Protocole pour la conversion directe des fibroblastes embryonnaires murins en trophoblaste cellules souches

L’objectif global de cette procédure est de générer des cellules souches trophoblastiques induites de bonne foi, ou iTSC, à partir de fibroblastes murins. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des cellules souches concernant la nature de la barrière séparant la lignée embryonnaire de la lignée extra-embryonnaire. Le principal avantage de cette technique est que l’expression transgénique n’est activée que de manière transitoire, ce qui facilite la sélection de cellules converties de manière stable.

Dans un laboratoire de niveau de biosécurité deux, à l’aide de l’équipement de protection individuelle approprié, couvrez cinq boîtes de 100 millilitres avec cinq millilitres de solution de poly-L-lysine, en secouant doucement les plaques pour répartir uniformément la solution d’enrobage. Placez la vaisselle dans un incubateur à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes, puis aspirez la Poly-L-lysine et rincez la vaisselle une fois avec du PBS. Ensuite, plaquez sept fois 10 à six cellules T 293 par boîte dans 10 millilitres de milieu à cellules T 293, faites tourner les boîtes pour répartir uniformément les cellules et remettez les boîtes dans l’incubateur.

Le lendemain matin, remplacez le milieu de croissance par cinq millilitres de milieu de transfection. Traitez ensuite les cultures avec six microlitres d’un stock de 1000X de solution de chloroquine et remettez les plaques dans l’incubateur à 37 degrés Celsius. Pour préparer le mélange de transfection, pour chaque vecteur lentiviral, ajoutez 600 microlitres de solution d’ADN Lentivector goutte à goutte dans 600 microlitres de solution saline tamponnée 2X HEPES tout en vortex et incubez le mélange de transfection à température ambiante.

Après 15 minutes, ajoutez très soigneusement le mélange goutte à goutte dans les 293 cellules T préparées et remettez les plats dans l’incubateur. Après cinq à six heures, remplacez le milieu par 10 millilitres de milieu de production de virus et remettez les plaques dans l’incubateur. Le lendemain matin, remplacez soigneusement le milieu par sept millilitres de milieu de production de virus frais pour une autre incubation d’une nuit.

Ensuite, transférez le milieu de chaque plaque dans des tubes coniques individuels de 15 millilitres et ajoutez sept millilitres de milieu de production de virus frais sur les plaques pour une autre incubation d’une nuit. Le lendemain matin, récoltez le deuxième lot de milieu contenant le virus, en regroupant le surnageant avec le premier lot de virus et la souche du milieu contenant le virus à travers un filtre à membrane en acétate de cellulose sans tensioactif de 0,45 micron pour le stockage dans des aliquotes de 500 microlitres à moins 80. Pour convertir les fibroblastes en cellules souches trophoblastiques induites, lavez les fibroblastes embryonnaires de masse ou MEF transduits deux fois avec deux millilitres de PBS.

Ensuite, détachez les cellules avec 0,5 millilitre de solution de trypsine EDTA à 37 degrés Celsius. Après trois à quatre minutes, confirmez que les cellules se sont retirées de la plaque sous un microscope inversé, puis activez la trypsine avec un millilitre de milieu TS. Transférez les suspensions cellulaires dans des tubes coniques individuels de 15 millilitres et centrifugez les cellules.

Ensuite, remettez les pastilles en suspension dans deux millilitres de milieu TS et plaquez deux fois 10 au cinquième facteur quatre mCherry ou contrôlez les MEF non transduits par boîte de 100 millilitres dans 10 millilitres de milieu TS contenant le facteur de croissance des fibroblastes quatre et l’héparine complétée par de la doxycycline pour la culture pendant la nuit. Le lendemain, sous un microscope à épifluorescence, utilisez l’expression de la protéine mCherry pour estimer l’efficacité de la transduction. Si l’efficacité de transduction est d’environ 100 %, retournez les cultures dans l’incubateur, en changeant le milieu dans tous les plats tous les deux jours jusqu’au 10e jour.

Par la suite, nourrissez les cellules avec un milieu TS frais contenant le facteur de croissance des fibroblastes quatre et de l’héparine sans doxycycline à l’aide du microscope inversé pour surveiller l’apparition de zones transdifférenciées sur la boîte à quatre facteurs pendant trois semaines. L’identification des zones transdifférenciées est essentielle, car à ce stade, les MEF ne ressemblent pas morphologiquement aux cellules souches trophoblastiques. Recherchez des colonies densément empilées adjacentes aux cellules géantes trophoblastiques qui sont identifiées par leur taille cellulaire et leur gros noyau.

Pour isoler des lignes iTSC individuelles, essuyez d’abord le microscope inversé avec de l’éthanol à 70 % afin de minimiser le risque de contamination bactérienne. Ensuite, ajoutez 40 microlitres de 05 % de trypsine EDTA dans 12 puits d’une plaque de fond de 96 U, et placez la plaque sur de la glace. Maintenant, aspirez le milieu de la boîte de transdifférenciation MEF des quatre facteurs et lavez les cellules une fois avec 10 millilitres de PBS.

Après le lavage, ajoutez 10 millilitres de PBS frais dans les cellules et placez la plaque sur la platine du microscope inversé. À l’aide d’une pipette de 100 microlitres réglée sur 40 microlitres, encerclez chaque colonie individuelle avec la pointe de la pipette et aspirez la colonie flottante résultante. Transférez chaque colonie dans des puits individuels de la plaque de 96 puits jusqu’à ce que 12 colonies aient été cueillies.

Ensuite, incubez les colonies à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes. À la fin de l’incubation, dissocier les cellules par pipetage et transférer les suspensions cellulaires dans des puits individuels d’une plaque de 24 puits contenant 500 microlitres de TS complet plus le facteur de croissance des fibroblastes et le milieu d’héparine pour la culture pendant la nuit. Le lendemain, remplacez le milieu par du TS complet frais plus facteur de croissance des fibroblastes et un milieu d’héparine pour éliminer les cellules mortes et remettre la plaque dans l’incubateur.

Surveiller quotidiennement les cultures pour l’apparition de colonies épithéliales aux limites lumineuses. Lorsque les colonies sont observées, cultivez les cellules jusqu’à une semaine ou jusqu’à ce qu’elles soient confluentes à 70 %. Dans les cultures où l’expression du transgène des quatre facteurs est activée, les cellules changent rapidement de morphologie.

Vers les jours 14 à 21, des zones distinctes et transdifférenciées émergent. Ces colonies primaires n’ont pas la morphologie typique des cellules souches trophoblastiques, mais une fois qu’elles sont sous-cultivées, une morphologie épithéliale caractéristique avec des bords serrés et des limites brillantes, rappelant fortement les cellules souches trophoblastiques de bonne foi, est observée. Lorsque les cellules souches trophoblastiques induites par les quatre facteurs restent positives pour le facteur de transcription trophoblastique, Cdx2 et Tfap2c, l’idée de ces lignées peut être utilisée pour des analyses in vitro ou in-vivo ultérieures.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être complétée en six semaines si elle est correctement exécutée. À la suite de cette procédure, d’autres méthodes telles que l’injection assistée par souffle peuvent être effectuées pour répondre à des questions supplémentaires sur le potentiel de chimérisation des iTSC générés. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la ségrégation précoce de la lignée pour explorer la conversion du destin cellulaire embryonnaire par rapport au destin cellulaire extra-embryonnaire chez la souris.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de convertir directement de nouveaux fibroblastes embryonnaires en cellules souches trophoblastiques induites. N’oubliez pas que travailler avec des vecteurs lentiviraux peut être extrêmement dangereux et que des précautions telles que l’utilisation de procédures de travail appropriées de niveau de biosécurité deux doivent toujours être suivies.