assurer qu'aucun module n'affiche son résultat avant l'exécution de l'analyse complète. Enfin, cliquez sur Analyser les images pour démarrer l'analyse. Une fois l'analyse terminée, examinez les images PNG résultantes ainsi que le tableau CSV pour vérifier que l'analyse a fonctionné de manière fiable sur l'ensemble de la plaque.

Réalisez le test d'entrée et l'évaluation de l'infection conformément au protocole écrit. Cette figure montre un exemple d'analyse d'image utilisé pour identifier automatiquement les cellules infectées dans le test de point final. Les noyaux des cellules HeLa marqués au DAPI ont été identifiés.

Un péry-noyau d'une largeur de huit pixels entourant le noyau, ainsi qu'un corps de cellule de Voronoi obtenu par extension du noyau de 25 pixels, ont été calculés. Une cellule était considérée comme infectée si le signal du pathogène dépassait le seuil correspondant dans au moins un compartiment.

Brucella nécessite des réarrangements de l'actine pour une interaction réussie avec les cellules hôtes. Ainsi, l'épuisement de ARP23 constitue un contrôle positif approprié pour le criblage par ARNsi. L'épuisement de ARPC3 a réduit le nombre de cellules contenant des bactéries en prolifération deux jours après l'infection.

Par rapport aux cellules contrôles traitées avec une séquence désordonnée. L'analyse automatisée des images a quantifié une diminution de l'infection chez les cellules HeLa appauvries en ARPC3 par rapport aux cellules contrôles sur ce graphique. L'appauvrissement en ARPC3 a également révélé une réduction de l'infection par Brucella dans le test d'entrée par rapport aux cellules contrôles.

Comme on le voit par le nombre réduit de Brucella intracellulaires représentées en jaune. Enfin, la quantification de l'infection par analyse automatisée d'images a confirmé que le nombre de cellules infectées ainsi que le nombre de bactéries intracellulaires dans les cellules infectées étaient réduits suite à l'épuisement d'ARPC3. Une fois maîtrisé, ce protocole peut fournir des résultats d'analyse d'images dans un délai d'une semaine et demie après le début de l'expérience.

Lors de la réalisation de cette procédure, il est important d'examiner attentivement les résultats de l'analyse d'image afin de s'assurer que les paramètres choisis fonctionnent correctement sur l'ensemble de la plaque. Après cette procédure, d'autres méthodes, comme l'imagerie de cellules vivantes, peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires. Par exemple, lorsque vous étudiez le trafic intracellulaire, un facteur hôte particulier interagit-il avec Brucella ?

Ou comment l'épuisement d'un gène affecte la dynamique intracellulaire de l'infection. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la biologie des infections pour explorer les facteurs de l'hôte nécessaires à l'infection par Brucella dans un test sur cellules HeLa. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment identifier les facteurs de l'hôte qui favorisent ou empêchent la colonisation réussie des cellules HeLa par le pathogène intracellulaire Brucella abortus.

N'oubliez pas que le travail avec Brucella abortus peut être extrêmement dangereux et que les réglementations locales en matière de biosécurité doivent être strictement respectées.