Name: Détermination Suppression du système immunitaire contre la protection du système nerveux central pour les interventions pharmacologiques dans démyélinisation autoimmune (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: Découvrez une méthode pour différencier les effets immunomodulateurs et neuroprotecteurs des traitements pharmacologiques dans l'encéphalomyélite auto-immune expérimentale chez la souris. Cette approche aide à comprendre les mécanismes thérapeutiques de la sclérose en plaques.

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Ce travail a été financé par NINDS P30-NS069324, La National Multiple Sclerosis SocietyRG 4587-A-1, La Fondation Civitan international de recherche, la Fondation Mike L. Jezdimir Transverse myélite, L&#39;Université de la Fondation des services de santé Alabama - Fonds général de dotation, The National science Foundation 1355183 et T32 AI007051 de l&#39;Institut national des allergies et des maladies infectieuses, national Institutes of Health.

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Les auteurs n&#39;ont rien à dévoiler.

Les patients atteints de SEP continuent de subir des rechutes de la maladie tout en prenant des médicaments qui atténuent l&#39;activation et / ou infiltration cellules T dans le SNC, ce qui justifie le développement d&#39;options de traitement qui protègent directement le SNC. EAE a été classiquement utilisé pour modéliser les symptômes de la sclérose en plaques et peut être un outil puissant pour l&#39;étude de la nature des interactions entre le système immunitaire et du système nerveux central in vivo. En utilisant le calendrier des considérations de traitement dans l&#39; EAE, par exemple, avant ou après le début de la maladie, en liaison avec l&#39; examen de l&#39; infiltration des cellules immunitaires dans le système nerveux central et de la prolifération et de l&#39; activation de la périphérie, il est possible de délimiter les effets des traitements à la fois sur le système immunitaire et le SNC. Alors que l&#39;EAE chez la souris C57BL / 6 est plus largement utilisé, EAE dans la SJL souris peut être plus représentatif de la majorité des cas de sclérose en plaques, ces souris ont un phénotype et l&#39;infiltration de cellules immunitaires récurrente-rémittente dans le parenchyme10 du cerveau. souris SJL ont nette reprise au cours de la remise ainsi, ce qui permet de commencer le traitement après que la maladie a présenté, mais pendant les périodes de l&#39;inflammation réduite. Il est important de considérer que les souris SJL ne sont pas toujours rechutent pas et remettre en synchronie, entraînant potentiellement une grande variabilité lorsque les résultats sont mis en commun. Par conséquent, certains chercheurs peuvent choisir d&#39;afficher des résultats représentatifs pour les scores cliniques d&#39;un animal tout en prenant des souris pour l&#39;analyse FACS et histologie à des points individualisés dans la progression de la maladie. Considérant lorsque les manipulations sont faites à des souris EAE peut aider à la détermination de la façon dont un traitement affecte le système immunitaire ou du système nerveux central. Il existe de nombreuses options pour quand le traitement commence, chacun avec sa propre connotation pour savoir si les cellules immunitaires sont entrés dans le système nerveux central et la façon dont ils peuvent interagir avec le système nerveux central. Traitement avant l&#39;apparition des symptômes implique que les cellules immunitaires sont pas encore entrés ou causé des dommages au système nerveux central.Traitement après l&#39;apparition des symptômes implique que les cellules immunitaires sont entrés dans le système nerveux central et ont causé quelques dégâts. En utilisant des souris SJL, le traitement peut également commencer au cours d&#39;une rechute, où les cellules immunitaires sont activement infiltraient et provoquant une inflammation, ou pendant la rémission, où les cellules immunitaires peuvent être moins fréquentes dans le SNC avec moins d&#39;inflammation. hypothèses initiales concernant la façon dont les traitements affectent le système nerveux central et du système immunitaire peuvent être faites lors de l&#39;examen, où les cellules immunitaires sont dans le processus pathologique au cours du traitement. Il y a un certain nombre de façons dont les traitements peuvent affecter les cellules immunitaires et le système nerveux central, chacun avec le résultat de la réduction de la sévérité des symptômes EAE de fin. Par conséquent, il est nécessaire d&#39;utiliser l&#39;analyse cytométrique et immunohistochimie flux pour voir comment les cellules immunitaires sont affectées à la périphérie et du système nerveux central, que les cellules immunitaires sont entrées dans le système nerveux central, le système nerveux central et comment réagit au traitement. Bien que l&#39;analyse cytométrique d&#39;écoulement de la moelle épinière peut déterminer combien de cellules haavez entré dans le système nerveux central à un moment donné, on ne peut pas déterminer que cet effet est dû à la traite des cellules immunitaires réduites à moins prolifération des cellules immunitaires est affectée dans la rate. Il est donc nécessaire d&#39;analyser à la fois les tissus périphériques et du système nerveux central et de déterminer ce que signifient les résultats mécaniste lorsque les deux tissus sont comparés. Il est également possible pour les profils d&#39;activité des cellules immunitaires à être modifiées par le traitement, par exemple d&#39;un commutateur dans un profil de cellule T auxiliaire lourd pathogène à un profil de cellules T régulatrices lourds. En regardant des marqueurs pour différents types de cellules et de comparaison pour cent expression entre les animaux traités et non traités est donc également une considération importante. Un nouveau concept dans la recherche MS suggère que les cellules B jouent un rôle important dans la démyélinisation auto-immune. Ceci est basé sur des études montrant que les cellules B sont nécessaires pour la réactivation des cellules T 20. Ce concept est soutenu par le succès des traitements tels que le rituximab, un anticorps anti-CD20 expressé sur la surface des cellules B 21,22. Comme l&#39;a démontré le succès de l&#39;ocrelizumab d&#39;anticorps monoclonal dans les essais cliniques, des médicaments ciblant différents épitopes de CD20 peuvent améliorer l&#39;efficacité de la thérapeutique ciblée B cellules 23. Une limitation des techniques présentées ici est qu&#39;il est possible pour les cellules du système immunitaire d&#39;entrer dans le système nerveux central, mais être incapable de se déplacer dans le parenchyme. L&#39;immunohistochimie peut être utilisée pour détecter manchon périvasculaire des cellules immunitaires et d&#39;évaluer la distance parcourue dans le parenchyme entre les animaux traités et non traités. Une autre limite potentielle implique les effets de la microbiome sur EAE pathogenèse. Commensal microbiote intestinal peut fortement influencer la maladie pathogenèse 24; par conséquent, les souris logées dans différentes colonies et même dans différentes cages peuvent avoir de grandes différences dans la gravité de la maladie. Par conséquent, il est toujours préférable d&#39;utiliser autant que possible les contrôles de la même portée soulevées dans la même cagedes expériences impliquant l&#39;EAE. Une note finale est que si elle est expérimentalement souhaitable d&#39;éliminer les effets de la cellule immunitaire modifications prolifératives dans la périphérie, il peut être possible de le faire en utilisant passive transfert induction plutôt que l&#39;induction active décrite dans ce protocole. Une confirmation supplémentaire pour la neuroprotection peut être accomplie en utilisant un système de co-culture 11 pour tester des mécanismes spécifiques de la mort cellulaire ou à travers l&#39;utilisation des souris knock - out conditionnel qui permet de supprimer de manière sélective des protéines sur un type de cellule. En outre, pour étendre l&#39;exploration des agents pharmacologiques qui sont neuroprotecteur, des marqueurs de transection axonale et la mort neuronale devraient être inclus. Un autre domaine d&#39;importance est la remyélinisation. axones blessés sont incapables de remyéliniser prêter un soutien supplémentaire que les thérapies neuroprotectrices devraient être une partie importante des thérapies de remyélinisation. En outre, les axones amyéliniques sont plus vulnérables aux blessures que myelinaaxones ted. Cela donne à penser que quand un axone devient des interventions thérapeutiques démyélinisation qui favorisent la remyélinisation en temps opportun permettra d&#39;éviter des lésions axonales. Pour explorer ces avenues, d&#39; autres modèles in vivo pour la démyélinisation et la remyélinisation peuvent être utilisés ( par exemple, cuprizone et lysolécithine). Le procédé décrit ici centré sur l&#39;évaluation de la neuroprotection par quantification de la perte de myéline. Pour l&#39;évaluation de la remyélinisation le nombre de cellules progénitrices, ainsi que leur capacité à proliférer et à maturité serait également important d&#39;étudier. Avec la mention de ces modèles alternatifs, il faut aussi tenir compte de différents modèles d&#39;encéphalite qui sont viralement médiées. Il existe deux modèles ARN viraux bien caractérisées qui produisent une perte de myéline: l&#39; un est l&#39; encéphalomyélite murine de Theiler, d&#39; un virus non enveloppé Picornaviridae, et l&#39;autre est le virus de l&#39; hépatite de la souris, un membre de la famille des virus Coronaviridae 25,26. EAE est un outil précieux pour studies de la façon dont les traitements ou manipulations affectent le système immunitaire et du système nerveux central in vivo. Le protocole décrit ici peut aider à déterminer où les traitements ont une incidence sur le processus de la maladie, que ce soit dans la périphérie, à la barrière hémato-encéphalique, ou dans le SNC. Aucun traitements actuels pour MS guérir la maladie et les patients souvent déclin de l&#39;expérience au fil du temps. De même, d&#39;autres maladies impliquant une infiltration de cellules immunitaires dans le SNC et la dégradation de la myéline, y compris l&#39;encéphalomyélite aiguë disséminée, la myélite transverse, et la neuromyélite optique, les traitements qui protègent le manque du système nerveux central comme il est directement attaqué par l&#39;infiltration de cellules immunitaires. Prenant en considération le moment du traitement et l&#39;utilisation de l&#39;analyse de cytométrie de flux de la rate et de la moelle épinière en conjonction avec l&#39;immunohistochimie du SNC pour évaluer l&#39;inflammation et des dommages permettra déterminations mécanistes être prises concernant les traitements.

La sclérose en plaques (SEP) est caractérisée par des lésions inflammatoires principalement dans les régions de la substance blanche du cerveau au début de la maladie. Après la progression à long terme, la matière grise atrophie est détectée par imagerie IRM et marque la phase neurodégénératif de la maladie. gliose réactive, démyélinisation et des lésions axonales dans la substance blanche sont attribuées aux cellules immunitaires CNS-infiltrant. Aucun des traitements actuellement utilisés dans la SEP inverse ou directement empêcher la neurodégénérescence dans le système nerveux central - au contraire, ils réduisent l&#39;inflammation en atténuant l&#39;activation et / ou l&#39;infiltration des lymphocytes T dans le SNC. Parce qu&#39;il n&#39;y a pas de remède pour la SP et les patients utilisant les traitements actuels continuent de connaître la progression de la maladie, les découvertes de médicaments qui préviennent la démyélinisation et neuronale perte sont d&#39;une importance cruciale. Cependant, la différence entre les effets sur les cellules immunitaires et celles sur le SNC peut être difficile expérimentalement, comme le résultat - à savoir, la réduction des dommages au système nerveux central - regarde les same quels que soient les mécanismes par lesquels elle se produit. Par conséquent, l&#39;évaluation de la protection CNS doit être associé à des évaluations de CNS infiltrant les cellules immunitaires et la prolifération des cellules immunitaires dans la périphérie afin de déterminer comment les agents pharmacologiques affecte les mécanismes de la maladie. Experimental encéphalomyélite auto - immune (EAE) est un modèle animal bien établi de troubles inflammatoires auto - immunes qui était directement responsable de la découverte de médicaments actuellement utilisés pour traiter MS 1-4. Les souris sont souvent utilisées pour l&#39;EAE avec C57BL / 6 souris étant une souche populaire basée sur la disponibilité de variantes génétiques. C57BL / 6 souris induites avec EAE présentent la progression de la maladie chronique avec apparition d&#39;environ 10 jours après l&#39;induction. Infiltration du parenchyme de la moelle épinière et du cervelet sont caractéristiques de l&#39;histopathologie de ces animaux, en l&#39; absence d&#39;infiltrations dans le parenchyme cortical 5. lésions plus, corticales et démyélinisation dans le bla pluie sont les caractéristiques de la maladie 6-9, qui sont relativement absentes dans C57BL / 6. Par conséquent, il peut être préférable si possible d&#39;utiliser des souris SJL, qui ont une maladie récurrente-rémittente et des lésions trouvées dans le cerveau et la moelle épinière qui semblent similaires à ceux de la MS 10. Le traitement ne peut pas être classé comme neuroprotecteur si les cellules immunitaires ne jamais atteindre le système nerveux central. Par conséquent, ce protocole permet l&#39; utilisation d&#39;écoulement analyse cytométrique de cerveau, la moelle épinière et les rates des souris atteintes d&#39; EAE afin de déterminer les effets du traitement sur ​​l&#39; infiltration des cellules immunitaires dans le SNC et la prolifération des cellules immunitaires dans la périphérie, comme démontré précédemment 11. analyses immunohistochimiques de tissu du SNC pour déterminer l&#39;étendue et la nature de la neuroprotection est également décrite. La combinaison de ces méthodes permet de déterminer si les cellules immunitaires ont été activés et prolifèrent à la périphérie, que les cellules immunitaires sont entrés dans le système nerveux central, et si le système nerveux central est protected de l&#39;inflammation ou de dommage. Si l&#39;on soupçonne des effets neuroprotecteurs malgré des effets sur le système immunitaire, les expérimentateurs peuvent altérer le traitement des heures de démarrage après l&#39;infiltration des cellules immunitaires dans le SNC est produite. Ici, nous présentons un protocole utilisant deux modèles différents de EAE actif, un modèle animal à médiation cellulaire T de MS, et cytométrie de flux combiné avec immunohistochimie à divers points de temps au cours de la maladie afin de déterminer l&#39;efficacité des thérapies expérimentales sur différents aspects de MS pathogenèse. Cette méthode va aider les chercheurs à différencier les effets sur la prolifération des cellules immunitaires et de l&#39;infiltration par rapport à la protection du système nerveux central, ce qui rend plus facile à affiner la façon dont les médicaments agissent sur la pathogenèse de la maladie.

<table><tbody><tr><td>Moule d’encastrement 22 x 22 x 20 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9719245</td> Moule d’encastrement <td></td></tr><tr><td>22 x 30 x 20 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9531194</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol (55 mM)</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp ;</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>2-Méthylbutane</td><td>Fisher Scientific</td><td>O3551-4</td><td></td></tr><tr><td>30 x 22 x 20 mm Moule d’enrobage</td><td>Fisher Scientific</td><td>18-30</td><td></td></tr><tr><td>ACK Tampon de lyse</td><td>Qualité Biologique</td><td>118-156-101</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD4 PE-Cy7</td><td>BD Biosciences</td><td>552775</td><td>0,2 mg/ml concentration de stock</td></tr><tr><td>anti-Foxp3-FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-5773-82</td><td>0,5 mg/ml de concentration de stock</td></tr><tr><td>anti-GFAP (Cocktail)</td><td>Biolegend</td><td>835301</td><td>1 - 3 mg/ml de concentration de stock</td></tr><tr><td>anti-Iba-1 Anticorps polyclonal (50 &#181 ; g)</td><td>Wako</td><td>019-19741</td><td>0,5 mg/ml concentration de stock</td></tr><tr><td>anti-IFN-&gamma ; APC</td><td>eBioscience</td><td>17-7311-82</td><td>0,2 mg/ml concentration de stock</td></tr><tr><td>anti-IL-17A PerCP-Cy5.5</td><td>eBioscience</td><td>45-7177-82</td><td>0,2 mg/ml concentration de stock</td></tr><tr><td>anti-Ki-67</td><td>PE eBioscience</td><td>12-5698-82</td><td>0,2 mg/ml concentration de stock</td></tr><tr><td>anti-MBP (D-18)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-13912</td><td>0,2 mg/ml concentration de stock</td></tr><tr><td>anti-TCR&beta ; FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-5961-85</td><td>0,5 mg/ml concentration en stock</td></tr><tr><td>anti-TCR&bêta ; PE</td><td>eBioscience</td><td>12-5961-83</td><td>Concentration de stock de 0,2 mg/ml</td></tr><tr><td>LigG de chèvre anti-lapin biotinylée</td><td>Vector Labs</td><td>BA-1000</td><td>Concentration de stock de 1,5 mg/ml</td></tr><tr><td>Cheval anti-souris biotinylé Vector</td><td>Labs</td><td>BA-2000&nbsp ;</td><td>Concentration de la matière de 1,5 mg/ml</td></tr><tr><td>Acide citrique, anhydre, 99,5 %</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC42356-5000</td><td></td></tr><tr><td>Acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA), sel tétrasodique dihydraté, 99 %</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC446085000</td><td></td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin</td><td>HyClone</td><td>SH30071.03</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Superfrost Plus Lames de microscope, caisse de 10</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Golgi Plug</td><td>BD Biosciences</td><td>555029</td><td>inhibiteur de transport de protéines</td></tr><tr><td>Immedge Stylo barrière hydrophobe</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9545623</td><td></td></tr><tr><td>Ionomycine</td><td>EMD Millipore</td><td>407952-5mg</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine, 100x</td><td>Corning</td><td>25-005-Cl</td><td></td></tr><tr><td>MEM Acides aminés non essentiels</td><td>Corning</td><td>25-025-Cl</td><td></td></tr><tr><td>Near IR Live/Dead Kit de coloration</td><td>Life Technologies</td><td>L10119</td><td>colorant de viabilité</td></tr><tr><td>Sérum de chèvre normal</td><td>Vector Labs</td><td>S-1000</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de cheval normal</td><td>Vector Labs</td><td>S-2000</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde, 96 %</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC416785000</td><td></td></tr><tr><td>Solution de pénicilline-streptomycine, 100x</td><td>Corning</td><td>30-002-Cl</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>GE Soins de santé</td><td>17-0891-01</td><td>gradient de densité</td></tr><tr><td>Permount</td><td>Fisher Scientific</td><td>SP15-500</td><td>milieu de montage résineux</td></tr><tr><td>Phorbol 12-myristate 13-acétate (PMA)</td><td>Sigma</td><td>P1585-1mg</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps anti-myéline basique purifié</td><td>BioLegend</td><td>808401</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Corning</td><td>10-040-CM</td><td></td></tr><tr><td>Pyruvate de sodium</td><td>Corning</td><td>25-000-Cl</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek CRYO-OCT Compound</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-373-65</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284</td><td>détergent non ionique</td></tr><tr><td>Vectastain Elite ABC Kit (Standard)</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9206402</td><td>avidine-biotine-peroxydase&nbsp ; complexe (ABC) dans l’immunoperoxydase&nbsp ;</td></tr><tr><td>Vector Laboratories Peroxidase Substrate Kit (DAB)</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9276270</td><td>solution DAB</td></tr></tbody></table>

détermination suppression du système immunitaire contre la protection du système nerveux central pour les interventions pharmacologiques dans démyélinisation autoimmune

Determining Immune System Suppression versus CNS Protection for Pharmacological Interventions in Autoimmune Demyelination

Une caractéristique majeure de la maladie démyélinisante auto-immune qu’est la sclérose en plaques (SEP) est l’infiltration de cellules immunitaires dans le cerveau et la moelle épinière, entraînant la destruction de la myéline, ce qui ralentit non seulement la conduction de l’influx nerveux, mais provoque également des lésions axonales entraînant un déclin moteur et cognitif. Les traitements actuels de la SP visent à atténuer l’infiltration des cellules immunitaires dans le système nerveux central (SNC). Ces traitements diminuent le nombre de rechutes, améliorant ainsi la qualité de vie, mais n’éliminent pas complètement les rechutes, de sorte que l’invalidité à long terme n’est pas améliorée. Par conséquent, des agents thérapeutiques qui protègent le SNC sont justifiés. Tant chez les animaux que chez les patients humains atteints de SEP, l’entrée des lymphocytes T dans le SNC est généralement considérée comme l’événement inflammatoire déclencheur. Afin d’évaluer si un médicament protège le SNC, tout effet potentiel sur l’infiltration ou la prolifération des cellules immunitaires en périphérie doit être exclu. Ce protocole décrit comment déterminer si la protection du SNC observée après l’intervention médicamenteuse est une conséquence de l’atténuation des cellules immunitaires infiltrant le SNC ou du blocage de la mort des cellules du SNC lors d’agressions inflammatoires. La capacité d’examiner les traitements de la SP qui protègent le SNC lors d’agressions inflammatoires est très essentielle à l’avancement des stratégies thérapeutiques, car les traitements actuels réduisent, mais n’éliminent pas complètement, les rechutes (c.-à-d. l’infiltration des cellules immunitaires), laissant le SNC vulnérable à la dégénérescence.

Ce protocole décrit comment déterminer si les traitements pharmacologiques de l’encéphalomyélite auto-immune expérimentale présentent une protection du SNC à la suite de la suppression de l’infiltration des cellules immunitaires ou s’ils sont neuroprotecteurs lors de l’assaut de l’infiltration des cellules immunitaires.

Détermination Suppression du système immunitaire contre la protection du système nerveux central pour les interventions pharmacologiques dans démyélinisation autoimmune

A major hallmark of the autoimmune demyelinating disease multiple sclerosis (MS) is immune cell infiltration into the brain and spinal cord resulting in ...

L'objectif général de cette méthode conceptuelle est de déterminer si les traitements pharmacologiques de l'encéphalomyélite auto-immune expérimentale exercent leur protection du système nerveux central pendant l'assaut de l'infiltration des cellules immunitaires ou en raison de la suppression de cette infiltration. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l'immunologie neuronale, telles que : comment la modulation des moments de traitement de l'EAE permet-elle de distinguer les effets sur l'infiltration des cellules immunitaires de ceux sur la protection ?Les implications de cette technique s'étendent également à la thérapie de la sclérose en plaques, car il n'existe actuellement aucun traitement neuroprotecteur pour cette maladie. Nous avons eu pour la première fois l'idée de cette méthode lorsque nous avons découvert que le traitement de souris EAE par un inhibiteur du transporteur Xc- était à la fois neuroprotecteur et immunomodulateur. Bien que cette méthode puisse être utilisée pour étudier des traitements médicamenteux, elle peut également être appliquée à des études utilisant des souris transgéniques invalidées pour des gènes spécifiques soumises à l'EAE ou à d'autres manipulations.Commencez par utiliser des ciseaux stériles pour hacher les cerveaux et les moelles épinières provenant d'animaux individuels en petits morceaux. Ensuite, utilisez un piston de seringue de trois millilitres par tissu pour broyer chaque échantillon à travers des filtres cellulaires de 70 microns individuels, directement dans des tubes coniques individuels de 50 millilitres, tout en rinçant les filtres avec du milieu. Une fois tous les morceaux broyés, complétez le volume final dans les tubes jusqu'à 50 millilitres avec du milieu frais, puis centrifugez les suspensions cellulaires.Résuspendre chaque culot dans quatre millilitres de solution de gradient de densité à 40 %. Puis, superposer soigneusement les cellules lentement le long des parois de tubes coniques individuels de 15 millilitres, au-dessus de deux millilitres de solution de gradient de densité à 70 % par tube. Séparer les cellules par centrifugation et utiliser des pipettes de transfert d'un millilitre pour éliminer soigneusement les couches supérieures de myéline.Ensuite, transférez les cellules viables des interfaces de l'échantillon dans de nouveaux tubes coniques de 15 millilitres et lavez les cellules dans un volume final de 15 millilitres de milieu frais par tube. Resuspendez les culots dans 200 microlitres de milieu frais et transférez les suspensions cellulaires dans des puits individuels d'une plaque ronde à 96 puits. Centrifugez la plaque et éliminez les surnageants d'un mouvement sec.Ensuite, resuspendre les culots dans 200 microlitres de milieu de restimulation et incuber les cellules à 37 degrés Celsius pendant quatre heures. À la fin de l'incubation, centrifuger à nouveau la plaque et éliminer les surnageants. Puis laver les cellules dans 200 microlitres de PBS supplémenté avec 2 % de FCS et resuspendre les cellules dans 200 microlitres de PBS supplémenté avec 2 % de FCS et du bloc FC pendant 10 à 15 minutes sur de la glace.À la fin de l'incubation, laver les cellules comme vient de l'être démontré et resuspendre les culots dans 15 microlitres de cocktail de marquage de la surface cellulaire pendant 15 minutes sur de la glace. Ensuite, centrifuger les cellules et laver les échantillons deux fois dans 200 microlitres de PBS. Puis, resuspendre les cellules dans les réactifs de marquage des facteurs transcriptionnels FOXP3 selon les instructions du fabricant, pendant 30 minutes à toute la nuit à 4 degrés Celsius.À la fin de l'incubation, laver les cellules dans 150 microlitres de tampon de perméabilisation. Ensuite, centrifuger les cellules et resuspendre les culots dans les anticorps intracellulaires d'intérêt dans 15 microlitres de tampon de perméabilisation sur de la glace. Après 30 minutes, centrifuger les cellules, puis effectuer trois lavages dans 200 microlitres de tampon de perméabilisation.Après le dernier lavage, resuspendre les culots dans 200 microlitres de PBS et analyser les échantillons par cytométrie en flux, en sélectionnant les cellules vivantes CD4-positives et TCR bêta-positives. Il est également important d'évaluer la prolifération des lymphocytes T périphériques, car les modifications au niveau de la périphérie peuvent influencer l'infiltration des cellules immunitaires dans le SNC. Pour quantifier le nombre d'astrocytes et de cellules gliales présents dans les échantillons de tissu médullaire après l'induction de l'EAE, acquérir des images de chaque section à un grossissement de 4x et enregistrer les images au format TIFF.Ensuite, dans ImageJ, sélectionnez l'image d'intérêt et utilisez l'outil de sélection polygonale pour tracer l'ensemble de la section de tissu spinal. Dans le menu image, sélectionnez type et 16 bits pour convertir l'image en 16 bits. Puis, ouvrez le menu traitement et sélectionnez soustraire le fond afin de régler le rayon de la bille roulante à une valeur au moins égale à la taille de l'objet le plus grand qui ne fait pas partie du fond.Vérifiez le paraboloïde glissant et cliquez sur OK. Ensuite, dans l'image, sélectionnez ajuster puis seuil, et utilisez les barres de défilement pour définir le niveau de seuil inférieur. Pour obtenir le pourcentage de la surface seuillée dans la région sélectionnée, allez dans analyser et définir les mesures, puis sélectionnez fraction de surface. Assurez-vous que la limitation au seuil est désactivée et que l'affichage de l'étiquette est activé, puis cliquez sur OK. Pour obtenir les mesures, sous analyser, sélectionnez mesurer.Une fenêtre contextuelle de résultats apparaîtra. Enregistrez ces données et comparez les valeurs de fraction superficielle entre les groupes traités. Pour quantifier la coloration de la protéine basique de la myéline par densité optique, ouvrez l'image d'intérêt et utilisez l'outil de sélection polygonale pour dessiner une région d'intérêt à l'intérieur de l'échantillon.Sous « Analyser et définir les mesures », sélectionnez la valeur moyenne de gris et assurez-vous que l'option « restreindre au seuil » est désactivée, tandis que l'option « afficher l'étiquette » est activée. Cliquez sur OK. Ensuite, dans le menu analyser, sélectionnez mesurer. Une nouvelle fenêtre contextuelle de résultats apparaîtra, contenant les données de la valeur moyenne de gris de la protéine de base de la myéline.L'analyse par cytométrie en flux après prélèvement de la moelle épinière permet d'évaluer l'infiltration des cellules immunitaires dans le système nerveux central, infiltration maximale au pic de la maladie. Une analyse statistique du nombre de cellules positives pour CD4, interféron gamma, IL-17 et FOXP3 peut révéler la signification des variations observées dans le nombre de lymphocytes T infiltrants CD4-positifs chez les animaux traités par un médicament par rapport aux animaux témoins, une analyse approfondie de la coexpression étant essentielle pour écarter un biais comme facteur de confusion dans la réduction globale du nombre de lymphocytes T infiltrants CD4-positifs. Afin d'éliminer la possibilité qu'une diminution des lymphocytes T infiltrant le système nerveux central résulte d'une inhibition de la prolifération, de l'activation et de la différenciation en périphérie, on peut évaluer le nombre de lymphocytes T en prolifération active ainsi que la proportion des sous-types de lymphocytes T.Pour une évaluation quantitative de l'intégrité de la myéline, une analyse statistique de la densité optique de la coloration de la protéine basique de la myéline peut être réalisée, révélant une démyélinisation importante du tissu de la moelle épinière chez des animaux transgéniques dont le gène n'est pas précisé, par rapport à leurs congénères de type sauvage, par exemple. Afin d'étayer davantage le fait que l'inflammation neurologique est maintenue ou réduite par des interventions thérapeutiques, la gliose réactive peut également être évaluée en mesurant la fraction moyenne de la surface correspondant à la gliose réactive, comme vient de l'être démontré. Une fois maîtrisée, la technique de cytométrie en flux peut être terminée en deux jours si elle est correctement réalisée, tandis que la quantification de la coloration tissulaire peut être effectuée en environ deux heures par coloration.L'immunomodulation peut être évaluée en administrant les traitements avant l'infiltration des cellules immunitaires afin de quantifier les modifications de la migration et de la prolifération des cellules T. La protection du système nerveux central peut être évaluée en administrant les traitements au pic de la maladie, lorsque les cellules immunitaires ont déjà infiltré le système nerveux central. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se rappeler d'évaluer les réglages de seuil optimaux dans ImageJ pour une mise en évidence spécifique uniquement de la coloration cellulaire.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment évaluer les effets de traitements spécifiques sur le système nerveux central, ainsi que sur la prolifération et les réponses de migration des lymphocytes T, en modifiant les durées de traitement avant et après l'infiltration des cellules immunitaires.

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Immunology and Infection

Immunologie et infection

Certaines souches de souris sont capables de résister à l'induction de l'encéphalomyélite allergique expérimentale (EAE) de myéline de base des protéines. Décrit ici est un protocole de vaccination simple qui renverse l'insensibilité et induit la maladie paralytique dans plusieurs types de souris EAE taches résistantes.

Surmonter Absence de réaction dans encéphalomyélite allergique expérimentale (EAE) souches de souris résistantes par transfert adoptif et une stimulation antigénique

Une nouvelle préparation ex vivo pour l'imagerie de la moelle épinière de souris. Ce protocole permet l'imagerie à deux photons d'interactions cellulaires vivants tout au long de la moelle épinière.

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Les maladies démyélinisantes peuvent être modélisées chez les animaux par l’application focale de lysolécithine dans le SNC. Une seule injection de lysolécithine dans la moelle épinière de la souris produit une lésion qui se répare spontanément avec le temps. L’objectif est d’étudier les facteurs impliqués dans la démyélinisation et la remyélinisation, et de tester des agents permettant d’améliorer la réparation.

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À ce jour, les protocoles d’isolement simultané de tous les principaux types de cellules résidentes du système nerveux central à partir d’une même souris sont une demande non satisfaite. Le protocole montre une procédure applicable chez les souris naïves et expérimentales atteintes d’encéphalomyélite auto-immune pour étudier les réseaux cellulaires complexes au cours de la neuroinflammation et réduire simultanément le nombre de souris requis.

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Détermination Suppression du système immunitaire contre la protection du système nerveux central pour les interventions pharmacologiques dans démyélinisation autoimmune (Vidéo) | JoVE Journal

Détermination Suppression du système immunitaire contre la protection du système nerveux central pour les interventions pharmacologiques dans démyélinisation autoimmune

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