Protocole pour la conversion directe des fibroblastes embryonnaires murins en trophoblaste cellules souches

L'objectif général de cette procédure est de générer des cellules souches trophoblastiques induites authentiques, ou iTSC, à partir de fibroblastes murins. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des cellules souches concernant la nature de la barrière séparant la lignée embryonnaire de la lignée extra-embryonnaire. Le principal avantage de cette technique est que l'expression transgénique n'est activée que de manière transitoire, facilitant ainsi la sélection de cellules stables converties.

Dans un laboratoire de niveau de biosécurité 2, en utilisant les équipements de protection individuelle appropriés, recouvrez cinq boîtes de Pétri de 100 millilitres avec cinq millilitres de solution de Poly-L-lysine, en agitant doucement les plaques pour répartir uniformément la solution de revêtement. Placez les boîtes dans un incubateur à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes, puis aspirez le Poly-L-lysine et rincez les boîtes une fois avec du PBS. Ensuite, semez sept fois 10 à la puissance six cellules 293 T par boîte dans 10 millilitres de milieu pour cellules 293 T, faites tourbillonner les boîtes pour répartir uniformément les cellules, puis remettez les boîtes dans l'incubateur.

Le lendemain matin, remplacez le milieu de croissance par cinq millilitres de milieu de transfection. Ensuite, traitez les cultures avec six microlitres d'une solution mère de chloroquine à 1000X et replacez les plaques dans l'incubateur à 37 degrés Celsius. Pour préparer le mélange de transfection, ajoutez, pour chaque vecteur lentiviral, 600 microlitres de solution d'ADN Lentivector goutte à goutte dans 600 microlitres de solution saline tamponnée au HEPES 2X tout en vortexant, puis incubez le mélange de transfection à température ambiante.

Après 15 minutes, ajouter très soigneusement le mélange goutte à goutte aux cellules 293 T préparées, puis remettre les boîtes dans l'incubateur. Après cinq à six heures, remplacer le milieu par 10 millilitres de milieu de production de virus, et remettre les plaques dans l'incubateur. Le lendemain matin, remplacer soigneusement le milieu par sept millilitres de milieu frais de production de virus pour une autre incubation nocturne.

Ensuite, transférez le milieu de chaque plaque dans des tubes coniques individuels de 15 millilitres et ajoutez sept millilitres de milieu frais de production de virus sur les plaques pour une autre incubation nocturne. Le lendemain matin, récoltez le deuxième lot de milieu contenant le virus, mélangez le surnageant avec le premier lot de virus et filtrez le milieu contenant le virus à travers un filtre en acétate de cellulose sans surfactant de 0,45 micron pour un stockage en aliquotes de 500 microlitres à moins 80. Pour convertir les fibroblastes en cellules souches trophoblastiques induites, lavez deux fois les fibroblastes embryonnaires massivement transduits ou MEF avec deux millilitres de PBS.

Ensuite, détacher les cellules avec 0,5 millilitre de solution de trypsine-EDTA à 37 degrés Celsius. Après trois à quatre minutes, vérifier au microscope inversé que les cellules se sont détachées de la plaque, puis arrêter l'action de la trypsine en ajoutant 1 millilitre de milieu TS. Transférer les suspensions cellulaires dans des tubes coniques individuels de 15 millilitres et centrifuger les cellules.

Ensuite, re-suspendez les culots dans deux millilitres de milieu TS, et ensemencez deux fois 10 à la puissance 5 cellules MEF mCherry à quatre facteurs ou MEF témoins non transduites par boîte de 100 millilitres dans 10 millilitres de milieu TS contenant le facteur de croissance des fibroblastes 4 et de l’héparine, supplémenté de doxycycline, pour une culture nocturne. Le jour suivant, sous un microscope à épifluorescence, utilisez l’expression de la protéine mCherry pour estimer l’efficacité de transduction. Si l’efficacité de transduction est d’environ 100 %, remettez les cultures dans l’incubateur, en changeant le milieu dans toutes les boîtes tous les deux jours jusqu’au jour 10.

Par la suite, nourrissez les cellules avec un milieu TS frais contenant le facteur de croissance des fibroblastes quatre et de l'héparine, sans doxycycline, en utilisant le microscope inversé pour surveiller l'apparition de zones transdifférenciées sur la boîte contenant les quatre facteurs pendant une durée allant jusqu'à trois semaines. L'identification des zones transdifférenciées est essentielle, car à ce stade, les MEF ne ressemblent pas morphologiquement aux cellules souches du trophoblaste. Recherchez des colonies fortement empilées adjacentes aux cellules géantes trophoblastiques, qui sont identifiées par leur taille cellulaire et leur noyau volumineux.

Pour isoler des lignées individuelles de iTSC, commencez par nettoyer le microscope inversé avec de l'éthanol à 70 % afin de minimiser le risque de contamination bactérienne. Ensuite, ajoutez 40 microlitres de trypsine-EDTA 0,5 % dans 12 puits d'une plaque de 96 puits à fond rond, puis placez la plaque sur de la glace. Aspirez maintenant le milieu du plat de transdifférentiation de MEF à quatre facteurs et lavez les cellules une fois avec 10 millilitres de PBS.

Après le lavage, ajoutez 10 millilitres de PBS frais aux cellules et placez la plaque sur la platine du microscope inversé. À l’aide d’une pipette de 100 microlitres réglée à 40 microlitres, contournez chaque colonie individuelle avec la pointe de la pipette et aspirez la colonie flottante obtenue. Transférez chaque colonie dans des puits individuels de la plaque 96 puits jusqu’à ce que 12 colonies aient été sélectionnées.

Incuber ensuite les colonies à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes. À la fin de l'incubation, dissocier les cellules par pipetage et transférer les suspensions cellulaires dans des puits individuels d'une plaque de 24 puits contenant 500 microlitres de milieu TS complet plus facteur de croissance des fibroblastes et héparine pour une culture nocturne. Le jour suivant, remplacer le milieu par du milieu TS complet frais plus facteur de croissance des fibroblastes et héparine afin d'éliminer les cellules mortes et remettre la plaque dans l'incubateur.

Surveiller quotidiennement les cultures à la recherche de colonies épithéliales présentant des contours brillants. Lorsque les colonies sont observées, cultiver les cellules pendant une semaine au maximum ou jusqu'à ce qu'elles atteignent une confluence de 70 %. Dans les cultures où l'expression du transgène des quatre facteurs est activée, les cellules changent rapidement de morphologie.

Entre les jours 14 et 21, des zones distinctes de transdifférenciation apparaissent. Ces colonies primaires ne présentent pas la morphologie typique des cellules souches trophoblastiques ; toutefois, une fois sous-cultivées, une morphologie épithéliale caractéristique, avec des bords serrés et des limites brillantes, fortement rappelant celle des cellules souches trophoblastiques authentiques, est observée. Lorsque les cellules souches trophoblastiques induites par les quatre facteurs restent positives pour les facteurs de transcription trophoblastiques Cdx2 et Tfap2c, ces lignées peuvent être utilisées pour des analyses ultérieures in vitro ou in vivo.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en six semaines si elle est effectuée correctement. Après cette procédure, d'autres méthodes comme l'injection assistée par blastocyste peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires concernant le potentiel de chimérisation des iTSC générés. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs du domaine de la ségrégation précoce des lignées pour explorer la conversion du destin cellulaire embryonnaire versus extra-embryonnaire chez la souris.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de convertir directement de nouveaux fibroblastes embryonnaires en cellules souches trophoblastiques induites. N’oubliez pas que le travail avec des vecteurs lentiviraux peut être extrêmement dangereux et que des précautions, telles que l’utilisation de procédures de travail adaptées au niveau de biosécurité deux, doivent toujours être respectées.