Name: Préparation de Cores de tissus enrobés de paraffine fixés au formol pour les ARN et dextraction dADN (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: Apprenez à extraire l'ARN et l'ADN de tissus inclus en paraffine fixés au formol en utilisant une technique de carottage ciblée. Cette méthode améliore significativement les rendements en acides nucléiques.

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Cette recherche a été financée par une subvention d’équipe de Movember/Cancer de la Prostate Canada à JMSB, DMB, PCP et JL, et par l’Institut ontarien de recherche sur le cancer (JMSB, DMB et PCP) et Motorcycle Ride for Dad Kingston/University Hospitals Kingston Foundation/Kingston General Hospital (DMB, PCP).

1. Carottage tissulaire
<ol>
	<li>Examinez la lame de microscope et tracez le contour de la ou des régions d’intérêt à l’aide d’un marqueur permanent à pointe fine. Découpez une section de film de paraffine suffisamment grande pour couvrir la région d’intérêt sur la lame de microscope. Placez le film fermement sur la diapositive et enroulez le film sur les bords pour empêcher le film de glisser. À l’aide d’un marqueur permanent à pointe fine, tracez le contour de l’ensemble du tissu et de la ou des régions d’intérêt à l’intérieur du tissu, en gardant le contour touchant, mais en dehors de la ou des régions.</li>
	<li>Retirez le film et transférez-le dans le bloc de tissu correspondant. Orientez le film en le retournant ou en le tournant de sorte que le contour de l’ensemble du tissu corresponde à la forme observée du tissu dans le bloc (Figure 1). Appuyez fermement la section de film sur la surface du bloc pour éviter qu’elle ne glisse.</li>
	<li>À l’aide de la pointe du marqueur permanent, faites des indentations peu profondes mais visibles (~0,2 mm) le long du contour de la ou des régions d’intérêt, puis retirez le film. Chargez 1 ml d’eau de Javel, d’éthanol à 70 % et d’eau dans des tubes à microcentrifuger séparés de 1,5 ou 2,0 ml.</li>
	<li>Nettoyez le poinçon récepteur (rouge) du jeu de poinçons de 0,6 mm en faisant glisser le poinçon de haut en bas plusieurs fois pendant que la pointe est immergée dans le tube contenant de l’eau de Javel. Répétez l’étape ci-dessus avec de l’éthanol à 70 %, puis de l’eau (essentiel pour s’assurer que l’eau de Javel est éliminée).</li>
	<li>Appuyez le poinçon dans le tissu, à l’intérieur de la région d’intérêt jusqu’à une profondeur de 3 mm et retirez le poinçon. Libérez le noyau dans un tube de 1,5 ou 2 ml à faible reliure en le poussant hors du poinçon avec le stylet. Stockez les noyaux à -20 °C (à long terme) ou à 4 °C pour une utilisation à court terme.</li>
	<li>Nettoyez le poinçon selon l’étape 1.4 et passez aux régions ou à l’échantillon suivants.</li>
</ol>
2. Déparaffiniser les noyaux de tissus FFPE
<ol>
	<li>Effectuer la déparaffinisation dans des tubes de 1,5 ou 2 ml en ajoutant 1 ml de xylène au noyau du tissu et en agitant vigoureusement pendant 10 sec. Chauffer pendant 3 min à 50 °C.</li>
	<li>Centrifugez pendant 2 min à température ambiante (RT) et à vitesse maximale (21 130 x g) et placez le tube sur de la glace pendant 5 min (permet au résidu cireux de se solidifier sur le dessus).</li>
	<li>Retirez soigneusement la paraffine accumulée autour du ménisque avec du surnageant à l’aide d’une pointe de pipette et répétez le traitement au xylène (étapes 2.1-2.2).</li>
	<li>Ajouter 1 ml d’éthanol (100 %) et agiter vigoureusement pendant 10 secondes. Centrifuger pendant 2 minutes à RT (vitesse maximale) et jeter soigneusement l’éthanol. Répétez l’étape ci-dessus une fois.</li>
</ol>
3. Homogénéisation des noyaux déparaffinisés
<ol>
	<li>Remettre les noyaux en suspension dans 700 μl d’éthanol (100 %) avant homogénéisation. À l’aide d’un homogénéisateur de tissus motorisé, broyez les noyaux en fines particules de tissu (~1 min à réglage moyen). Nettoyez la sonde de l’homogénéisateur entre chaque échantillon afin de minimiser la contamination par réverbération.
	<ol>
		<li>Remplissez les tubes de 15 ml avec ~10 ml d’eau de Javel, de solution neutralisante de RNase et d’éthanol à 70 %. Après l’homogénéisation de l’échantillon, laver la sonde d’homogénéisation dans chacune des solutions de nettoyage dans l’ordre indiqué ci-dessus. Faites fonctionner l’homogénéisateur à la vitesse la plus élevée pendant l’étape de lavage.</li>
		<li>Essuyez la sonde avec du mouchoir en papier et laissez la sonde sécher complètement avant d’homogénéiser l’échantillon suivant. Inspectez visuellement les lames de la sonde à la recherche de morceaux de tissu résiduels. Si vous en trouvez, nettoyez à nouveau la sonde. Changez les solutions de nettoyage (eau de Javel, éthanol et solution neutralisante RNase) tous les jours.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Après homogénéisation, porter le volume de l’échantillon à 1 ml en ajoutant plus d’éthanol à 100 % (~300 μl). Centrifugez à vitesse maximale pendant 15 min, aspirez soigneusement l’éthanol et séchez la pastille à l’air libre pendant environ 15 à 20 minutes avant de procéder à l’extraction de l’ARN.</li>
</ol>
4. Digestion avec la protéinase K
<ol>
	<li>Remettez la pastille en suspension dans un tampon de digestion de protéinase K de 150 μl et agissez le tube pour détacher la pastille. Ajouter 10 μl de protéinase K stable à la température et mélanger en effleurant (ne pas agiter le tube). Incuber le contenu dans le tube à 56 °C pendant 15 min en agitant doucement.</li>
	<li>Laisser le tube incuber sur de la glace pendant 3 min. Un refroidissement complet est important pour une précipitation efficace à l’étape suivante. Centrifuger pendant 15 min à vitesse maximale.</li>
</ol>
5. Séparer l’ARN de l’ADN
<ol>
	<li>Transférez soigneusement le surnageant, sans perturber la cuffe, dans un nouveau 1,5 ml pour la purification de l’ARN.</li>
	<li>Conservez la pastille pour la purification de l’ADN (la pastille peut être conservée pendant 2 heures à RT, jusqu’à 1 jour à 2-8 °C, ou pendant de plus longues périodes à -20 °C).</li>
</ol>
6. Purification de l’ARN
<ol>
	<li>Incuber le surnageant contenant de l’ARN à 80 °C pendant 15 min (ne pas dépasser ce temps). Ensuite, centrifugez brièvement le tube pour recueillir les gouttes à l’intérieur du couvercle.</li>
	<li>Ajouter 320 μl de tampon RLT pour ajuster les conditions de liaison et mélanger par pipetage. Ensuite, ajoutez 720 μl d’éthanol (100 %) et vortex.</li>
	<li>Transvasez 600 μl de l’échantillon, y compris tout précipité qui a pu se former, dans une colonne de spin d’ARN (fournie dans le kit) placée dans un tube de prélèvement de 2 ml et mettez de côté le reste du contenu. Centrifugez pendant 15 secondes à ≥8 000 x g, jetez le flux continu et réutilisez le tube de collecte.</li>
	<li>Transférez l’échantillon restant sur une colonne, y compris les gouttelettes qui peuvent s’être accumulées dans le couvercle du tube, centrifugez pendant 15 secondes à ≥8 000 x g et jetez le flux.</li>
	<li>Ajoutez 350 μl de tampon FRN dans la colonne d’essorage et centrifugez pendant 15 secondes à ≥8 000 x g, jetez le tube d’écoulement et réutilisez le tube de collecte.</li>
	<li>Mélangez délicatement 10 μl de solution mère de DNase I avec 70 μl de tampon RDD, ajoutez-les directement à la membrane de la colonne de spin et incubez à RT pendant 15 min.</li>
	<li>Ajoutez 500 μl de tampon FRN dans la colonne de centrifugation, centrifugez pendant 15 secondes à ≥8 000 x g et conservez le flux pour l’utiliser à l’étape suivante. Pour améliorer la récupération des petits ARN, placez la colonne de spin dans un nouveau tube de collecte de 2 ml et appliquez le flux de l’étape précédente sur la colonne de spin.</li>
	<li>Centrifugez pendant 15 secondes à ≥8 000 x g, jetez le flux continu et réutilisez le tube de collecte à l’étape suivante. Ajoutez 500 μl de tampon RPE dans la colonne d’essorage et centrifugez pendant 15 secondes à ≥8 000 x g, jetez le flux continu et réutilisez le tube de collecte à l’étape suivante.</li>
	<li>Ajoutez 500 μl de tampon RPE dans la colonne de centrifugation et centrifugez pendant 15 secondes à ≥8 000 x g et jetez le tube de collecte avec le flux continu.</li>
	<li>Placez la colonne d’essorage dans un nouveau tube de collecte de 2 ml, ouvrez le couvercle et centrifugez à vitesse maximale pendant 5 min. Jetez le tube de collecte avec le flux continu.</li>
	<li>Placez la colonne de centrifugation dans une nouvelle collection de 1,5 ml, ajoutez 20 μl d’eau sans RNase directement sur la membrane de la colonne de centrifugation et incubez le tube pendant 1 min à RT. Centrifugez à vitesse maximale pendant 1 min pour éluer l’ARN. Conservez l’échantillon d’ARN élué à -80 °C.</li>
</ol>
7. Purification de l’ADN
<ol>
	<li>Remettre en suspension la pastille obtenue lors de l’extraction de l’ARN par addition progressive de 45 μl de tampon protéinase K (400 mM Tris 7.5, 400 mM NaCl, 3 mM MgCl2, 4 % SDS), 45 μl H2O et 400 μg de protéinase K de haute puissance.</li>
	<li>Incuber la solution ci-dessus à 56 °C pendant 24 heures (recommandé) ou toute la nuit. Effectuer l’incubation à 90 °C pendant 2 heures sans agitation et centrifuger brièvement le tube de microcentrifugation pour recueillir les gouttes à l’intérieur du couvercle.</li>
	<li>Laissez l’échantillon refroidir jusqu’à ce qu’il soit RT, puis ajoutez 4 μl de RNase A (100 mg/ml). Incuber l’échantillon pendant 2 min à RT.</li>
	<li>Ajoutez 200 μl de tampon AL à l’échantillon et mélangez soigneusement par vortex. Ensuite, ajoutez 200 μl d’éthanol à 100 % et mélangez soigneusement par vortex. Transférez l’échantillon entier dans la colonne de centrifugation fournie, placez-le dans un tube de prélèvement de 2 ml et centrifugez-le pendant 1 min à ≥8 000 x g.</li>
	<li>Jetez le tube de collecte avec le tube à écoulement continu et placez la colonne d’essorage dans un nouveau tube de collecte de 2 ml. Ajouter 700 μl de tampon AW1 dans la colonne d’essorage, centrifuger pendant 15 secondes à ≥8 000 x g, jeter le flux continu et réutiliser le tube de collecte.</li>
	<li>Ajouter 700 μl de tampon AW2 dans la colonne d’essorage, centrifuger pendant 15 secondes à ≥8 000 x g, jeter le flux continu et réutiliser le tube de collecte. Ensuite, ajoutez 700 μl d’éthanol à 100 % dans la colonne de centrifugation, centrifugez pendant 15 secondes à ≥8 000 x g et jetez le tube de collecte avec l’écoulement.</li>
	<li>Placez la colonne d’essorage dans un nouveau tube de collecte de 2 ml, ouvrez le couvercle de la colonne d’essorage et centrifugez à pleine vitesse pendant 5 min. Jetez le tube de collecte avec l’écoulement.</li>
	<li>Placez la colonne d’essorage dans un nouveau tube de prélèvement de 1,5 ml et ajoutez 25 μl d’eau chauffée sans nucléase (50 °C). Incuber la colonne et le tube à 50 °C pendant 10 min. Centrifugez pendant 1 min à vitesse maximale, ajoutez 25 μl d’eau sans nucléase (RT) dans la colonne et incubez pendant 1 min à RT.</li>
	<li>Centrifuger pendant 1 min à vitesse maximale (21 130 x g) et récolter le flux contenant de l’ADN génomique (environ 50 μl d’ADN au total). Stockez la colonne à -20 °C (au cas où une autre élution serait nécessaire plus tard).</li>
</ol>

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</ol>

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt financier concurrent.

Pour une extraction réussie de l’ADN et de l’ARN à partir des régions tissulaires d’intérêt, un carottage précis est essentiel. Ce protocole décrit l’utilisation d’un poinçon tissulaire pour isoler des carottes de 0,6 mm de diamètre et décrit le processus de transfert des notations des lames de microscope vers les blocs FFPET correspondants. Des modifications ont été apportées au protocole du fabricant pour extraire efficacement les acides nucléiques des carottes, qui sont environ 50 fois plus épaisses que les sections de microtome auxquelles le protocole était destiné. Étant donné que les carottes peuvent contenir plus de cire de paraffine que les sections de tissus, une déparaffinisation efficace des carottes par des étapes répétées de traitement au xylène et à l’éthanol a été nécessaire. Le succès des étapes de post-déparaffinisation dépendait d’une bonne homogénéisation mécanique des noyaux de tissus et d’une digestion efficace de la protéinase K. Une optimisation supplémentaire de la digestion de la protéinase K peut être effectuée.
Il convient de mentionner que cette méthode identifie les zones d’intérêt à la surface du bloc, telles qu’identifiées dans les lames d’histopathologie correspondantes. Comme la carotte prélève des tissus qui peuvent avoir une profondeur de 3 ou 4 mm, les utilisateurs de ce protocole peuvent s’inquiéter des cellules ou des tissus qui se trouvent sous la surface du bloc. Bien qu’il s’agisse d’une préoccupation légitime, de nombreuses études (examinées dans la référence27) ont démontré que les carottes de tissus représentent fidèlement les caractéristiques histologiques et moléculaires des blocs de tissus pathologiques, en particulier lorsque des carottes en double ou en trois exemplaires sont échantillonnées dans la zone d’intérêt.
Comme le kit d’extraction commerciale modifié adopté dans ce protocole permet l’extraction simultanée de l’ADN et de l’ARN à partir du même tissu, le protocole permet de conserver du matériel biologique précieux et permet une comparaison directe entre les deux acides nucléiques résultants à partir du même échantillon. L’extraction simultanée de l’ARN et de l’ADN réduit de moitié le travail et l’épuisement des tissus, et permet une analyse intégrée précise de l’expression des gènes, ainsi que des caractéristiques épigénétiques et génétiques de l’ADN. Étant donné que les rendements de l’ARN et de l’ADN de ces carottes de tissus représentatives dépassent généralement 600 et 300 ng, respectivement, et que la plupart des applications actuelles de PCR et de séquençage de nouvelle génération nécessitent généralement 10 à 100 ng, la plupart des échantillons purifiés par ce protocole devraient fournir du matériel adéquat pour plusieurs tests en aval. Il a été démontré que ce protocole est reproductible dans des laboratoires indépendants (Selvarajah et al., In Prep.). L’ARN de ce protocole était de qualité suffisante pour l’analyse de l’expression génique à l’aide de la RT-PCR ou d’une plateforme multianalyte populaire, et l’ADN s’est bien comporté dans les tests PCR spécifiques à la méthylation. Des études futures visant à évaluer l’utilité des acides nucléiques récupérés dans le séquençage de la prochaine génération sont justifiées.
Ainsi, plusieurs modifications ont été apportées à un protocole disponible dans le commerce, conçu pour les coupes minces de FFPET, le rendant adapté à la co-extraction d’ARN et d’ADN à partir de carottes de FFPET de 0,6 mm. Le protocole a démontré des rendements constamment élevés dans une grande cohorte d’échantillons de cancer de la prostate et dans un ensemble limité d’échantillons de cancers du sein, du cerveau et de la vessie. Dans l’ensemble, le protocole devrait permettre aux utilisateurs d’effectuer des analyses génétiques ciblées de grandes collections de tissus bien annotées. Il est important de noter que le protocole permet un échantillonnage ciblé efficace des régions d’intérêt dans le FFPET, un temps de manipulation relativement faible et des rendements suffisamment élevés pour la plupart des applications en aval.

La recherche de biomarqueurs génomiques cherche à identifier les corrélats moléculaires qui reflètent avec précision et de manière fiable l&#39; état ​​de la maladie, et le font d&#39;une manière cliniquement utile. 1 Le développement Biomarker est tributaire de l&#39; analyse rétrospective des échantillons de tissus bien annotés. des échantillons de tissus malades et normaux sont stockés soit le tissu frais congelé dans des biobanques spécialisées ou tissu enrobé de paraffine (FFPET) blocs fixés au formol dans les archives cliniques. Les tissus frais congelé permet l&#39;extraction des acides nucléiques de haute qualité et a été largement utilisé dans les études de découverte de biomarqueurs génomiques. 2,3 Cependant, moins d&#39; échantillons de tissus sont disponibles dans les biobanques et à étudier un tel tissu introduit un biais vers des échantillons plus larges, des catégories inhabituelles de la maladie, et les patients vus dans des centres spécialisés avec une plus grande capacité au tissu bancaire. 4 FFPET, en revanche, est la méthode de stockage par défaut pour les tissus humains et animaux malades. Bien que les blocs FFPET maintiennent m cellulaireorphology, le processus de fixation des liens croisés autres constituants cellulaires à des acides nucléiques. ARN et l&#39; ADN réticulé sont recouvrables, mais seulement dans des formes dégradées, très fragmentées. 5,6 Cependant, ces fragments d&#39;ADN et d&#39; ARN se prêtent à une analyse par un éventail croissant de tests, y compris l&#39; expression de l&#39; ARNm, l&#39; ADN hypermethylation, et le séquençage ciblé. 7,8 pour exploiter cette occasion dans la grande quantité et variété de FFPET disponible pour la recherche, il existe un besoin pour un protocole d&#39;extraction efficace et fiable. Une grande partie de la recherche de marqueurs biologiques dans le tissu se concentre sur le cancer. Comme d&#39;autres types de tissus malades, le tissu cancéreux se manifeste souvent hétérogénéité régionale importante en matière de préservation des cellules et le type de cellule. Puisque la recherche de marqueurs biologiques repose sur la capacité à corréler constituants du tissu malade avec des caractéristiques moléculaires, une étape critique de ce processus est la récolte précise du tissu qui est bien préservé et enrichi pour la dalad ie l&#39;étude. Dans FFPET, deux techniques d&#39;enrichissement sont souvent utilisées: microdissection par capture laser (LCM), et la coupe du microtome. LCM permet fortement axé la récolte des tissus et peut être utilisé pour isoler des types cellulaires spécifiques, bien conservés dans les tissus hétérogènes. 9,10 Cependant, LCM nécessite un équipement coûteux et est extrêmement laborieuse , pour un grand nombre d&#39;échantillons. Tronçonnage Microtome est un processus plus largement utilisé où les sections minces sont découpées à partir de blocs FFPET. 11,12 sections Microtome coupées comprennent souvent un tissu qui est hétérogène dans la préservation de la cellule (par exemple, par rapport à nécrotique bien conservé) et de la composition (par exemple, le cancer vs. parenchyme bénigne), et peut donc conduire à l&#39;homogénéisation des caractéristiques moléculaires meilleurs étudiés séparément. Par conséquent, il existe un besoin pour un procédé à haut débit, qui enrichit les cellules d&#39;intérêt. Une troisième méthode, l&#39;isolement des acides nucléiques à partir des noyaux de FFPET, fournit cet enrichissement, convient pour une grande throughput protocoles, et a été utilisé par d&#39; autres pour isoler l&#39; ARN ou de l&#39; ADN à partir de noyaux de tissus séparés. 7,13,14 Un certain nombre de protocoles publiés de préciser les méthodes d&#39;extraction d&#39; acides nucléiques à partir de FFPET (tableau 1). Cependant, les protocoles où l&#39; ARN et l&#39; ADN sont extraits du même tissu ont été optimisés pour des coupes de tissus microtome, mais pas pour les cœurs de tissu. 15,16 protocoles De même, publiés qui offrent une spécificité accrue de tissus, soit par des noyaux de tissus ou microdissections de diapositives, spécifier les procédures pour l&#39; extraction de l&#39; ADN, mais pas l&#39; ARN. 7,17 ici, un protocole optimisé pour une double extraction à la fois de l&#39; ADN et de l&#39; ARN à partir du même cœur de tissu est démontrée. noyaux de tissus sont récoltés en insérant microarray de tissu (TMA) poinçons dans des régions d&#39;intérêt mappés sur des blocs de FFPET. La mise en correspondance est effectuée en annotant une lame de microscope avec un stylo marqueur et transférer l&#39;annotation à la surface correspondante de la FFPEBloc de T (figure 1). Des travaux antérieurs qui ont conduit à l&#39;élaboration de ce protocole comprenait une comparaison de plusieurs systèmes d&#39;extraction d&#39;acide nucléique disponibles dans le commerce. Dans cette comparaison, les modifications des protocoles commerciaux, tels que décrits ci - après à condition que les ADN et ARN plus hauts rendements et de la qualité (Selvarajah et al., En préparation). Carottes de tissu sont plus épaisses que les sections de 5 à 10 microns um typiquement utilisés dans des protocoles d&#39;extraction FFPET 11,12,14,18 - 20, et peuvent contenir des quantités variables de plus de paraffine. Pour compenser cela, déparaffinage a été renforcée par la répétition des traitements de xylène et l&#39; éthanol et en introduisant une étape d&#39;homogénéisation motorisé (Figure 1). Par ailleurs, la protéinase K temps de digestion ont été allongées pour augmenter le rendement de l&#39;ADN. Dans l&#39;ensemble, ce protocole est rentable et permet l&#39;établissement de liens entre les caractéristiques moléculaires et histopathologiques de la maladie dans large, populations bien caractérisées. Le protocole dans son intégralité peut être effectuée de manière fiable dans les 2 jours, y compris 3 heures de mains sur le temps, avec peu de besoin d&#39;équipement spécialisé ou coûteux. Le protocole étape par étape est ci-après comme une version modifiée du protocole du fabricant. 21 S&#39;il vous plaît voir le tableau des matériaux / équipement pour les réactifs spécifiques, l&#39; équipement et les fabricants.

<table><tbody><tr><td>Film de paraffine en plastique, « Parafilm 'M'"</td><td>Bemis&nbsp ;</td><td>RK-06720-40</td><td>Tout film de paraffine générique fonctionnera comme un substitut</td></tr> de <tr><td>l’hypochlorite de sodium, « Ultra Bleach"</td><td>De même</td><td>53-2879-2</td><td>Tout agent de blanchiment générique fonctionnera comme un substitut. Matière dangereuse pouvant provoquer des brûlures au contact.</td></tr><tr><td>L’éthanol absolu de qualité biologique</td> moléculaire <td>Fisher BioReagents</td><td>BP2818-500</td><td>Sigma-Aldrich E7023 suffit comme substitut</td></tr><tr><td>Grade moléculaire H2O</td><td>G-Biosciences</td><td>786-293</td><td>Sigma W4502 suffit, ainsi que toute autre marque de set de poinçons H2O</td></tr><tr><td>0,6 mm de qualité moléculaire pour Beecher Instruments.</td><td>Estigen</td><td>MPO6[Jaune]</td><td>Assurez-vous d’utiliser le poinçon récepteur rouge de l’ensemble</td></tr><tr><td>Marqueur permanent à pointe fine</td><td>Sharpie</td><td>10365796S</td><td>L’utilisation du marqueur sur les tissus FFPE le fait sécher rapidement, de sorte que plusieurs peuvent être nécessaires</td></tr><tr><td>Bloc</td><td></td><td></td><td></td>de tissu FFPE</tr><tr><td>Lame de tissu colorée correspondant au bloc</td><td></td><td></td><td></td>FFPE</tr><tr><td>1,5 ml Micro-Tubes à centrifuger</td><td>Fisher BioReagents</td><td>05-408-137</td><td></td></tr><tr><td>2,0 ml Tubes à faible liaison (tubes à micro-centrifugeuse LoBind)</td><td>Eppendorf</td><td>22431048</td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml Tubes à faible liaison (tubes à micro-centrifugeuse LoBind)</td><td>Eppendorf</td><td>22431021</td><td></td></tr><tr><td>Histologie Xylene</td><td>VWR</td><td>CA 95057-822</td><td>Fisher Scientific X5-500 suffit comme substitut</td></tr><tr><td>Biologie moléculaire Grade 2-Propanol</td><td>Sigma</td><td>I9516</td><td></td></tr><tr><td>AllPrep FFPE DNA/RNA Kit&nbsp ;</td><td>Qiagen</td><td>80234</td><td>Préparer les tampons selon l’ADN/ARN AllPrep FFPE Handbook21</td></tr><tr><td>Buffers : RLT, FRN, RPE, ATL, AL, AW1, AW2, DNaseI solution</td><td>Qiagen</td><td>80234</td><td>Préparer les tampons selon l’ADN/ARN AllPrep FFPE Handbook21</td></tr><tr><td>Temperature stable proteinase K</td><td>Qiagen</td><td>80234</td><td></td></tr><tr><td>Protéinase K à haute puissance</td><td>Invitrogen</td><td>25530-049</td><td>Invitrogen 25530-015 suffit comme solution neutralisante de substitution</td></tr><tr><td>à base d’ARNase (Rnase AWAY)</td><td>Molecular BioProducts</td><td>7003</td><td></td></tr><tr><td>RNaseA 100 mg/ml</td><td>Qiagen</td><td>19101</td><td></td></tr><tr><td>BD Integra Seringue 3 ml 21G x 1/2</td><td>BD&nbsp ;</td><td></td><td></td>305274</tr><tr><td>Homogénéisateur de tissus motorisé (TissueRuptor)</td><td>Qiagen&nbsp ;</td><td>9001271</td><td>Fisher Scientific 14-261-29 suffit comme substitut-20</td></tr> <tr><td>&deg ; C et -80 &deg ; C Congélateur de laboratoire</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micro-centrifugeuse avec rotor pour tubes</td><td></td><td></td><td></td>de 2 ml</tr><tr><td>Mélangeur</td><td></td><td></td><td></td>Vortex numérique</tr><tr><td>Pipettes et pointes</td><td></td><td></td><td></td>de filtre</tr><tr><td>Blocs chauffants ou bains-marie Chlorhydrate</td><td></td><td></td><td></td></tr> de <tr><td>Tris&nbsp ;</td><td>Amresco</td><td>0234</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de sodium&nbsp ;</td><td>Amresco</td><td>0241</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de magnésium anhydre</td><td>Sigma</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>Dodécylsulfate</td><td>de sodium Sigma</td><td>L4509</td><td></td></tr><tr><td>Acrodisc 25 mm filtres à seringue avec 0,45 &#181 ; m Supor membrane</td><td>Pall</td><td>PN 4614</td><td></td></tr><tr><td>Seringue avec aiguille rétractable BD PrecisionGlide 3 ml</td><td>BD Integra</td><td>305274</td><td></td></tr><tr><td>Acide chlorhydrique</td><td>BDH</td><td>3026</td><td></td></tr><tr><td>Plateforme d’expression génique multianalyte (nCounter &reg ; Plateforme</td> <td>Nanostring nCounter,</td><td></td><td></td></tr><tr><td>quantification fluorométrique des acides nucléiques (kit de dosage HS Qubit dsDNA et Qubit&reg ; Kit de dosage de l’ARN BR)</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

préparation de cores de tissus enrobés de paraffine fixés au formol pour les arn et d&#39;extraction d&#39;adn

Preparation of Formalin-fixed Paraffin-embedded Tissue Cores for both RNA and DNA Extraction

Le tissu inclus dans la paraffine fixé au formol (FFPET) représente un substrat précieux et bien annoté pour les investigations moléculaires. L’utilité du FFPET dans l’analyse moléculaire est compliquée à la fois par la composition hétérogène des tissus et les faibles rendements lors de l’extraction des acides nucléiques. Une recherche documentaire a révélé qu’il y avait peu de protocoles abordant ces questions, et qu’aucun n’offrait de méthode validée pour l’extraction simultanée de l’ARN et de l’ADN à partir de régions d’intérêt pour le FFPET. Cette méthode résout ces deux problèmes. La spécificité tissulaire a été obtenue en cartographiant les zones cancéreuses d’intérêt sur des lames de microscope et en transférant les annotations sur des blocs FFPET. Des carottes de tissus ont été prélevées dans des zones d’intérêt à l’aide de poinçons de 0,6 mm. L’extraction des acides nucléiques a été réalisée à l’aide d’un système d’extraction commercial FFPET, avec des modifications aux étapes d’homogénéisation, de déparaffinisation et de digestion de la protéinase K pour améliorer la digestion des tissus et augmenter les rendements en acides nucléiques. Le protocole modifié produit une quantité et une qualité suffisantes d’acides nucléiques pour être utilisés dans un certain nombre d’analyses en aval, y compris une plateforme d’expression génique multi-analytes, ainsi que l’analyse PCR en temps réel de l’expression de l’ARNm couplée à la transcriptase inverse et l’analyse PCR spécifique à la méthylation (MSP) de la méthylation de l’ADN.

Ce protocole d’extraction modifié améliore les rendements en ARN et en ADN à partir de régions d’intérêt plus précisément ciblées dans les blocs de tissus histopathologiques.

Préparation de Cores de tissus enrobés de paraffine fixés au formol pour les ARN et d&#39;extraction d&#39;ADN

Formalin-fixed paraffin embedded tissue (FFPET) represents a valuable, well-annotated substrate for molecular investigations. The utility of FFPET in ...

L'objectif général de cette procédure est d'extraire séquentiellement l'ARN et l'ADN à partir de carottes tissulaires archivées fixées au formol et incluses en paraffine. Il s'agit d'un protocole de prélèvement de carottes tissulaires à partir desquelles nous extrairons à la fois l'ARN et l'ADN. Le principal avantage de ce protocole est qu'il améliore les rendements en ARN et en ADN provenant de régions précisément ciblées dans le bloc tissulaire.Cette procédure a été principalement développée à partir de tissus archivés de cancer de la prostate. Elle peut également être appliquée à d'autres types de tissus archivés. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car les étapes de prélèvement de carottes tissulaires ne sont pas couramment utilisées dans les laboratoires de recherche.La plupart des laboratoires de recherche utilisent plutôt des coupes transversales, ce qui épuise plus rapidement les tissus et ajoute une hétérogénéité significative à l'échantillon. Commencez par examiner la lame de microscope et délimitez la région d'intérêt à l'aide d'un marqueur permanent à pointe fine. Ensuite, découpez un morceau de film de paraffine suffisamment grand pour couvrir la région d'intérêt sur la lame de microscope.Ensuite, placez fermement le film sur la lame, en repliant le film sur les bords pour l'empêcher de glisser. À l'aide d'un marqueur indélébile à pointe fine, délimitez entièrement le tissu et la région d'intérêt à l'intérieur du tissu. Puis, retirez le film de la lame et transférez-le vers le bloc de tissu correspondant.Orientez le film en le retournant ou en le faisant pivoter de manière à ce que le contour de l'ensemble du tissu corresponde à la forme observée du tissu dans le bloc. Appuyez fermement la partie du film contre la surface du bloc afin d'éviter tout déplacement. À l’aide de la pointe du marqueur indélébile, faites des indentations légères mais visibles le long du contour de la région d’intérêt, puis retirez le film.Ensuite, nettoyez le poinçon récepteur du jeu de poinçons de 0,6 millimètre en immergeant l'extrémité dans un tube microcentrifuge de 1,5 millilitre contenant un millilitre d'eau de Javel et en déplaçant le poinçon plusieurs fois vers le haut et vers le bas. Répétez le lavage avec le tube contenant de l'éthanol à 70 pour cent, puis de l'eau. Ensuite, enfoncez le poinçon propre dans la région d'intérêt sur une profondeur de trois millimètres et retirez-le.Libérez le fragment dans un tube de microcentrifugeuse à faible liaison en le poussant hors du poinçon à l’aide du stylet. Ajoutez un millilitre de xylène dans les tubes de microcentrifugeuse contenant les fragments de tissu et vortexez vigoureusement pendant dix secondes. Incubez ensuite dans un bloc chauffant réglé à 50 degrés Celsius pendant trois minutes.Après l'incubation, centrifuger pendant deux minutes à température ambiante à vitesse maximale. Après la centrifugation, placer les cœurs sur de la glace pendant cinq minutes afin de solidifier le résidu cireux. Ensuite, retirer soigneusement le paraffine accumulé autour du ménisque ainsi que le surnageant à l’aide d’une pointe de pipette.Ensuite, répétez le traitement au xylène. Après avoir éliminé le mélange de xylène et de paraffine, ajoutez un millilitre d'éthanol à 100 % et vortexez vigoureusement pendant dix secondes. Après une centrifugation à vitesse maximale pendant deux minutes, éliminez soigneusement l'éthanol.Répétez une fois encore le lavage à l'éthanol avant de commencer l'homogénéisation. Resuspendez les cœurs déparaffinisés dans 700 microlitres d'éthanol à 100 pour cent avant l'homogénéisation. Utilisez un homogénéisateur tissulaire motorisé sur un réglage moyen pour broyer les cœurs en fines particules.Une homogénéisation complète des carottes de tissu est nécessaire pour obtenir un rendement optimal en ADN et en ARN. Ensuite, remplissez des tubes séparés de 15 millilitres avec environ dix millilitres d'eau de javel, de solution neutralisante des ARNases et d'éthanol à 70 pour cent. Après l'homogénéisation des échantillons, lavez la sonde de l'homogénéisateur dans chacune des solutions de nettoyage, dans l'ordre indiqué.Faites fonctionner l'homogénéisateur à la vitesse maximale pendant l'étape de lavage. Essuyez la sonde avec un mouchoir en papier et laissez-la sécher complètement avant d'homogénéiser l'échantillon suivant. Inspectez visuellement les lames de la sonde à la recherche de fragments de tissu résiduels et, s'il y en a, nettoyez à nouveau la sonde.Après homogénéisation, ajuster le volume de l'échantillon à un millilitre avec de l'éthanol à 100 %, puis centrifuger à vitesse maximale pendant 15 minutes. Aspirer soigneusement l'éthanol et sécher les culots à l'air pendant environ 15 à 20 minutes avant de commencer l'extraction par la protéinase K. Resuspendre les culots dans 150 microlitres de tampon de digestion à protéinase K et agiter doucement les tubes pour détacher le culot.Une digestion par la protéinase K pendant la nuit est recommandée pour une récupération d'ADN plus élevée. Ajouter 10 microlitres de protéinase K thermostable et mélanger en agitant doucement. Incuber à 56 degrés Celsius pendant 15 minutes avec une agitation douce.Incuber les tubes sur de la glace pendant trois minutes. Après refroidissement, centrifuger le tube pendant 15 minutes à vitesse maximale. Ensuite, sans perturber les culots, transférer soigneusement chaque surnageant dans un nouveau tube microcentrifuge pour la purification de l'ARN.Extraire l'ARN et l'ADN en utilisant la procédure optimisée décrite dans le protocole écrit, qui inclut un temps de digestion tissulaire prolongé pour l'extraction de l'ADN. Cette méthode permet de récupérer de l'ARN et de l'ADN à partir d'échantillons anciens de tissus fixés au formol et inclus en paraffine. Les acides nucléiques ont été coextraits à partir d'échantillons de cancer de la prostate dont l'âge variait de trois à quatorze ans.Le rendement moyen était de 2 270 nanogrammes d'ARN et de 820 nanogrammes d'ADN. Fait intéressant, aucune corrélation significative n'a été observée entre l'âge de l'échantillon de tissu et la récupération des acides nucléiques. Dans l'ensemble, les rendements en ARN et en ADN étaient corrélés entre les échantillons, bien que dans la plupart des cas, plus du double de quantité d'ARN ait été récupéré par rapport à l'ADN. Pour démontrer les performances de l'ADN génomique extrait selon ce protocole, des extraits d'ADN convertis par bisulfite provenant d'échantillons archivés de cancer de la prostate ont été amplifiés par PCR spécifique de la méthylation. Les éléments répétitifs ALU ont été utilisés comme contrôle de méthylation et ont montré peu de variation entre les échantillons. GSTP1, un gène connu pour être hyperméthylé dans le cancer de la prostate, n'a montré aucune amplification détectable par PCR spécifique de la méthylation lorsque l'ADN extrait d'échantillons bénins a été utilisé.Les échantillons d'ADN provenant de patients atteints d'un cancer de la prostate agressif présentaient des valeurs de seuil de cycle en QPCR détectables inférieures à celles des cellules de cancer de la prostate indolent, indiquant une méthylation accrue de GSTP1 dans le cancer de la prostate agressif. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en trois à quatre heures pour l'ARN, et, après une digestion nocturne, en quatre heures pour l'ADN si elle est effectuée correctement. Cette technique devrait permettre aux chercheurs en pathologie moléculaire d'explorer des biomarqueurs diagnostiques d'ADN et d'ARN dans divers types de cancer.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la préparation des carottes tissulaires pour l'extraction d'ADN et d'ARN à partir de zones d'intérêt précisément localisées dans des blocs tissulaires archivés.

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