Name: Les analyses microscopiques de Criblage à haut débit des facteurs de lhôte impliqués dans Brucella Linfection des cellules HeLa (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 29 s
Description: Apprenez un criblage à haut débit par microscopie pour identifier les facteurs de l'hôte impliqués dans l'infection de cellules HeLa par Brucella. Cette méthode utilise des écrans siRNA et une analyse d'images automatisée.

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Ce travail a été soutenu par les subventions 51RT 0_126008 et 51RTP0_151029 pour le projet de recherche et de développement technologique (RTD) InfectX et TargetInfectX, respectivement, dans le cadre de SystemsX.ch, l’Initiative suisse pour la biologie des systèmes. Nous reconnaissons les subventions 310030B_149886 du Fonds national suisse de la recherche scientifique (FNS). Les travaux de S.H.L et A.C. ont été soutenus par le programme international de doctorat « Fellowships for Excellence » du Biozentrum. Simone Muntwiler est récompensée pour son assistance technique. Nous tenons à remercier Dirk Bumann pour la fourniture du pNF106 et Jean Celli pour le pJC43 et le pJC44.

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<li>Kuhbacher, A., Gouin, E., Cossart, P., Pizarro-Cerda, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+InlC+secretion+to+investigate+cellular+infection+by+the+bacterial+pathogen+Listeria+monocytogenes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Imaging InlC secretion to investigate cellular infection by the bacterial pathogen Listeria monocytogenes.</a> J Vis Exp. , e51043(2013).</li>
<li>Kentner, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shigella+reroutes+host+cell+central+metabolism+to+obtain+high-flux+nutrient+supply+for+vigorous+intracellular+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Shigella reroutes host cell central metabolism to obtain high-flux nutrient supply for vigorous intracellular growth.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 9929-9934 (2014).</li>
<li>Celli, J., Salcedo, S. P., Gorvel, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brucella+coopts+the+small+GTPase+Sar1+for+intracellular+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Brucella coopts the small GTPase Sar1 for intracellular replication.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 1673-1678 (2005).</li>
<li>von Bargen, K., Gorvel, J. P., Salcedo, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Internal+affairs%3A+investigating+the+Brucella+intracellular+lifestyle%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+microbiology+reviews%22%5BJournal%5D)">Internal affairs: investigating the Brucella intracellular lifestyle.</a> FEMS microbiology reviews. 36, 533-562 (2012).</li>
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</ol>

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Les pathogènes bactériens ont développé de nombreuses stratégies pour manipuler les cellules hôtes eucaryotes à leur avantage. Les agents pathogènes à l’origine d’infections aiguës présentent souvent une prolifération rapide qui s’accompagne d’une alarme importante du système immunitaire et d’une perte de viabilité des cellules infectées. En revanche, Brucella et d’autres agents pathogènes qui causent des infections chroniques parviennent à établir des interactions durables au sein des cellules hôtes. Par conséq...

Espèces de Brucella sont, les agents pathogènes intracellulaires facultatifs Gram négatif appartenant à la classe des α-protéobactéries. Ils provoquent des avortements et l&#39;infertilité chez leurs hôtes naturels tels que les bovins, les chèvres, les moutons ou entraînant des pertes économiques sévères dans les zones endémiques. La brucellose est l&#39; une des maladies zoonotiques les plus importants dans le monde entier causant plus d&#39; un demi - million de nouvelles infections humaines par an 1. La transmission à l&#39;homme est le plus souvent causée par un contact direct avec des animaux infectés ou par ingestion d&#39;aliments contaminés tels que le lait non pasteurisé. Les symptômes de la maladie fébrile sont non spécifiques, ce qui provoque des difficultés pour le diagnostic de la brucellose. Si non traitée, les patients peuvent développer une infection chronique avec des symptômes plus graves tels que l&#39; arthrite, l&#39; endocardite et la neuropathie 2. Au niveau cellulaire Brucella est capable d&#39;envahir les cellules phagocytaires et non phagocytaires et reproduit dans un intracellulairecompartiment connu sous le nom de la vacuole Brucella (BCV). Internalisation des bactéries nécessite des réarrangements du cytosquelette d&#39;actine par Rac, Rho, et l&#39; activation directe de Cdc42 3. A l&#39; intérieur de la cellule hôte eucaryote, la BCV trafique le long de la voie endocytique et en dépit de l&#39;interaction avec les lysosomes, les bactéries parviennent à éviter une dégradation 4. L&#39; acidification de la BCV par le vésiculaire ATPase est nécessaire pour induire l&#39;expression du système IV de sécrétion de type bactérien (T4SS) 5. On croit que les effecteurs bactériennes sécrétées par le T4SS sont essentiels pour Brucella pour établir son créneau réplicative, depuis la suppression de la T4SS 6 ou l&#39; inhibition de l&#39;ATPase plomb vésiculaire à des défauts dans la mise en place de la niche intracellulaire 7. Les bactéries ne se répliquent pas pendant la phase de la traite jusqu&#39;à ce qu&#39;ils parvenir à un compartiment vacuolaire ER dérivé 8. Une fois la prolifération intracellulaire se produit, la BCV se trouve dans classociation OSE avec des marqueurs tels que l&#39; ER calnexine et le glucose-6-phosphatase 6. Les mécanismes moléculaires par lesquels Brucella pénètre dans les cellules, évite la dégradation lysosomale, et enfin se réplique dans un compartiment ER-like demeurent largement inconnus. Les facteurs de l&#39; hôte impliqués dans différentes étapes de l&#39; infection ont principalement été identifiés par des approches ciblées ou un écran à petite échelle petits ARN interférents (siRNA) effectuée dans les cellules de drosophile 9. Ceux - ci ont mis en lumière la contribution des facteurs d&#39;accueil individuels au cours de l&#39; infection à Brucella , mais nous sommes encore loin d&#39;une compréhension globale de l&#39;ensemble du processus. Ici, les protocoles qui permettent l&#39;identification des facteurs de l&#39;hôte humain en utilisant à grande échelle l&#39;interférence ARN (ARNi) criblage en combinaison avec automatisée de microscopie par fluorescence à champ large et analyse d&#39;image automatisée sont présentés. La transfection inverse de siRNA de cellules HeLa On procède comme described tôt 10,11 avec des modifications mineures. Le dosage de point final couvre une grande partie du cycle de vie intracellulaire Brucella , sauf la sortie et l&#39;infection des cellules voisines. Pour caractériser davantage les résultats identifiés dans l&#39;essai de point final, un protocole modifié pour identifier les facteurs qui interviennent dans les étapes précoces de l&#39;infection est utilisée. Une souche de Brucella abortus qui exprime constitutivement la GFP est utilisée pour l&#39;essai de point d&#39; extrémité , où les bactéries sont autorisés à infecter les cellules pendant deux jours. Pendant ce temps, les bactéries pénètrent dans les cellules, le trafic à la niche réplicative dérivés d&#39;ER, et de reproduire dans l&#39;espace péri-nucléaire. Les niveaux élevés de signal GFP peuvent ensuite être utilisés pour détecter de manière fiable les cellules individuelles contiennent des bactéries qui se répliquant. Pour étudier l&#39; entrée Brucella dans un dosage à haut débit, il est important de pouvoir distinguer entre les bactéries intracellulaires et extracellulaires. La méthode présentée ici circumvents anticorps différentiel coloration des bactéries intracellulaires et extracellulaires. Il est basé sur une souche de Brucella exprimant une GFP inductible par la tetracycline en combinaison avec l&#39; expression constitutive de la DsRed. La présence d&#39;un marqueur DsRed constitutif permet l&#39;identification de toutes les bactéries présentes dans l&#39;échantillon. expression de la GFP est induite par l&#39;addition de tetracycline anhydrotétracycline analogue non toxique (ATC) en même temps que l&#39;inactivation des bactéries extracellulaires par la gentamicine (Gm). Bien que la cellule imperméable aux antibiotiques Gm tue les bactéries extracellulaires, Atc peut entrer dans la cellule hôte et induire l&#39;expression de la GFP sélectivement dans des bactéries intracellulaires. Cette double rapporteur permet la séparation solide des bactéries intracellulaires simples (GFP et DsRed signaux) provenant de bactéries extracellulaires (uniquement de signaux DsRed) en utilisant la microscopie à champ large. Afin d&#39;atteindre l&#39; expression de GFP détectable par intracellulaire Brucella nous avons constaté que 4 heures d&#39;induction par l&#39; ATC se traduit par un relisignal de mesure. Induction des systèmes similaires pour exprimer sélectivement GFP dans des bactéries intracellulaires a été utilisé auparavant pour étudier Shigella intracellulaire 12.

<table><tbody><tr><td>Gélose de soja tryptique (TSA)</td><td>BD</td><td>236950</td><td></td></tr><tr><td>Bouillon de soja tryptique (TSB)</td><td>Fluka</td><td>22092</td><td></td></tr><tr><td>Sulfate de kanamycine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60615</td><td></td></tr><tr><td>Lait</td><td></td><td></td><td></td>écrémé</tr><tr><td>250 ml Flacon à bouchon à vis</td><td>Corning</td><td>8396</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5796</td><td></td></tr><tr><td>Fœtal Sérum de veau (FCS)</td><td>Gibco</td><td>10270</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA inactivée par la chaleur (0,5 %)</td><td>Gibco</td><td>15400-054</td><td>Solution mère 10x, diluée 1:10 dans PBS</td></tr><tr><td>Scepte 2.0 Compteur de cellules</td><td>Merck Milipore</td><td>PHCC20060</td><td>Des dispositifs de comptage de cellules alternatifs peuvent être utilisés</td></tr><tr><td>Greiner CELLSTAR Plaque à 384 puits</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2062</td><td></td></tr><tr><td>Feuille d’aluminium pelable</td><td>Costar</td><td>6570</td><td></td></tr><tr><td>Distributeur de réactifs : « Multidrop 384 Reactive Dispenser"Thermo</td> <td>Scientific</td><td>5840150</td><td>Distributeur de réactifs alternatif peut être utilisé.</td></tr><tr><td>Réactif de transfection : « Lipofectamine RNAiMAX</td><td>Invitrogen</td><td>13778-150</td><td></td></tr><tr><td>Laveur de plaques automatisé : « Laveur de plaques ELx50-16"BioTek</td><td></td> <td>ELX5016</td><td>Ce laveur de plaques contient un collecteur à 16 canaux adapté aux plaques à 384 puits. Il s’insère dans une armoire de biosécurité et dispose d’un couvercle recouvrant la plaque pendant le lavage, ce qui réduit le risque de production d’aérosols. D’autres rondelles de plaques avec des caractéristiques similaires pourraient être utilisées.</td></tr><tr><td>gentamicine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1397</td><td></td></tr><tr><td>Chlorhydrate d’anhydrotétracycline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>37919</td><td>100 &#956 ; g/ml de solution dans de l’éthanol à 100 % est maintenue à -20 & ° C protégé de la lumière dans une feuille d’aluminium</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>20012</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td>Dissoudre dans 0,2 M Tampon HEPES, pH 7,4. Conserver à -20 &deg ; C et décongeler fraîchement la veille de l’utilisation. Attention, le PFA est toxique par inhalation, en contact avec la peau et en cas d’ingestion.</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Roche</td><td>10236276001</td><td></td></tr><tr><td>SiRNA brouillé</td><td>Dharmacon</td><td>D-001810-10</td><td></td></tr><tr><td>Kif11 siRNA</td><td>Dharmacon</td><td>L-003317-00</td><td></td></tr><tr><td>ARPC3 siRNA</td><td>Dharmacon</td><td>L-005284-00</td><td></td></tr><tr><td>Brucella abortus 2308</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pJC43 (apHT ::GFP)</td><td></td><td></td><td>Celli et al.12</td></tr><tr><td>pAC042.08 (apht ::d sRed, tetO ::tetR-GFP)</td><td></td><td></td><td>Construction : pJC44 4 a été digéré avec EcoRI suivi de la génération d’extrémités émoussées avec l’enzyme Klenov et d’une digestion ultérieure avec SalI. TetR-GFP a été amplifié à partir de pNF106 à l’aide des amorces prAC090 et prAC092. Après digestion avec SalI, le produit TetR-GFP a été ligaturé au vecteur pJC44 digéré.</td></tr><tr><td>Primer prAC090</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>TTT TTG AAT TCT GGC AAT TCC GAC GTC TAA GAA ACC</td></tr><tr><td>Primer prAC092</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>TTT TTG TCG ACT TTG TCC TAC TCA GGA GAG CGT</td></tr><tr><td>TC HeLa CCL-2</td><td>ATCC</td><td>CCL-2</td><td></td></tr><tr><td>ImageXpress Micro</td><td>Molecular Devices&nbsp ;</td><td>IXM IMAGING MSCOPE</td><td>Microscope d’imagerie cellulaire automatisé équipé d’une platine Z motorisée de précision. D’autres systèmes pour la microscopie automatisée et d’autres composants pour le matériel et les logiciels spécifiés ci-dessous peuvent être utilisés.</td></tr><tr>Dispositifs moléculaires <td>laser à mise au point automatique à grande vitesse</td><td>&nbsp ;</td><td>1-2300-1037</td><td></td></tr><tr><td>Objectif CFI Super Fluor 10X</td><td>Nikon·</td><td>MRF00100</td><td>N.A 0.50, L.D 1.20 mm, Prisme DIC : 10X,</td></tr><tr><td>Photométrie à ressort CoolSNAP HQ Caméra CCD monochrome</td><td>Dispositifs moléculaires</td><td>1-2300-1060</td><td>1 392 x 1 040 pixels d’imagerie, 6,45 x 6,45 et micro ; m pixels, 12 bits numérisation</td></tr><tr><td>Logiciel MetaXpress</td><td>Molecular Devices&nbsp ;</td><td>9500-0100</td><td></td></tr><tr><td>LUI-Spectra-X-7</td><td>Lumencor</td><td>SPECTRA X V-XXX-YZ</td><td>Moteur d’éclairage. Les sources lumineuses suivantes sont utilisées : violet (DAPI), cyan (GFP), vert/jaune (RFP)</td></tr><tr><td>Excitateur monobande pour DAPI</td><td>Semrock</td><td>FF01-377/50-25</td><td></td></tr><tr><td>Émetteur monobande pour DAPI</td><td>Semrock</td><td>FF02-447/60-25</td><td></td></tr><tr><td>Dichroïque monobande pour DAPI</td><td>Semrock</td><td>FF409-Di03-25x36</td><td></td></tr><tr><td>Excitateur monobande pour GFP</td><td>Semrock</td><td>FF02-472/30-25</td><td></td></tr><tr><td>Émetteur monobande pour GFP</td><td>Semrock</td><td>FF01-520/35-25</td><td></td></tr><tr><td>Dichroïque monobande pour GFP</td><td>Semrock</td><td>FF495-Di03-25x36</td><td></td></tr><tr><td>Excitateur monobande pour RFP</td><td>Semrock</td><td>FF01-562/40-25</td><td></td></tr><tr><td>Émetteur monobande pour RFP</td><td>Semrock</td><td>FF01-624/40-25</td><td></td></tr><tr><td>Dichroïque monobande pour RFP</td><td>Semrock</td><td>FF593-Di03-25x36</td><td></td></tr></tbody></table>

les analyses microscopiques de criblage à haut débit des facteurs de l&#39;hôte impliqués dans<em&gt; brucella</em&gt; l&#39;infection des cellules hela

Microscopy-based Assays for High-throughput Screening of Host Factors Involved in Brucella Infection of Hela Cells

Espèces de Brucella sont des agents pathogènes intracellulaires facultatifs qui infectent les animaux comme leurs hôtes naturels. La transmission aux humains est le plus souvent causée par un contact direct avec des animaux infectés ou par ingestion d&#39;aliments contaminés et peut conduire à des infections chroniques graves. Brucella peut envahir les cellules phagocytaires professionnels et non-professionnels et réplique au sein du réticulum endoplasmique (RE) de vacuoles -derived. Les facteurs de l&#39; hôte requis pour l&#39; entrée Brucella dans des cellules hôtes, éviter la dégradation lysosomale, et la réplication dans le compartiment ER-like demeurent largement inconnus. Nous décrivons ici deux essais pour identifier les facteurs de l&#39; hôte impliqués dans Brucella l&#39; entrée et la réplication dans les cellules HeLa. Les protocoles décrivent l&#39;utilisation de l&#39;interférence ARN, alors que les méthodes de criblage alternatives pourraient être appliquées. Les essais sont basés sur la détection de bactéries marquées par fluorescence dans les cellules hôtes marquées par fluorescence en utilisant automatiséla microscopie à champ large. Les images fluorescentes sont analysées à l&#39;aide d&#39;un pipeline d&#39;analyse d&#39;image normalisée dans CellProfiler qui permet l&#39;infection par simple pointage à base de cellules. Dans l&#39;essai de point final, la réplication intracellulaire est mesurée deux jours après l&#39;infection. Cela permet aux bactéries de trafic vers leur niche réplicative où la prolifération est lancé autour de 12 heures après l&#39; entrée bactérienne. Brucella qui ont établi avec succès une niche intracellulaire aura ainsi fortement proliféré à l&#39; intérieur des cellules hôtes. Comme les bactéries intracellulaires grandement plus nombreux que les bactéries non réplicatifs extracellulaires ou intracellulaires individuels, une souche exprimant constitutivement GFP peut être utilisé. Le signal de la GFP solide est ensuite utilisé pour identifier les cellules infectées. En revanche, pour le dosage d&#39;entrée, il est essentiel de faire la distinction entre les bactéries intracellulaires et extracellulaires. Ici, un codage de déformation pour une GFP inductible par la tétracycline est utilisée. Inductionde la GFP avec l&#39;inactivation simultanée des bactéries extracellulaires par la gentamicine permet la différenciation entre intracellulaire et extracellulaire des bactéries en fonction du signal de la GFP, seules les bactéries intracellulaires étant capable d&#39;exprimer la GFP. Ceci permet la détection des bactéries intracellulaires robuste unique avant la prolifération intracellulaire est initiée.

La figure 1A représente un exemple d&#39;analyse d&#39;image utilisé pour identifier automatiquement les cellules infectées dans l&#39;essai de point final. Les noyaux des cellules HeLa colorées avec du DAPI ont été identifiées, une péri-noyau d&#39;une largeur de 8 pixels entourant le noyau et un corps de cellule de Voronoi par extension du noyau par 25 pixels ont été calculés. Etant donné que les bactéries prolifèrent principalement dans l&#39;espace péri-nucléaire, l&...

Deux tests de dépistage à haut débit par microscopie des facteurs de l’hôte impliqués dans l’infection à Brucella sont décrits. Le test d’entrée détecte les facteurs de l’hôte nécessaires à l’entrée de Brucella et le test final ceux nécessaires à la réplication intracellulaire. Bien qu’il soit applicable à d’autres approches, le criblage de siRNA dans les cellules HeLa est utilisé pour illustrer les protocoles.

Les analyses microscopiques de Criblage à haut débit des facteurs de l&#39;hôte impliqués dans<em&gt; Brucella</em&gt; L&#39;infection des cellules HeLa

Brucella species are facultative intracellular pathogens that infect animals as their natural hosts. Transmission to humans is most commonly caused by ...

L'objectif général de ce test basé sur la microscopie à haut débit est d'identifier les facteurs de l'hôte impliqués dans l'infection des cellules HeLa par Brucella. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des interactions hôte-pathogène, telles que l'identification de protéines de l'hôte qui favorisent ou empêchent la colonisation par le pathogène intracellulaire Brucella. Le principal avantage de cette technique réside dans le fait que le flux de travail semi-automatisé, de la préparation en laboratoire jusqu'à l'analyse des images, permet l'utilisation de robots et la mise en place d'expériences à haut débit de manière efficace.Ainsi, cette méthode peut fournir des informations sur les interactions entre Brucella et l'hôte à l'aide de cribles par ARNsi. La majeure partie du protocole peut être appliquée à d'autres stratégies de criblage. Par exemple, ou aux bibliothèques d'ARNsi.Après avoir cultivé les cellules HeLa et préparé les plaques de criblage avec des siARN selon le protocole décrit dans le texte, décongeler une plaque noire de 384 puits par centrifugation à 300 × g et à température ambiante pendant 20 minutes. Préparer le milieu de trans

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Recherche

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

Source : Casanova, A., et al. Essais basés sur la microscopie pour le criblage à haut débit des facteurs de l’hôte impliqués dans l’infection par Brucella des cellules hela. J. Vis. Exp. (2016)Cette vidéo démontre l’imagerie à haut débit de l’infection par Brucella abortus dans les cellules épithéliales avec un knockdown STING médié par le SIRNA afin d’étudier le rôle de la détection de l’ADN cytosolique dans la réplication bactérienne intracellulaire et la réponse immunitaire innée de l’hôte.

Imagerie à haut débit de l’infection intracellulaire par Brucella abortus dans les cellules épithéliales de l’hôte

Nous décrivons une méthode pour le suivi de la rupture endomembranaire provoquée par les bactéries...

Simples mesures de cellules de rupture Vacuolar causées par des pathogènes intracellulaires

Cette technique fournit une méthode pour récolter, normaliser et quantifier la croissance intracellulaire des bactéries pathogènes qui sont pré-cultivées dans les cellules hôtes naturels protozoaires avant infections de cellules de mammifères. Cette méthode peut être modifiée pour accueillir une grande variété de cellules hôtes pour la phase d'amorçage, ainsi que les types de cellules cibles.

Infections traitables avec des cellules de mammifères Protozoaire amorcées bactéries

Nous décrivons une méthode de microscopie corrélative qui combine la microscopie à haute vitesse 3D de cellules vivantes fluorescent lumière et de haute résolution tomographie cryo-électronique. Nous démontrons la capacité de la méthode corrélative par imagerie dynamique, les petites VIH-1 particules en interaction avec des cellules HeLa d'accueil.

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Ici, nous décrivons une analyse phénotypique applicable aux écrans à haut débit/à haute teneur de l’ARN synthétique de petit-interférent (siRNA), du composé chimique, et des bibliothèques mutantes de tuberculose de mycobactérie. Cette méthode repose sur la détection de Mycobacterium tuberculosis marqué par fluorescence dans une cellule hôte marqué par fluorescence à l’aide d’une microscopie confocale automatisée.

Un test phénotypique microscopique pour la quantification des mycobactéries intracellulaires adaptées au criblage à haut débit /haute teneur

Cet article décrit la vidéo pipeline à haut débit qui a été mis en place avec succès pour infecter et d'analyser un grand nombre d'embryons de poisson zèbre qui fournissent un nouvel outil puissant pour les essais en enclos et la découverte de médicaments à l'aide d'un organisme entier de animaux vertébrés.

Création et optimisation d&#39;une installation à haut débit pour l&#39;étude<em&gt; Staphylococcus epidermidis</em&gt; Et<em&gt; Mycobacterium marinum</em&gt; Infection comme un modèle pour la découverte de médicaments

Coxiella burnetii est une bactérie intracellulaire Gram négatif obligatoire responsable de la maladie zoonotique la fièvre Q. Nous décrivons ici des procédés pour la génération de mutants de transposon Coxiella fluorescent ainsi que l'identification et l'analyse automatisée de l'internalisation, la réplication et cytotoxiques phénotypes résultants.

Génération et multi-phénotypique criblage à haut contenu de<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; Mutants de transposon

Un test en temps réel à haut débit a été mis au point pour identifier simultanément (1) les antimicrobiens à pénétration de cellules eucaryotes ciblant un pathogène bactérien intracellulaire, et (2) évaluer la cytotoxicité des cellules eucaryotes. Une variante de la même technologie a ensuite été combinée à la technologie de distribution numérique pour permettre des études faciles, à haute résolution, dose-réponse et en synergie bidimensionnelle et tridimensionnelle.

High Throughput, en temps réel, à double lecture Test de intracellulaires activité antimicrobienne et eucaryotes cytotoxicité cellulaire

Nous présentons dans l'étude d'un nouveau test basé sur la fluorescence en utilisant des lymphocytes dérivés d'une souris transgénique. Ce dosage est adapté pour le criblage à haut débit (HTS) de petites molécules dotées de la capacité de l'une ou l'inhibition de la promotion de l'activation des lymphocytes.

A base Fluorescence-lymphocytaire Assay Convient pour Criblage à haut débit des petites molécules

Nous avons développé un test multipuits format polyacrylamide pour sonder l’effet de la rigidité de la matrice extracellulaire sur une infection bactérienne de cellules adhérentes. Ce dosage est compatible avec la cytométrie en flux, immuno-coloration et microscopie de force de traction, ce qui permet des mesures quantitatives des biomécaniques interactions entre cellules, leur matrice extracellulaire et des bactéries pathogènes.

Un test multipuits Format Polyacrylamide pour étudier l’effet de la rigidité de la matrice extracellulaire sur l’Infection bactérienne de cellules adhérentes

Cette étude a mis au point un test de criblage à haut débit contre Mycobacterium abscessus avec une souche à double rapporteur récemment créée, en utilisant la fluorescence et la luminescence pour évaluer rapidement la viabilité bactérienne. Ce protocole sera pertinent pour les chercheurs qui souhaitent cribler de nouveaux médicaments contre cette bactérie résistante aux médicaments.

Développement d’un test pour le criblage de médicaments à haut débit contre les mycobactéries

Apprenez un criblage à haut débit par microscopie pour identifier les facteurs de l'hôte impliqués dans l'infection de cellules HeLa par Brucella. Cette méthode utilise des écrans siRNA et une analyse d'images automatisée.

Les analyses microscopiques de Criblage à haut débit des facteurs de l'hôte impliqués dans

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