Préparation de Cores de tissus enrobés de paraffine fixés au formol pour les ARN et d'extraction d'ADN

L’objectif global de cette procédure est d’extraire séquentiellement l’ARN et l’ADN de noyaux de tissus d’archives fixés au formol et inclus dans la paraffine. Il s’agit d’un protocole de récolte de carottes de tissus à partir desquelles nous allons extraire à la fois l’ARN et l’ADN. Le principal avantage de ce protocole est qu’il améliore les rendements en ARN et en ADN à partir de régions précisément ciblées dans le bloc tissulaire.

Cette procédure est largement développée dans les tissus d’archives du cancer de la prostate. Il peut également être appliqué à d’autres types de tissus d’archives. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle car les étapes de carottage tissulaire ne sont pas couramment utilisées dans les laboratoires de recherche.

La plupart des laboratoires de recherche utilisent plutôt des coupes efficaces, ce qui épuise les tissus plus rapidement et ajoute une hétérogénéité significative à l’échantillon. Commencez par examiner la lame de microscope et délimiter la région d’intérêt à l’aide d’un marqueur permanent à pointe fine. Ensuite, coupez une section de film de paraffine suffisamment grande pour couvrir la région d’intérêt sur la lame de microscope.

Ensuite, placez fermement le film sur la lame, en enroulant le film sur les bords pour l’empêcher de glisser. À l’aide d’un marqueur permanent à pointe fine, tracez le contour de l’ensemble du tissu et de la région d’intérêt à l’intérieur du tissu. Ensuite, retirez le film de la lame et transférez-le dans le bloc de tissu correspondant.

Orientez le film en le retournant ou en le tournant de sorte que le contour de l’ensemble du tissu corresponde à la forme observée du tissu dans le bloc. Appuyez fermement la section de film sur la surface du bloc pour éviter qu’elle ne glisse. À l’aide de la pointe du marqueur permanent, faites des indentations peu profondes mais visibles le long du contour de la région d’intérêt, puis retirez le film.

Ensuite, nettoyez le poinçon récepteur de l’ensemble de poinçons de 0,6 millimètre en immergeant la pointe dans un micro-tube à centrifuger de 1,5 millilitre contenant un millilitre d’eau de Javel et en faisant glisser le poinçon de haut en bas plusieurs fois. Répétez le lavage avec le tube contenant 70 % d’éthanol, puis arrosez. Enfoncez maintenant le poinçon nettoyé dans la zone d’intérêt à une profondeur de trois millimètres et retirez-le.

Libérez le noyau dans un microtube de centrifugation à faible liaison en le poussant hors du poinçon avec le stylet. Ajoutez un millilitre de xylène dans les tubes de microfuge contenant les carottes de tissus et vortex vigoureusement pendant dix secondes. Placez ensuite dans un bloc de chaleur réglé à 50 degrés Celsius pendant trois minutes.

Après l’incubation, centrifugez pendant deux minutes à température ambiante à vitesse maximale. Après la centrifugation, placez les noyaux sur de la glace pendant cinq minutes pour solidifier le résidu cireux. Maintenant, retirez soigneusement la paraffine qui s’est accumulée autour du ménisque avec le surnageant à l’aide d’une pointe de pipette.

Ensuite, répétez le traitement au xylène. Après avoir retiré le mélange de paraffine et de xylène, ajoutez un millilitre d’éthanol à 100 % et agitez vigoureusement pendant dix secondes. Après avoir centrifugé à vitesse maximale pendant deux minutes, jetez soigneusement l’éthanol.

Répétez le lavage à l’éthanol une fois de plus avant de commencer l’homogénéisation. Remettre en suspension les noyaux déparaffinisés dans 700 microlitres d’éthanol à 100 % avant l’homogénéisation. Utilisez un homogénéisateur de tissus motorisé à réglage moyen pour broyer les noyaux en fines particules.

Une homogénéisation complète des carottes tissulaires est nécessaire pour un rendement optimal en ADN et en ARN. Ensuite, remplissez des tubes séparés de 15 millilitres avec environ dix millilitres d’eau de Javel, de solution neutralisante de RNase et d’éthanol à 70 %. Après l’homogénéisation de l’échantillon, laver la sonde d’homogénéisation dans chacune des solutions de nettoyage dans l’ordre.

Faites fonctionner l’homogénéisateur à la vitesse la plus élevée pendant l’étape de lavage. Essuyez la sonde avec un mouchoir en papier et laissez-la sécher complètement avant d’homogénéiser l’échantillon suivant. Inspectez visuellement les lames de la sonde à la recherche de morceaux de tissu résiduels et, le cas échéant, nettoyez à nouveau la sonde.

Après homogénéisation, porter le volume de l’échantillon à un millilitre avec de l’éthanol à 100 %, puis centrifuger à vitesse maximale pendant 15 minutes. Aspirez soigneusement l’éthanol et faites sécher les granulés à l’air libre pendant environ 15 à 20 minutes avant de commencer l’extraction de la protéinase K. Remettez les granulés en suspension dans 150 microlitres de tampon de digestion de la protéinase K et agitez les tubes pour détacher la cuffe.

La digestion nocturne de la protéinase K est recommandée pour une meilleure récupération de l’ADN. Ajouter 10 microlitres de protéinase K stable à la température et mélanger en effleurant. Incuber à 56 degrés Celsius pendant 15 minutes en agitant doucement.

Incuber les tubes sur de la glace pendant trois minutes. Après refroidissement, centrifugez le tube pendant 15 minutes à vitesse maximale. Ensuite, sans déranger les granulés, transférez soigneusement chaque surnageant dans un nouveau microtube de centrifugation pour la purification de l’ARN.

Extrayez l’ARN et l’ADN en utilisant la procédure optimisée du protocole écrit, qui comprend un temps de digestion tissulaire prolongé pour l’extraction de l’ADN. L’ARN et l’ADN peuvent être récupérés à partir d’échantillons de tissus plus anciens fixés au formol et inclus dans de la paraffine en utilisant cette méthode. Les acides nucléiques ont été coextraits d’échantillons de cancer de la prostate âgés de trois à 14 ans.

Le rendement moyen était de 2 270 nanogrammes d’ARN et 820 nanogrammes d’ADN. Il est intéressant de noter qu’il n’y avait pas de corrélation significative entre l’âge de l’échantillon de tissu et la récupération des acides nucléiques. Dans l’ensemble, les rendements en ARN et en ADN étaient corrélés entre les échantillons, bien que dans la plupart des cas, plus de deux fois plus d’ARN ait été récupéré par rapport à l’ADN.

Pour démontrer la performance de l’ADN génomique extrait avec ce protocole, des extraits d’ADN convertis au bisulfite à partir d’échantillons d’archives de cancer de la prostate ont été amplifiés par PCR spécifique de méthylation. Des éléments répétitifs ALU ont été utilisés comme contrôle de la méthylation et ont montré peu de variation entre les échantillons. GSTP1, un gène connu pour être hyper-méthylé dans le cancer de la prostate, n’a montré aucune amplification détectable par PCR spécifique à la méthylation lorsque de l’ADN extrait d’échantillons bénins a été utilisé.

Les échantillons d’ADN de patients atteints d’un cancer de la prostate agressif présentaient des valeurs seuils détectables du cycle QPCR inférieures à celles des cellules cancéreuses de la prostate indolentes, indiquant une méthylation accrue de GSTP1 dans le cancer de la prostate agressif. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en trois à quatre heures pour l’ARN, et après une digestion nocturne, en quatre heures pour l’ADN si elle est effectuée correctement. Cette technique devrait permettre aux chercheurs en pathologie moléculaire d’explorer des biomarqueurs diagnostiques de l’ADN et de l’ARN dans une variété de cancers.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de préparer des carottes de tissus pour l’extraction d’ADN et d’ARN à partir de zones d’intérêt cartographiées avec précision dans des blocs de tissus d’archives.