Détermination Suppression du système immunitaire contre la protection du système nerveux central pour les interventions pharmacologiques dans démyélinisation autoimmune

L’objectif global de cette méthode conceptuelle est de déterminer si les traitements pharmacologiques de l’encéphalomyélite auto-immune expérimentale démontrent la protection du système nerveux central lors de l’assaut de l’infiltration des cellules immunitaires ou à la suite de la suppression de l’infiltration des cellules immunitaires. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l’immunologie neuronale. Par exemple, comment la manipulation des temps de traitement de l’EAE différencie-t-elle les effets sur l’infiltration des cellules immunitaires par rapport à la protection.

Les implications de cette technique s’étendent également au traitement de la sclérose en plaques, car il n’existe actuellement aucun traitement protecteur neuronal pour cette maladie. Nous avons eu l’idée de cette méthode pour la première fois lorsque nous avons découvert que le traitement des souris EAE avec un inhibiteur du système Xc-transporter était à la fois neuroprotecteur et immunomodulateur. Bien que cette méthode puisse être utilisée pour étudier des traitements médicamenteux, elle peut également être appliquée à des études utilisant des souris knock-out génétiques soumises à l’EAE ou à d’autres manipulations.

Commencez par utiliser des ciseaux stériles pour hacher la cervelle et la moelle épinière d’animaux individuels en petits morceaux. Ensuite, utilisez un piston de seringue de trois millilitres par mouchoir pour écraser chaque échantillon sur des passoires individuelles de 70 microns en tubes coniques individuels de 50 millilitres tout en rinçant les passoires avec du fluide. Lorsque toutes les pièces ont été macérées, portez le volume final dans les tubes jusqu’à 50 millilitres avec un milieu frais, puis centrifugez les suspensions cellulaires.

Remettez en suspension chaque pastille dans quatre millilitres de solution à gradient de densité de 40 %. Ensuite, superposez soigneusement la cellule lentement le long des parois de tubes coniques individuels de 15 millilitres sur deux millilitres de solution à gradient de densité de 70 % par tube. Séparez les cellules par centrifugation et utilisez des pipettes de transfert d’un millilitre pour éliminer soigneusement les couches supérieures de myéline.

Ensuite, transférez les cellules viables des interfaces d’échantillon dans de nouveaux tubes coniques de 15 millilitres et lavez les cellules dans un volume final de 15 millilitres de milieu frais par tube. Remettez les granulés en suspension dans 200 microlitres de milieu frais et transférez les suspensions cellulaires dans des puits individuels d’une plaque à fond rond de 96 puits. Centrifugez la plaque et retirez les surnageants.

Ensuite, mettez les granulés en suspension dans 200 microlitres de milieu de restimulation et incubez les cellules à 37 degrés Celsius pendant quatre heures. À la fin de l’incubation, centrifugez à nouveau la plaque et retirez les surnageants. Ensuite, lavez les cellules dans 200 microlitres de PBS complété par 2 % de FCS et remettez en suspension les cellules dans 200 microlitres de PBS complétés par 2 % de FCS et FC-block pendant 10 à 15 minutes sur de la glace.

À la fin de l’incubation, lavez les cellules comme nous venons de le démontrer et remettez les granulés en suspension dans 15 microlitres de cocktail de coloration à la surface des cellules pendant 15 minutes sur de la glace. Ensuite, faites tourner les cellules et lavez les échantillons deux fois dans 200 microlitres de PBS. Ensuite, mettez les cellules en suspension dans les réactifs de coloration du facteur de transcription FOXP3 selon les instructions du fabricant pendant 30 minutes à toute la nuit à 4 degrés Celsius.

À la fin de l’incubation, laver les cellules dans 150 microlitres de tampon de perméabilisation. Puis centrifuger les cellules et remettre en suspension les pastilles dans les anticorps intracellulaires d’intérêt dans 15 microlitres de tampon de perméabilisation sur glace. Après 30 minutes, faites tourner les cellules puis effectuez trois lavages dans 200 microlitres de tampon de perméabilisation.

Après le dernier lavage, remettre les granulés en suspension dans 200 microlitres de PBS et analyser les échantillons par cytométrie en flux, en manipulant les cellules CD4 positives et bêta-positives TCR vivantes. Il est également important d’évaluer la prolifération des lymphocytes T périphériques, car les changements à la périphérie peuvent affecter l’infiltration des cellules immunitaires dans le SNC. Pour quantifier le nombre d’astrocytes et de cellules gliales présents dans les échantillons de tissu de la moelle épinière après l’induction de l’EAE, obtenez des images de chaque section avec un grossissement de 4x et enregistrez les images sous forme de fichiers TIFF.

Ensuite, dans ImageJ, sélectionnez l’image qui vous intéresse et utilisez l’outil de sélection de polygones pour tracer toute la section du tissu rachidien. Dans le menu image, sélectionnez type et 16 bits pour convertir l’image en 16 bits. Ensuite, ouvrez le menu Processus et sélectionnez Arrière-plan du sujet pour définir le rayon de la balle roulante au moins à la taille du plus grand objet qui ne fait pas partie de l’arrière-plan.

Vérifiez le paraboloïde coulissant et cliquez sur OK. Ensuite, sous image, sélectionnez ajuster et seuil, puis utilisez les barres coulissantes pour définir le niveau de seuil inférieur. Pour obtenir le pourcentage de la surface seuillée dans la région sélectionnée, sous Analyser et définir les mesures, sélectionnez Fraction de surface. Assurez-vous que la limite de seuil n’est pas cochée et que l’étiquette d’affichage est cochée, puis cliquez OK.To obtenir les mesures, sous Analyser, sélectionnez Mesurer.

Une fenêtre contextuelle de résultats apparaîtra. Enregistrez ces données et comparez les valeurs de fraction de surface entre les groupes de traitement. Pour quantifier la coloration basique de la myéline par densité optique, ouvrez l’image d’intérêt et utilisez l’outil de sections polygonales pour dessiner une région d’intérêt dans l’échantillon.

Sous Analyser et définir les mesures, sélectionnez Valeur de gris moyenne et vérifiez que la limite au seuil n’est pas cochée et que l’étiquette d’affichage est cochée. Cliquez sur OK. Ensuite, dans le menu Analyser, sélectionnez mesurer. Une nouvelle fenêtre contextuelle de résultats apparaîtra avec les données de valeur grise moyenne de la protéine de base myéline.

L’ablation de la moelle épinière et l’analyse cytométrique en flux permettent d’évaluer l’infiltration des cellules immunitaires du système nerveux central, où l’infiltration des cellules immunitaires est maximale au plus fort de la maladie. L’analyse statistique du nombre de cellules CD4 positives, d’interféron gamma positif, d’IL-17 positives et de FOXP3 positives peut révéler l’importance des changements observés dans le nombre de lymphocytes T infiltrants CD4 positifs chez les animaux traités par médicament, par rapport aux animaux témoins, avec une analyse de coexpression approfondie essentielle pour exclure l’asymétrie en tant que facteur de confusion dans la réduction globale du nombre de lymphocytes T infiltrants CD4 positifs. Pour éliminer la possibilité qu’une réduction des lymphocytes T infiltrant le système nerveux central soit une conséquence de l’inhibition de la prolifération, de l’activation et de la différenciation à la périphérie, le nombre de lymphocytes T en prolifération active et la proportion de sous-types de lymphocytes T peuvent être évalués.

Pour l’évaluation quantitative de l’intégrité de la myéline, une analyse statistique de la densité optique de la coloration des protéines basiques de la myéline peut être effectuée, révélant une démyélinisation significative du tissu de la moelle épinière chez les animaux génétiquement knock-out non spécifiés par rapport aux compagnons de portée de type sauvage, par exemple. Pour étayer davantage que la neuroinflammation est maintenue ou diminuée par les interventions thérapeutiques, la gliose réactive peut également être évaluée en mesurant la surface de fraction moyenne de la gliose réactive, comme cela vient d’être démontré. Une fois maîtrisée, la technique de cytométrie en flux peut être réalisée en deux jours si elle est correctement effectuée, tandis que la quantification de la coloration tissulaire peut être effectuée en environ deux heures par coloration.

L’immunomodulation peut être évaluée en introduisant les traitements avant l’infiltration des cellules immunitaires afin de quantifier les changements migratoires et prolifératifs dans les cellules T. La protection du SNC peut être évaluée en introduisant les traitements au plus fort de la maladie, lorsque les cellules immunitaires se sont déjà infiltrées dans le SNC. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler d’évaluer les paramètres de seuil optimaux dans ImageJ pour la mise en évidence spécifique de la coloration cellulaire uniquement.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’évaluer les effets de traitements spécifiques sur le système nerveux central, la prolifération des lymphocytes T et les réponses migratoires. En modifiant les temps de traitement avant et après l’infiltration des cellules immunitaires.