Name: Comparaison de tabac Méthodes hôte cellulaire Protein suppression par Blanchir plantes intactes ou par traitement thermique des extraits (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 6 s
Description: Découvrez trois méthodes de précipitation thermique pour éliminer plus de 90% des protéines cellulaires hôtes des extraits de tabac. Ces techniques facilitent la purification de protéines biopharmaceutiques recombinantes.

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Nous tenons à remercier le Dr Thomas Rademacher, Alexander Boes et Véronique Beiß pour avoir fourni les graines de tabac transgéniques, et Ibrahim Al Amedi pour la culture des plants de tabac. Les auteurs tiennent à remercier le Dr Richard M. Twyman pour son aide rédactionnelle ainsi que Güven Edgü pour avoir fourni la référence MSP1-19. Ce travail a été financé en partie par la subvention avancée du Conseil européen de la recherche ''Future-Pharma'', proposition numéro 269110, la Fraunhofer-Zukunftsstiftung (Fondation Fraunhofer Future) et les programmes internes Fraunhofer-Gesellschaft sous la subvention n°. Attirer 125-600164.

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<li>Buyel, J. F., Fischer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scale-down+models+to+optimize+a+filter+train+for+the+downstream+purification+of+recombinant+pharmaceutical+proteins+produced+in+tobacco+leaves%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+J%22%5BJournal%5D)">Scale-down models to optimize a filter train for the downstream purification of recombinant pharmaceutical proteins produced in tobacco leaves.</a> Biotechnol. J. 9, 415-425 (2014).</li>
<li>Buyel, J. F., Fischer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flocculation+increases+the+efficacy+of+depth+filtration+during+the+downstream+processing+of+recombinant+pharmaceutical+proteins+produced+in+tobacco%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Biotechnol.+J%22%5BJournal%5D)">Flocculation increases the efficacy of depth filtration during the downstream processing of recombinant pharmaceutical proteins produced in tobacco.</a> Plant Biotechnol. J. 12, 240-252 (2014).</li>
<li>Buyel, J. F., Opdensteinen, P., Fischer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellulose-based+filter+aids+increase+the+capacity+of+depth+filters+during+the+downstream+processing+of+plant-derived+biopharmaceutical+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+J%22%5BJournal%5D)">Cellulose-based filter aids increase the capacity of depth filters during the downstream processing of plant-derived biopharmaceutical proteins.</a> Biotechnol. J. 10, 584-591 (2014).</li>
<li>Buyel, J. F., Fischer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generic+chromatography-based+purification+strategies+accelerate+the+development+of+downstream+processes+for+biopharmaceutical+proteins+produced+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+J%22%5BJournal%5D)">Generic chromatography-based purification strategies accelerate the development of downstream processes for biopharmaceutical proteins produced in plants.</a> Biotechnol. J. 9, 566-577 (2014).</li>
<li>Buyel, J. F., Woo, J. A., Cramer, S. M., Fischer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+quantitative+structure-activity+relationship+models+to+develop+optimized+processes+for+the+removal+of+tobacco+host+cell+proteins+during+biopharmaceutical+production%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+A%22%5BJournal%5D)">The use of quantitative structure-activity relationship models to develop optimized processes for the removal of tobacco host cell proteins during biopharmaceutical production.</a> J. Chromatogr. A. 1322, 18-28 (2013).</li>
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<li>Buyel, J. F., Fischer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Downstream+processing+of+biopharmaceutical+proteins+produced+in+plants%3A+the+pros+and+cons+of+flocculants%5BTitle%5D)+AND+%22Bioengineered%22%5BJournal%5D)">Downstream processing of biopharmaceutical proteins produced in plants: the pros and cons of flocculants.</a> Bioengineered. 5, 138-142 (2014).</li>
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<li>Arfi, Z. A., Drossard, J., Hellwig, S., Fischer, R., Buyel, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyclonal+antibodies+can+effectively+detect+tobacco+host+cell+proteins+after+RuBisCO+depletion+and+endotoxin+removal%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+J%22%5BJournal%5D)">Polyclonal antibodies can effectively detect tobacco host cell proteins after RuBisCO depletion and endotoxin removal.</a> Biotechnol. J. , (2015).</li>
<li>Buyel, J. F., Gruchow, H. M., Boes, A., Fischer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rational+design+of+a+host+cell+protein+heat+precipitation+step+simplifies+the+subsequent+purification+of+recombinant+proteins+from+tobacco%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Eng.+J%22%5BJournal%5D)">Rational design of a host cell protein heat precipitation step simplifies the subsequent purification of recombinant proteins from tobacco.</a> Biochem. Eng. J. 88, 162-170 (2014).</li>
<li>Buyel, J. F., Fischer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+juice+extractor+can+simplify+the+downstream+processing+of+plant-derived+biopharmaceutical+proteins+compared+to+blade-based+homogenizers%5BTitle%5D)+AND+%22Process+Biochem%22%5BJournal%5D)">A juice extractor can simplify the downstream processing of plant-derived biopharmaceutical proteins compared to blade-based homogenizers.</a> Process Biochem. 50, 859-866 (2014).</li>
<li>Beiss, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heat-precipitation+allows+the+efficient+purification+of+a+functional+plant-derived+malaria+transmission-blocking+vaccine+candidate+fusion+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Heat-precipitation allows the efficient purification of a functional plant-derived malaria transmission-blocking vaccine candidate fusion protein.</a> Biotechnol. Bioeng. 112, 1297-1305 (2015).</li>
<li>Ma, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+approval+and+a+first-in-human+phase+I+clinical+trial+of+a+monoclonal+antibody+produced+in+transgenic+tobacco+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Biotechnol.+J%22%5BJournal%5D)">Regulatory approval and a first-in-human phase I clinical trial of a monoclonal antibody produced in transgenic tobacco plants.</a> Plant Biotechnol. J. 13, 1106-1120 (2015).</li>
<li>Mahajan, P. V., Caleb, O. J., Singh, Z., Watkins, C. B., Geyer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postharvest+treatments+of+fresh+produce%5BTitle%5D)+AND+%22Philos+T+R+Soc+A%22%5BJournal%5D)">Postharvest treatments of fresh produce.</a> Philos T R Soc A. 372, (2014).</li>
<li>Menzel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+blanching+reduces+the+host+cell+protein+content+and+substantially+enhances+the+recovery+and+stability+of+two+plant+derived+malaria+vaccine+candidates%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">Optimized blanching reduces the host cell protein content and substantially enhances the recovery and stability of two plant derived malaria vaccine candidates.</a> Front. Plant Sci. , (2015).</li>
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Les auteurs ont aucun conflit d&#39;intérêt à divulguer.

Les trois méthodes pour la précipitation de chaleur décrites ci - dessus peuvent éliminer efficacement RSG du tabac avant toute étape de purification chromatographique 16,17. Elles complètent d&#39; autres stratégies visant à accroître la pureté initiale du produit, par exemple, guttation 29, rhizosecretion 30 ou centrifuge extraction 31,32, qui sont limitées à des protéines sécrétées. Cependant, les méthodes basées sur la chaleur ne peuvent être utilisés d&#39;une ma...

Les systèmes de santé modernes dépendent de plus en plus sur les protéines biopharmaceutiques 1. La production de ces protéines dans les plantes est avantageuse en raison de la charge pathogène faible et une plus grande évolutivité par rapport aux systèmes d&#39;expression classiques 2-4. Cependant, le traitement en aval (DSP) de produits pharmaceutiques d&#39;origine végétale peut être difficile parce que les procédures d&#39;extraction perturbateurs se traduisent par une charge élevée de particules, dont la turbidité dépassant 5.000 unités néphélométriques de turbidité (NTU), et de la protéine de la cellule hôte (HCP) concentrations dépassant souvent 95 % [m / m] 5,6. Procédures de clarification Elaborate sont nécessaires pour éliminer les particules dispersées 7-9, mais l&#39; équipement de chromatographie est moins coûteux à exploiter en mode bind-et-éluent lors de la récupération initiale du produit s&#39;il y a une étape antérieure pour l&#39;élimination efficace des professionnels de la santé 10,11. Ceci peut être réalisé soit par précipitation de la protéine cible à l&#39;aide flocculfourmis 12 ou à faible pH 13,14, ainsi que par l&#39; origine du RSG pour agréger. L&#39;agrégation sélective de la ribulose-1,5-biphosphate carboxylase / oxygénase (RuBisCO), le HCP le plus abondant dans les plantes vertes telles que le tabac (Nicotiana tabacum), peut être favorisée par l&#39; addition de polyéthylène - glycol 15, mais ceci est coûteux et incompatible avec un grand fabrication -scale. Le traitement thermique a été montré pour dénaturer et précipiter plus de 95% des professionnels de la santé du tabac, tandis que les vaccins candidats protéines telles que le paludisme Vax8 demeurent stables en solution 16-18. Trois approches différentes ont été utilisées pour réaliser la précipitation induite par la chaleur des professionnels de la santé du tabac (i) de blanchiment, à savoir l&#39;immersion des feuilles intactes dans un liquide chaud, (ii) une température contrôlée récipient sous agitation, et (iii) un échangeur de chaleur ( Figure 1) 16. Pour des feuilles intactes, Blanchir atteint la précipitation rapide et efficace des professionnels de la santé et a été également facileà l&#39; échelle et compatible avec les procédés de fabrication à grande échelle existantes qui comprennent une étape initiale pour laver la biomasse végétale 19. En revanche, les navires à température contrôlée sont déjà disponibles dans certains procédés , et peuvent être utilisés pour le traitement thermique d&#39;extraits de plantes 20, mais leur évolutivité et une vitesse de transfert d&#39;énergie sont limitées parce que le rapport de la surface au volume des réservoirs est réduite progressivement et devient impropre à l&#39;échelle du processus. Un échangeur de chaleur est une alternative techniquement bien défini pour chauffer des cuves agitées , mais nécessite une offre abondante de chauffage et de milieux de refroidissement, par exemple, de la vapeur et de l&#39; eau froide, ainsi qu&#39;un débit volumétrique étroitement contrôlé qui est adaptée à la géométrie de l&#39; échangeur de chaleur et propriétés des médias, par exemple., la capacité thermique spécifique. Cet article montre comment les trois méthodes peuvent être utilisées pour la précipitation induite par la chaleur des RSG du tabac, et RSG végétales en général. La mise en place et le fonctionnement de each méthode dans un environnement de laboratoire peut être utilisé pour évaluer leur aptitude à des processus à plus grande échelle. Le principal défi consiste à identifier les modèles à échelle réduite adéquates et les conditions de fonctionnement pour chaque opération qui ressemblent à des dispositifs et des conditions utilisées lors de la fabrication processus échelle. Les données présentées ici se réfèrent à des expériences menées avec des plants de tabac transgéniques exprimant le paludisme candidat vaccin Vax8 et protéine fluorescente DsRed 16, mais la méthode a également été appliquée avec succès à N. benthamiana plantes exprimant de manière transitoire 21 d&#39; autres protéines biopharmaceutiques. A expériences de conception-de-(DoE) approche 22 peut faciliter le processus de développement, et de floculants 23 peut également être bénéfique dans ce contexte comme décrit précédemment 8. La principale différence entre le blanchiment, les navires chauffés et des échangeurs de chaleur est que blanchissement est appliquée à des feuilles intactes au début du processus alors que le otla sienne sont appliqués aux extraits de plantes (figure 1). <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/54343/54343fig1.jpg" /> Figure 1:. Schéma de flux de processus illustrant la mise en œuvre de trois méthodes différentes pour le tabac HCP Heat Précipitation Le matériel végétal est lavé et homogénéisé avant clarification et purification. L&#39;équipement pour l&#39;étape de blanchiment (rouge) peut facilement être ajouté à la machine existante. En revanche, en utilisant un récipient agité (orange) et en particulier un échangeur de chaleur (bleu) nécessite un ou plusieurs dispositifs supplémentaires et les tubes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54343/54343fig1large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>

<table><tbody><tr><td>2100P Turbidimètre portable</td><td>Hach</td><td>4650000</td><td></td></tr><tr><td>Kit de couplage d’amines</td> de turbidimètre <td>GE Healthcare</td><td>BR100050&nbsp ;</td><td>Kit de couplage de puces SPR</td></tr><tr><td>Panier d’autoclave</td><td>Nalgene</td><td>6917-0230</td><td>Panier pour blanchiment des feuilles</td></tr><tr><td>Biacore T200</td><td>GE Healthcare</td><td>28-9750-01</td><td>Appareil SPR</td></tr><tr><td>Bio Cell Analyser BCA 003 R& D avec 3D ORM</td><td>Sequip</td><td>n.a.Analyseur</td> <td>de taille de particules</td></tr><tr><td>Blender</td><td>Waring</td><td>800EG</td><td>Blender</td></tr><tr><td>BP-410</td><td>Furh</td><td>2632410001</td><td>Filtre à manches</td></tr><tr><td>Centrifugeuse 5415D</td><td>Eppendorf</td><td>5424 000.410</td><td>Centrifugeuse</td></tr><tr><td>Tube à centrifuger 15 ml</td><td>Labomedic</td><td>2017106</td><td>Tube à réaction</td></tr><tr><td>Tube à centrifuger 50 ml autonome</td><td>Labomedic</td><td>1110504</td><td>Tube de réaction</td></tr><tr><td>puce CM5</td><td>GE Healthcare</td><td>BR100012&nbsp ;</td><td>Puce pour les mesures SPR</td></tr><tr><td>Cuvette 10 x 10 x 45</td><td>Sarsted</td><td>67.754</td><td>Cuvette pour Zetasizer Nano ZS</td></tr><tr><td>Design-Expert(R) 8</td><td>Stat-Ease, Inc.</td><td>n.a.DoE</td> <td>software</td></tr><tr><td>Phosphate disodique</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>&nbsp ; 4984.3&nbsp ;</td><td>Composant multimédia</td></tr><tr><td>Ferty 2 Mega</td><td>Kammlott</td><td>5.220072</td><td>Engrais</td></tr><tr><td>Forma -86C Congélateur ULT</td><td>ThermoFisher</td><td>88400</td><td>Congélateur</td></tr><tr><td>Serre</td><td>n.a.n.a.Pour</td><td></td> <td>la culture des plantes</td></tr><tr><td>Grodan Rockwool Cubes 10 x 10 cm</td><td>Grodan</td><td>102446</td><td>Bloc de laine de roche</td></tr><tr><td>Échangeur de chaleur à vingt boucles (longueur 4,8 m)</td><td>n.a. (conception sur mesure)</td><td>n.a.Heat</td><td> échangeur</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>9105.3</td><td>Composant de média</td></tr><tr><td>K200P 60D</td><td>Pall</td><td>5302303</td><td>Couche filtrante en profondeur</td></tr><tr><td>KS50P 60D</td><td>Pall</td><td>B12486</td><td>Couche filtrante en profondeur</td></tr><tr><td>Lauda E300</td><td>Lauda Dr Wobser GmbH</td><td>Z90010</td><td>Thermostat à bain d’eau</td></tr><tr><td>L/S 24</td><td>Masterflex</td><td>SN-06508-24</td><td>Tube</td></tr><tr><td>mAb 5.2</td><td>American Type Culture Collection</td><td>HB-9148</td><td>Vax8 Anticorps spécifique</td></tr><tr><td>Masterflex L/S</td><td>Masterflex</td><td>HV-77921-75</td><td>Pompe péristaltique</td></tr><tr><td>Miracloth</td><td>Labomedic</td><td>475855-1R</td><td>Tissu filtrant</td></tr><tr><td>MultiLine Multi 3410 IDS</td><td>WTW</td><td>WTW_2020</td><td>pH-mètre / conductimètre</td></tr><tr><td>Osram cool white 36 W</td><td>Osram</td><td>4930440</td><td>Source lumineuse</td></tr><tr><td>Phytotron</td><td>Ilka Zell</td><td>n.a.Pour</td> <td>la culture des plantes</td></tr><tr><td>Disulfite de sodium</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>8554.1</td><td>Composant de média</td></tr><tr><td>Chlorure de sodium</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>P029.2</td><td>Composant</td></tr><tr><td>de média Récipient en acier inoxydable ; 0,7 kg 2,0 L ; hauteur 180 mm ; diamètre 120 mm</td><td>n.a. (conception sur mesure)</td><td>n.a.Récipient</td> <td>pour précipitation de chaleur</td></tr><tr><td>Synergy HT</td><td>BioTek</td><td>SIAFRT</td><td>Lecteur de plaques de fluorescence et spectrométrique</td></tr><tr><td>VelaPad 60</td><td>Pall</td><td>VP60G03KNH4</td><td>Boîtier de filtre</td></tr><tr><td>Zetasizer Nano ZS</td><td>Malvern</td><td>ZEN3600</td><td>DLS Mesure de la distribution granulométrique</td></tr><tr><td>Zetasizer Software v7.11</td><td>Malvern</td><td>n.a.Logiciel</td> <td>pour faire fonctionner l’appareil Zetasizer Nano ZS</td></tr></tbody></table>

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Comparison of Tobacco Host Cell Protein Removal Methods by Blanching Intact Plants or by Heat Treatment of Extracts

Les plantes fournissent non seulement la nourriture, l&#39;alimentation et des matières premières pour l&#39;homme, mais ont également été mis au point en tant que système de production économique pour les protéines biopharmaceutiques, tels que des anticorps, des vaccins candidats et des enzymes. Ceux-ci doivent être purifiés à partir de la biomasse des plantes, mais des étapes de Chromatographie sont gênées par les concentrations élevées de protéines de cellule hôte (HCP) dans les extraits de plantes. Cependant, la plupart des professionnels de la santé agrégées de manière irréversible à des températures supérieures à 60 ° C facilitant la purification ultérieure de la protéine cible. Ici, trois méthodes sont présentées pour obtenir la précipitation de la chaleur des RSG de tabac soit dans des feuilles intactes ou des extraits. Le blanchissement des feuilles intactes peut facilement être incorporé dans les processus existants, mais peut avoir un impact négatif sur les étapes subséquentes de filtration. L&#39;inverse est vrai pour la précipitation de la chaleur des extraits de feuilles dans un récipient agité, ce qui peut améliorer la performance des opérations en aval mais avec des changements majeurs dans la conception de l&#39;équipement de procédé, tels quela géométrie de la homogénéisateur. Enfin, une configuration de l&#39;échangeur de chaleur est bien caractérisée en termes de conditions de transfert de chaleur et facile à l&#39;échelle, mais le nettoyage peut être difficile et il peut y avoir un impact négatif sur la capacité du filtre. L&#39;approche de conception-de-expériences peut être utilisé pour identifier les paramètres de processus les plus pertinents affectant l&#39;élimination des HCP et la récupération du produit. Ceci facilite l&#39;application de chaque méthode dans d&#39;autres plates-formes d&#39;expression et l&#39;identification de la méthode la plus appropriée pour une stratégie de purification donné.

La précipitation thermique des protéines cellulaires de tabac hôte par blanchissement La procédure de blanchiment décrit dans la section 2. a été utilisé avec succès pour précipiter RSG de feuilles de tabac avec 70 ° C, ce qui réduit le FST de 96 ± 1% (n = 3) tout en récupérant jusqu&#39;à 51% de la protéine cible Vax8, augmentant ainsi sa pureté de 0,1% à 1,2% avant la séparation chromatographique 16. Il a également été possible de récupérer 83 ± 1% (...

Trois chaleur des procédés de précipitation sont présentées qui éliminent efficacement plus de 90% des protéines de la cellule hôte (SPH) de tabac extrait avant toute autre étape de purification. L&#39;usine RSG agréger de manière irréversible à des températures supérieures à 60 ° C.

Comparaison de tabac Méthodes hôte cellulaire Protein suppression par Blanchir plantes intactes ou par traitement thermique des extraits

Plants not only provide food, feed and raw materials for humans, but have also been developed as an economical production system for biopharmaceutical ...

L'objectif général de cette série d'expériences est de précipiter les protéines des cellules hôtes végétales par chauffage, facilitant ainsi la purification chromatographique ultérieure des protéines biopharmaceutiques recombinantes. Cette méthode peut contribuer à simplifier le développement du procédé et à améliorer la stabilité du produit, par exemple en activant les protéases de l'hôte.Le principal avantage de cette technique est qu'elle est facile à intégrer aux protéases existantes et peut être rapidement adaptée à différentes protéines cibles. La procédure sera démontrée par Hannah Gruchow, une étudiante en master de mon laboratoire. Pour précipiter thermiquement les protéines des cellules hôtes.Par exemple à partir de feuilles de tabac. Après avoir cultivé les plantes de tabac selon le protocole décrit, préparez un bain d'eau d'un volume de travail de huit litres dans un seau en mousse de polystyrène isolé thermiquement. Transférez l'ensemble sur une plaque d'agitation magnétique, puis placez un barreau aimanté dans le bain d'eau.Ensuite, entourez la barre d'agitation avec une plaque de support non magnétique, en la plaçant au-dessus de la barre d'agitation d'environ un cen

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Biology

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La production de protéines dans les plantes de Nicotiana transitoire basée sur l'infiltration sous vide avec Agrobacteria transportait des vecteurs de lancement (virus de la mosaïque à base de tabac) est une approche rapide et économique pour produire des antigènes de vaccins et de protéines thérapeutiques. Nous avons simplifié la procédure et amélioré l'accumulation de cible en optimisant les conditions de culture de bactéries, la sélection des espèces hôtes, et co-introduction de RNA...

Optimisation et l&#39;utilisation des<em&gt; Agrobacterium</em&gt; Médiée par la production de protéines transitoire dans<em&gt; Nicotiana</em

Nous décrivons une conception de l'approche des expériences qui peuvent être utilisés pour déterminer et modéliser l'influence des éléments de régulation du transgène, les paramètres de croissance et de développement des plantes, et des conditions d'incubation sur l'expression transitoire des anticorps monoclonaux et des protéines rapporteurs dans les plantes.

Caractérisation des systèmes complexes à l&#39;aide de la conception des expériences approche: l&#39;expression transitoire de protéines dans le tabac comme une étude de cas

Dégradation de la protéine ciblée représente un mécanisme de régulation important pour la fonction cellulaire. Il se produit par une voie ubiquitine-protéasome conservée, qui attache chaînes polyubiquitine à la protéine cible qui servent alors des "tags" moléculaires pour le protéasome 26S. Ici, nous décrivons un test simple et fiable sans cellule de la dégradation par le protéasome des protéines.

Le dosage de la dégradation par le protéasome dans un système exempt de cellules dans les plantes

La formation de complexes de protéines in vivo peut être visualisé par fluorescence bimoléculaire complémentation. partenaires d'interaction sont fusionnés à des parties complémentaires de marqueurs fluorescents et exprimés transitoirement dans des feuilles de tabac, ce qui entraîne un signal fluorescent reconstitué à proximité des deux protéines.

Interactions protéine-protéine visualisés par fluorescence bimoléculaire complémentation en protoplastes de tabac et des feuilles

Des plants de tabac ont été utilisés pour produire une cellulase fongique, TrCel5A, par l'intermédiaire d'un système d'expression transitoire. L'expression peut être contrôlée en utilisant une protéine de fusion fluorescente, et l'activité de la protéine a été caractérisée post-expression.

Expression de recombinant cellulase Cel5A de<em&gt; Trichoderma reesei</em&gt; Dans les usines de tabac

À l’aide d’essais ex vivo optimisés sur cellules mononucléées du sang périphérique humain (PBMC), nous avons montré qu’une préparation de produit du tabac combustible supprime de manière marquée les cytokines sécrétées par voie intracellulaire médiées par les récepteurs et la capacité cytolytique des PBMC effecteurs. Ces tests rapides peuvent être utiles pour évaluer les produits et comprendre les effets potentiels à long terme de l’exposition au tabac.

Méthodes pour évaluer la cytotoxicité et l&#39;immunosuppression des préparations de produits combustibles tabac

Dans cette étude, l’expression d’une protéine recombinante humaine cible dans différentes plateformes de production a été comparée. Nous nous sommes concentrés sur les cultures traditionnelles à base de fermenteurs et sur les plantes, en décrivant la configuration de chaque système et en mettant en évidence, sur la base des résultats rapportés, les limites et les avantages inhérents à chaque plateforme.

Une analyse comparative des recombinant expression des protéines dans différents bio-usines: bactéries, cellules d&#39;insectes et Plant Systems

Une méthode à haut débit automatisée, la production de tabac en protoplastes et la transformation est décrite. Le système robotisé permet l'expression du gène massivement parallèle et de découverte dans le système modèle BY-2 qui devrait être traduisible aux cultures non-modèle.

Une plate-forme robotique pour haut débit protoplastes Isolement et Transformation

L’expression hétérologue transitoire des enzymes biosynthétiques dans les feuilles de Nicotiana benthamiana peut détourner les fournitures endogènes de 2,3-oxidosqualene vers la production de nouveaux produits de haute valeur triterpène. Ici est décrit un protocole détaillé pour la production à l’échelle préparative rapide (5 jours) de triterpènes et analogues utilisant cette plate-forme puissante à base de plantes.

Expression transitoire de Nicotiana Benthamiana quitte pour triterpène Production à l’échelle préparative

Dans cette procédure, un ligand épitope à base de DsRed est immobilisé pour produire une résine d'affinité très sélective pour la capture d'anticorps monoclonaux à partir d'extraits de plantes brutes ou de supernatants de culture cellulaire, comme alternative à la protéine A.

Agarose interconnectée activée pour le développement rapide des résines de chromatographie d'affinité - Capture d'anticorps comme étude de cas

Ici, un protocole est présenté pour le dépistage efficace et précis des génotypes de tabac pour la résistance à Phytophthora nicotianae chez les semis. Il s’agit d’une approche pratique pour la sélection de précision, ainsi que pour la recherche sur les mécanismes moléculaires.

Dépistage de la résistance à Phytophthora nicotianae des génotypes du tabac

Découvrez trois méthodes de précipitation thermique pour éliminer plus de 90% des protéines cellulaires hôtes des extraits de tabac. Ces techniques facilitent la purification de protéines biopharmaceutiques recombinantes.

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