Comparaison de tabac Méthodes hôte cellulaire Protein suppression par Blanchir plantes intactes ou par traitement thermique des extraits
8 août 2016
Trois chaleur des procédés de précipitation sont présentées qui éliminent efficacement plus de 90% des protéines de la cellule hôte (SPH) de tabac extrait avant toute autre étape de purification. L'usine RSG agréger de manière irréversible à des températures supérieures à 60 ° C.
L'objectif général de cette série d'expériences est de précipiter les protéines des cellules hôtes végétales par chauffage, facilitant ainsi la purification chromatographique ultérieure des protéines biopharmaceutiques recombinantes. Cette méthode peut contribuer à simplifier le développement du procédé et à améliorer la stabilité du produit, par exemple en activant les protéases de l'hôte.
Le principal avantage de cette technique est qu'elle est facile à intégrer aux protéases existantes et peut être rapidement adaptée à différentes protéines cibles. La procédure sera démontrée par Hannah Gruchow, une étudiante en master de mon laboratoire. Pour précipiter thermiquement les protéines des cellules hôtes.
Par exemple à partir de feuilles de tabac. Après avoir cultivé les plantes de tabac selon le protocole décrit, préparez un bain d'eau d'un volume de travail de huit litres dans un seau en mousse de polystyrène isolé thermiquement. Transférez l'ensemble sur une plaque d'agitation magnétique, puis placez un barreau aimanté dans le bain d'eau.
Ensuite, entourez la barre d'agitation avec une plaque de support non magnétique, en la plaçant au-dessus de la barre d'agitation d'environ un centimètre. C'est sur cette plaque que sera posé ultérieurement un panier en polypropylène pendant la procédure. Ajoutez huit litres de tampon dans le bain d'eau.
Ensuite, placez un panier en polypropylène de 23 sur 23 sur 23 centimètres sur les carreaux de support. Veillez à ce que le support n'entrave pas la rotation de l'agitateur magnétique et que le panier soit entièrement immergé dans le liquide. Retirez ensuite le panier.
Utilisez un thermostat réglable pour porter le bain-marie à 70 degrés Celsius. Attendez au moins 15 minutes après avoir atteint la température souhaitée afin de vous assurer que l'ensemble de l'appareil a atteint l'équilibre thermique. Ensuite, préparez des aliquotes de 150 grammes à partir des feuilles de tabac.
Placer un aliquot dans le panier en évitant toute compression irréversible et tout dommage aux feuilles, par exemple en les déchirant. Plonger soigneusement mais rapidement le panier dans le liquide chaud et le poser sur les carreaux-supports.
Ensuite, placez un bloc en acier inoxydable sur le dessus du panier afin d'empêcher la flottaison. Incubez les feuilles pendant cinq minutes dans le liquide de blanchiment. Ou sélectionnez une durée adaptée au dispositif expérimental.
Surveillez la température du liquide pendant toute la période d'incubation. Après l'incubation, retirez soigneusement le panier du liquide de blanchiment et laissez les feuilles s'égoutter pendant 30 secondes. Ensuite, sortez les feuilles de la plante du panier, transférez-les dans le mélangeur et démarrez immédiatement l'extraction conformément aux protocoles décrits dans le texte.
Chauffer par précipitation les PCH dans un récipient agité. Placer un bain-marie sur une plaque d'agitation magnétique et insérer un récipient en acier inoxydable de deux litres dans le bain-marie de manière à aligner le centre du récipient avec le centre de la plaque d'agitation. Placer un barreau d'agitation magnétique dans le récipient en acier inoxydable.
Remplir le récipient avec le tampon d'extraction. Ensuite, avec l'eau déionisée. Remplir le bain-marie jusqu'à cinq centimètres sous le bord supérieur du récipient en acier inoxydable.
Utilisez un couvercle en mousse de polystyrène pour le recouvrir. Ensuite, insérez un thermomètre dans le récipient en acier inoxydable à travers un orifice ménagé dans le couvercle. Réglez ensuite la température du bain-marie à 78 degrés Celsius et incubez l'ensemble pendant 15 minutes afin d'atteindre l'équilibre thermique.
Lorsque l'assemblage a atteint l'équilibre, vider le récipient et verser 300 millilitres d'extrait dans le récipient pendant qu'il est encore dans le bain-marie, puis démarrer le chronomètre. Agiter l'extrait à 150 tr/min tout en l'incubant pendant cinq minutes. S'assurer que l'extrait atteint une température de 70 degrés Celsius pendant au moins deux minutes durant la période d'incubation.
Après l'incubation, retirez le bain-marie de l'agitateur magnétique. Sortez le récipient en acier inoxydable et placez-le dans un seau contenant de l'eau glacée. Ensuite, posez le seau sur la plaque d'agitation.
Veillez à ce que l'homogénat végétal soit bien agité à 150 tr/min. Placez le thermomètre dans l'extrait et incubez-le jusqu'à ce qu'il atteigne une température de 20 degrés Celsius ou la température spécifiée. Après avoir préparé deux bains-marie d'un volume de travail de huit litres conformément au protocole décrit dans le texte, utilisez de l'eau déionisée pour remplir le premier bain.
Régler le thermostat à 74,5 degrés Celsius et incuber l'assemblage pendant 15 minutes afin d'atteindre l'équilibre thermique. Préparer un récipient de stockage isolé en plaçant un bécher en plastique de 0,5 litre dans un bécher en plastique d'un litre. Utiliser un matériau isolant, tel que de la ouate de coton, pour combler les espaces vides.
À l'aide d'un tube LS24, reliez l'échangeur de chaleur à une pompe péristaltique à une extrémité, et à un tuyau de sortie à l'autre extrémité. Placez les deux extrémités du tube ainsi que le thermomètre dans le récipient isolé. Et remplissez-le avec 300 millimètres de tampon d'extraction.
Ensuite, placez l'échangeur de chaleur dans le bain-marie chaud et démarrez la pompe péristaltique à un débit de 300 millilitres par minute. Après trois minutes, vérifiez que la température résultante dans le récipient est de 70 degrés Celsius, soit environ 4,5 degrés Celsius en dessous du point de consigne du bain-marie.
Jetez le tampon d'extraction provenant du récipient isolé et préparez des aliquotes de 300 millilitres d'extrait végétal. Ensuite, à l'aide d'une aliquote, remplissez le récipient isolé. Faites maintenant circuler l'extrait végétal à travers l'échangeur thermique à un débit de 300 millilitres par minute pendant cinq minutes.
Ensuite, s'assurer que la température de l'extrait est de 70 degrés Celsius après trois minutes ou correspond à la température prévue dans le plan expérimental. Après cinq minutes, transférer l'échangeur de chaleur dans un bain d'eau glacée. S'assurer que la température de l'extrait est inférieure à 30 degrés Celsius avant de poursuivre.
Retirez le tuyau d'entrée relié à la pompe péristaltique du récipient isolé. Poursuivez le pompage afin de récupérer l'extrait végétal précipité par la chaleur résiduelle présent dans l'échangeur thermique. Ensuite, arrêtez la pompe.
Pour effectuer la filtration en sac de l'extrait végétal, montez un filtre en sac dans le panier de support correspondant inséré dans le boîtier de filtration. Placez un récipient d'un litre sous le panier et appliquez les aliquotes d'extrait sur le sac à un débit de 150 millilitres par minute. Après filtration, utilisez un turbidimètre pour mesurer la turbidité d'une dilution au 1/10 du filtrat dans le tampon d'extraction.
Prélevez une aliquote d'un millilitre et traitez le filtrat du sac, par exemple par filtration en profondeur et chromatographie. Analysez ensuite l'échantillon conformément au protocole décrit dans le texte.
La précipitation thermique des protéines des cellules hôtes par blanchiment réduit les protéines solubles totales (PST) de 96 ± 1 pour cent. Le blanchiment a permis de récupérer jusqu'à 83 ± 1 pour cent de DsRed et 51 pour cent de la protéine cible Vax8. Cela augmente sa pureté de 0,1 pour cent à 1,2 pour cent avant la séparation chromatographique.
La capacité de filtration a diminué à des températures de blanchiment supérieures à 63 degrés Celsius. Ce problème peut être résolu en ajoutant des floculants après l'extraction des protéines et des aides à la filtration après la filtration par sac. Un récipient agité utilisé pour la précipitation thermique a éliminé un maximum de 84 ± 1 pour cent des HCP.
Obtention d'une pureté de 0,33 ± 0,02 pourcent pour Vax8 et de 20,2 ± 1,4 pourcent pour DsRed. Contrairement au blanchiment et au système d'échangeur de chaleur, la précipitation des HCP dans un récipient augmente la capacité de filtration en profondeur en aval de 2,5 fois. Cela reflète les forces de cisaillement plus faibles dans le récipient par rapport au pompage de l'extrait à travers l'échangeur de chaleur ou à l'homogénéisation après le blanchiment.
Environ 88,3 ± 0,7 pour cent de la teneur en protéines cellulaires hôtes a été régulièrement éliminé de l'extrait à l'aide d'un échangeur thermique entre 60 et 70 degrés Celsius. Une pureté de 0,31 ± 0,01 pour cent a été obtenue pour Vax8, et de 27,6 ± 2,0 pour cent pour DsRed.
Enfin, l'échangeur thermique a également atteint la capacité la plus faible du filtre profondeur en aval, ne clarifiant que 13,5 ± 6,0 litres par mètre carré avant colmatage. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en moins de 50 minutes supplémentaires par échantillon si elle est effectuée correctement.
Lors de l'application de cette méthode, il est important de s'assurer que la protéine cible est thermostable. Après cette procédure, d'autres méthodes telles que la chromatographie peuvent être réalisées afin de purifier davantage le produit au niveau requis. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine des plantes, en leur offrant une technologie pour explorer la purification de protéines candidates vaccinales et d'espèces de Nicotiana.
Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment précipiter les protéines des cellules hôtes végétales à l’aide d’un traitement thermique, d’un récipient agité ou d’un échangeur de chaleur.
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Aperçu
Cette étude présente trois méthodes de précipitation par la chaleur qui éliminent efficacement plus de 90 % des protéines des cellules hôtes (HCP) des extraits de tabac. Ces méthodes facilitent les étapes de purification ultérieures des protéines biopharmaceutiques recombinantes.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Biotechnologie
- Purification des protéines
- Développement pharmaceutique
Contexte
- Les protéines de la cellule hôte peuvent interférer avec la purification des protéines recombinantes.
- La précipitation thermique est une technique utilisée pour éliminer les protéines indésirables.
- L'élimination efficace des PCH est essentielle pour la stabilité du produit.
- Cette méthode peut être adaptée à diverses protéines cibles.
Objectif de l'étude
- Développer une méthode de précipitation des protéines des cellules hôtes végétales par la chaleur.
- Optimiser le développement du procédé pour les biopharmaceutiques recombinants.
- Améliorer la stabilité du produit final.
Méthodes utilisées
- Précipitation thermique des extraits de tabac.
- Contrôle de la température pour induire l'agrégation des protéines.
- Techniques ultérieures de purification chromatographique.
- Démonstration par un étudiant en master au laboratoire.
Résultats principaux
- Plus de 90 % des protéines cellulaires hôtes ont été éliminés des extraits.
- Le traitement thermique a efficacement agrégé les protéines cellulaires hôtes végétales au-dessus de 60 °C.
- La méthode est facile à mettre en œuvre et adaptable.
- A facilité la purification des protéines recombinantes.
Conclusions
- La précipitation par chaleur est une méthode viable pour l'élimination des protéines cellulaires hôtes.
- Cette technique peut améliorer l'efficacité des procédés de purification des protéines.
- Des études ultérieures pourraient explorer son application à d'autres protéines.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
La contamination par les protéines d'hôte cellulaire (HCP) demeure un goulot d'étranglement critique dans la purification des produits biopharmaceutiques, en particulier dans les systèmes d'expression à base de plantes où des charges élevées en HCP nuisent à l'efficacité chromatographique. Cette étude évalue trois méthodes reproductibles de précipitation thermique — le blanchiment de feuilles de tabac entières, le traitement en réacteur agité et le traitement par échangeur de chaleur — afin d'agréger sélectivement et d'éliminer les HCP à des températures supérieures à 60 °C, améliorant ainsi les résultats de purification en aval. En permettant une plus grande pureté de la protéine cible avant la chromatographie, ces approches favorisent l'intensification du procédé, réduisent la consommation de tampon et renforcent la robustesse globale de la fabrication de vaccins candidats et de protéines thérapeutiques produites dans des plantes.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Découverte précoce et validation de cibles
- Valeur scientifique : Permet l'évaluation fonctionnelle des protéines cibles en réduisant les interférences des protéines d'origine hôte lors des étapes précoces des protocoles de purification.
- Valeur opérationnelle : Fournit une étape de clarification rapide, basée sur la chaleur, compatible avec le criblage d'expression à petite échelle chez Nicotiana spp.
Développement de criblages et de tests
- Valeur scientifique : Génère des extraits clarifiés avec une réduction du fond de protéines cellulaires hôtes (HCP), améliorant les rapports signal/bruit dans les immunoessais ultérieurs et les mesures d'activité.
- Valeur opérationnelle : Standardise la préparation des matières premières pour assurer une performance chromatographique constante entre les répétitions.
Recherche translationnelle et préclinique
- Valeur scientifique : Permet la production de candidats vaccins comme Vax8 avec une pureté améliorée, facilitant l'évaluation de l'immunogénicité et de la sécurité.
- Valeur opérationnelle : S'intègre aux procédés existants de récolte en perfusion ou par lots sans nécessiter de modification génétique de l'hôte.
Intégration du pipeline et du flux de travail
La précipitation par chaleur fonctionne comme une opération unitaire entre la récolte et la chromatographie, applicable aux flux de travail de protéines recombinantes à base de plantes, depuis la découverte précoce jusqu'à la production de lots précliniques.
- Biologie de la découverte : Réduit les interférences dues aux protéines d'hôte cellulaire (HCP) dans la détection de la protéine cible, facilitant la détection mécanistique et la réduction des risques associés aux candidats thérapeutiques.
- Criblage : Améliore la clarté et la filtrabilité des extraits, permettant un criblage fiable de la purification à haut débit.
- Analytique : Fournit des mesures quantifiables de la réduction des HCP (par exemple, élimination de 84 à 96 %) et des gains de pureté (par exemple, passage de DsRed de 0,1 % à 27,6 %) pour la comparaison des procédés.
- Recherche translationnelle : Préserve l'intégrité de la protéine cible (par exemple, Vax8, DsRed) après traitement, permettant la continuité vers la formulation et les tests d'efficacité.
- Réutilisation à l'échelle de l'entreprise : Adaptable à différents systèmes d'expression végétale et à diverses protéines cibles avec une révalidation minimale, favorisant une mise en œuvre au niveau du procédé standardisé.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Confiance prédictive dans les résultats de purification grâce à une élimination constante des protéines cellulaires hôtes (HCP) et à une réduction de l'encrassement chromatographique.
- Valeur opérationnelle : Augmente la capacité des filtres profonds en aval (jusqu'à 2,5 fois dans un récipient agité) et réduit la fréquence des échanges de tampon.
- Valeur stratégique : Réduit les risques de fabrication en éliminant précocement les impuretés du procédé, diminuant ainsi la probabilité d'échecs de lots en phase avancée.
- Impact sur le portefeuille : Permet une priorisation ajustée au risque des candidats d'origine végétale en améliorant les paramètres précoces de développement.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en contrôle des procédés thermiques et en évaluation de la stabilité des protéines afin d'éviter la dénaturation de la cible.
- Dépend de l'accès à des récipients thermostatisés, à des échangeurs de chaleur ou à des installations de blanchiment équipées d'un agitateur précis et d'un système de surveillance.
- Exige une standardisation du temps de blanchiment, de la température et de la géométrie du récipient entre différents sites pour une élimination reproductible des protéines cellulaires hôtes (HCP).
- Implique des compromis : le blanchiment peut réduire la capacité des filtres, tandis que l'utilisation d'échangeurs de chaleur pose des défis de nettoyage, malgré leur évolutivité.
- Requiert une optimisation empirique par plan d'expériences afin d'équilibrer l'élimination des HCP, le rendement du produit et la facilité de fonctionnement en aval pour chaque protéine cible.
