Comparaison de tabac Méthodes hôte cellulaire Protein suppression par Blanchir plantes intactes ou par traitement thermique des extraits

L’objectif global de cette série d’expériences est de précipiter les protéines de la cellule hôte de la plante à l’aide de la chaleur. Facilitant ainsi la purification chromatographique ultérieure des protéines biopharmaceutiques recombinantes. Cette méthode peut aider à rationaliser le développement du processus et à augmenter la stabilité du produit, par exemple en activant les protéases de l’hôte.

Le principal avantage de cette technique est qu’elle est facile à mettre en œuvre dans les protéases existantes et qu’elle peut être rapidement adaptée à différentes protéines cibles. Hannah Gruchow, étudiante à la maîtrise de mon laboratoire, fera la démonstration de la procédure. Pour précipiter la chaleur, les protéines de la cellule hôte.

Par exemple à partir de feuilles de tabac. Après la culture des plants de tabac, conformément au protocole de texte, installez un bain-marie d’un volume de travail de huit litres dans un seau en mousse de polystyrène isolé thermiquement. Transférez l’ensemble sur une plaque d’agitation magnétique et placez une barre magnétique dans le bain-marie.

Entourez ensuite la barre d’agitation d’une tuile de support non magnétique qui surmonte la barre d’agitation d’environ un centimètre. Sur lequel un panier en polypropylène sera placé plus tard au cours de la procédure. Ajoutez huit litres de tampon au bain-marie.

Placez ensuite un panier en polypropylène de 23 x 23 x 23 centimètres sur les carreaux de support. S’assurer que le support n’interfère pas avec la rotation de la barre d’agitation et que le panier est entièrement immergé dans le liquide. Puis retirez le panier.

Utilisez un thermostat réglable pour amener le bain-marie à 70 degrés Celsius. Attendez au moins 15 minutes après que la température souhaitée soit atteinte pour vous assurer que l’ensemble a atteint l’équilibre thermique. Ensuite, préparez 150 grammes d’aliquotes à partir des feuilles de tabac.

Placez une aliquote dans le panier tout en évitant une compression irréversible et des dommages aux feuilles. Par exemple, en le déchirant. Immergez soigneusement mais rapidement le panier dans le liquide chaud et placez-le sur les carreaux de support.

Placez ensuite un bloc d’acier inoxydable sur le dessus du panier pour éviter la flottaison. Incuber les feuilles pendant cinq minutes dans le liquide de blanchiment. Ou sélectionnez un moment adapté à la conception expérimentale.

Surveillez la température du liquide pendant toute la période d’incubation. Après l’incubation, retirez délicatement le panier du liquide de blanchiment et laissez les feuilles s’égoutter pendant 30 secondes. Sortez ensuite les feuilles de la plante du panier, transférez-les dans le mélangeur et lancez immédiatement l’extraction selon les protocoles de texte.

Pour chauffer les PCH précipités dans un récipient agité. Transférez un bain-marie sur une plaque d’agitation magnétique et placez un récipient en acier inoxydable de deux litres dans le bain-marie de sorte que le centre du récipient soit aligné avec le centre de la plaque d’agitation. Placez un agitateur magnétique dans le récipient en acier inoxydable.

Remplissez le récipient avec un tampon d’extraction. Puis avec l’eau déminéralisée. Remplissez le bain-marie à cinq centimètres sous le bord supérieur du récipient en acier inoxydable.

Utilisez un couvercle en mousse de polystyrène pour le couvrir. Ensuite, insérez un thermomètre dans le récipient en acier inoxydable à travers un trou apaisant dans le couvercle. Réglez ensuite la température du bain-marie à 78 degrés Celsius et incubez l’ensemble pendant 15 minutes pour atteindre l’équilibre thermique.

Lorsque l’ensemble a atteint l’équilibre, videz le récipient et versez 300 millilitres d’extrait dans le récipient pendant qu’il est encore dans le bain-marie et démarrez la minuterie. Remuez l’extrait à 150 tr/min pendant l’incubation pendant cinq minutes. Assurez-vous que l’extrait atteint une température de 70 degrés Celsius pendant au moins deux minutes pendant la période d’incubation.

Après l’incubation, retirez le bain d’eau chaude de l’agitateur magnétique. Sortez le récipient en acier inoxydable et placez-le dans un seau avec de l’eau glacée. Placez ensuite le seau sur la plaque d’agitation.

Assurez-vous que l’homogénat de la plante est bien agité à 150 tr/min. Placez le thermomètre dans l’extrait et incubez-le jusqu’à ce qu’il atteigne une température de 20 degrés Celsius ou la température spécifiée. Après avoir mis en place deux bains-marie d’un volume de travail de huit litres selon le protocole textuel, utilisez de l’eau déminéralisée pour remplir le premier bain.

Réglez le thermostat à 74,5 degrés Celsius et incubez l’ensemble pendant 15 minutes pour atteindre l’équilibre thermique. Préparez un récipient de stockage isolé en plaçant un bécher en plastique de 0,5 litre dans un bécher en plastique d’un litre. Et utilisez un matériau isolant tel que de la laine de coton pour combler les lacunes.

À l’aide d’un tube LS24, connectez l’échangeur de chaleur à une pompe péristaltique à une extrémité et à un tuyau de sortie à l’autre extrémité. Placez les deux extrémités du tube avec le thermomètre dans le récipient de stockage isolé. Et remplissez-le avec 300 millimètres de tampon d’extraction.

Ensuite, placez l’échangeur de chaleur dans le bain d’eau chaude et démarrez la pompe péristaltique à un débit de 300 millilitres par minute. Après trois minutes, assurez-vous que la température résultante dans le récipient est de 70 degrés Celsius. Environ 4,5 degrés Celsius en dessous du point de consigne du bain-marie.

Jetez le tampon d’extraction de la cuve isolée et préparez des aliquotes de 300 millilitres d’extrait de plante. Ensuite, avec une aliquote, remplissez le récipient isolé. Pompez maintenant l’extrait de plante à travers l’échangeur de chaleur à 300 millilitres par minute pendant cinq minutes.

Assurez-vous ensuite que la température d’extraction est de 70 degrés Celsius après trois minutes ou égale à la température trouvée dans le plan expérimental. Après cinq minutes, transférez l’échangeur de chaleur dans le bain d’eau glacée. Assurez-vous que la température de l’extrait est inférieure à 30 degrés Celsius avant de continuer.

Retirez le tuyau d’arrivée connecté à la pompe péristaltique de la cuve isolée. Et continuez à pomper pour recueillir la chaleur résiduelle de l’extrait de plante précipité à l’intérieur de l’échangeur de chaleur. Arrêtez ensuite la pompe.

Pour effectuer la filtration par manches de l’extrait de plante, montez un filtre à manches dans le panier de support correspondant monté dans le boîtier du filtre. Placez un récipient d’un litre sous le panier et appliquez les aliquotes d’extrait sur le sac à raison de 150 millilitres par minute. Après la filtration, utilisez un turbidimètre pour mesurer la turbidité d’une dilution de un à 10 du filtrat dans le tampon d’extraction.

Prélever un échantillon d’un millilitre et traiter le filtrat de sac. Par exemple, grâce à la filtration en profondeur et à la chromatographie. Analysez davantage l’échantillon selon le protocole de texte.

La précipitation thermique des protéines de la cellule hôte par blanchiment réduit la protéine soluble totale ou TSP de 96 plus ou moins un pour cent. Le blanchiment a récupéré jusqu’à 83 plus ou moins un pour cent de DsRed et 51 pour cent de la protéine cible Vax8. Augmentation de sa pureté de 0,1 % à 1,2 % avant la séparation chromatographique.

La capacité du filtre diminuait à des températures de blanchiment supérieures à 63 degrés Celsius. Ce qui peut être résolu en ajoutant des floculants après l’extraction des protéines et des adjuvants de filtration après la filtration par manche. Un récipient agité pour les précipitations de chaleur a éliminé un maximum de plus ou moins un pour cent de PC.

Atteignant une pureté de 0,33 plus ou moins 0,02 % pour Vax8 et de 20,2 plus ou moins 1,4 % pour DsRed. Contrairement au blanchiment et à la configuration de l’échangeur de chaleur, les précipitations HCP dans un récipient augmentent la capacité de filtration en profondeur en aval de 2,5 fois. Reflétant les forces pures plus faibles dans la cuve par rapport au pompage de l’extrait à travers l’échangeur de chaleur ou à l’homogénéisation après blanchiment.

Environ 88,3 plus ou moins 0,7 % de la teneur en HCP ont été systématiquement éliminées de l’extrait à l’aide d’un échangeur de chaleur entre 60 et 70 degrés Celsius. Atteindre une pureté de 0,31 plus ou moins 0,01 % pour Vax8. Et 27,6 plus ou moins 2,0 % pour DsRed.

Enfin, l’échangeur de chaleur a également atteint la capacité de filtration en profondeur la plus faible en aval. Clarification de seulement 13,5 plus ou moins 6,0 litres par mètre carré avant le colmatage. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en moins de 50 minutes plus un échantillon si elle est correctement exécutée.

Lorsque vous essayez cette méthode, il est important de ne pas oublier de vous assurer que la protéine cible est stable à la chaleur. Suite à cette procédure, d’autres méthodes comme la chromatographie peuvent être effectuées afin de purifier davantage le produit au niveau requis. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine du végétal par une technologie permettant d’explorer la purification des protéines candidates vaccinales et des espèces de nicotiana.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de précipiter les protéines de la cellule hôte de la plante à l’aide d’un blanchiment, d’un récipient agité ou d’un échangeur de chaleur.