Analyse automatisée de C. elegans Comportement Swim Utiliser Celest Software

L’objectif global de cette méthodologie est d’évaluer quantitativement le comportement de nage de C.Elegans à l’aide d’un logiciel de vision par ordinateur appelé CeleST, pour C.Elegans Swim Test"Cette méthode d’analyse peut aider à aborder l’impact des mutations génétiques ou des interventions pharmacologiques sur le comportement de nage de C.elegans. Il peut également facilement évaluer le déclin des capacités des locomotives associé à l’âge. Les principaux avantages de cette technique sont que plusieurs animaux peuvent être suivis simultanément, que différents aspects de la posture de nage peuvent être analysés pour noter huit paramètres du comportement de nage et que l’évaluation automatisée des données est effectuée.

Commencez par vous procurer un stéréomicroscope et une caméra CCD numérique ainsi qu’un ordinateur avec un logiciel d’enregistrement vidéo numérique et un logiciel de vision par ordinateur pour l’analyse du comportement de nage de C.Elegans. Dans le logiciel d’enregistrement vidéo numérique, configurez les paramètres suivants :Couvrez le microscope avec un chiffon foncé pour éviter l’éblouissement dans la zone de chute de nage sur la lame de microscope et améliorez la qualité de l’image. Ajustez la distance de travail et le grossissement du microscope pour qu’il ait une vue complète de la zone de baignade, et ajustez le miroir de base pour obtenir un contraste net des animaux sur l’arrière-plan.

Ensuite, réglez l’éclairage sur le champ sombre pour visualiser les corps des adultes en blanc sur un fond noir. Ensuite, pipetez 60 microlitres de 1 tampon M9 dans un anneau de 10 millimètres, pré-imprimé sur une lame de microscope, et assurez-vous que la goutte couvre entièrement la zone intérieure de l’anneau. Transférez quatre nématodes adultes dans la goutte de tampon 1 x M9 tout en minimisant le transport des bactéries qui peuvent troubler le liquide.

Minimisez les bactéries dans le puits natatoire en laissant les nématodes ramper brièvement sur une région non assise de la plaque avant d’être transférés, ou en mélangeant légèrement le puits natatoire pour disperser les traces mineures de bactéries avant l’enregistrement. Ensuite, positionnez la lame chargée de nématodes adultes sur la base du microscope pour enregistrer leur comportement de nage dans un liquide dans des vidéos de 30 secondes. Pour enregistrer, sélectionnez Nouvelle séquence dans la RAM sous l’en-tête Accueil, puis appuyez sur le bouton d’enregistrement rouge.

Enfin, une fois l’enregistrement terminé, cliquez sur l’en-tête Accueil et sélectionnez Exporter la séquence complète, afin de fragmenter la vidéo en une séquence de cadres d’image. Commencez par lancer le logiciel de vision par ordinateur pour l’analyse du comportement de nage de C.elegans à partir de Mat Lab en cliquant sur le bouton Courir. Sur l’écran d’accueil du programme d’analyse de natation, utilisez les boutons Ajouter une vidéo ou Ajouter plusieurs vidéos pour télécharger des séquences d’images une par une ou en groupes tout en attachant des étiquettes pertinentes, telles que le génotype, la date, l’essai et la durée.

Ensuite, cliquez sur Traiter les vidéos" pour activer le suivi simultané de plusieurs animaux dans les séquences téléchargées. Dans le nouvel écran qui apparaît, sélectionnez les vidéos souhaitées dans la case de gauche et cliquez sur Ajouter à la liste"Ensuite, délimitez la zone de baignade en sélectionnant trois points à l’intérieur de l’anneau et lancez le traitement en cliquant sur Traiter toutes les vidéos répertoriées ci-dessus. Visualisez la progression du traitement vidéo au centre en bas de l’écran.

Une fois l’opération terminée, fermez l’écran de traitement vidéo. Commencez par cliquer sur Calculer les mesures" pour ouvrir un nouvel écran où les vidéos traitées peuvent être téléchargées une par une pour valider ou refuser le suivi d’animaux uniques. Utilisez cette étape manuelle pour vous concentrer sur les zones de suivi manqué, indiquées dans les blocs rouges, et sur les zones contrastant avec le suivi réussi, indiqué dans les blocs verts.

Trouvez la validité du corps segmenté"dans la première barre de couleur de l’écran dans la moitié inférieure. Notez que le pourcentage de cadres valides est en vert et le pourcentage de cadres rejetés est en rouge. Ensuite, naviguez et modifiez les blocs de cadres valides ou rejetés à l’aide du bloc suivant, en basculant les options de validité « Diviser le bloc » et Isoler le cadre ».

Dans les rares cas où deux animaux se croisent dans une zone de baignade peu fréquentée, changez leurs numéros d’identification sur une plage de cadre spécifique avec le bouton « Switch ». Enfin, cliquez sur Enregistrer et calculer les mesures" pour enregistrer l’entrée de validité avant de télécharger une autre vidéo traitée. Sélectionnez ensuite Fermer" pour quitter l’écran Calculer les mesures.

Notez que le logiciel calcule des cartes de courbure des performances de nage de chaque animal en arrière-plan ainsi que les huit paramètres indiqués plus loin. Sur l’écran d’accueil du logiciel de vision par ordinateur, cliquez sur Afficher les résultats pour obtenir le résultat de l’analyse. Ensuite, créez des groupes d’échantillons pour le traitement statistique en sélectionnant les séquences d’images analysées souhaitées dans la case de gauche et en les déplaçant dans un groupe d’échantillons existant plus récent en cliquant sur les boutons Ajouter à l’échantillon sélectionné ou Ajouter à un nouvel échantillon.

Cliquez sur Afficher les graphiques de ces échantillons pour accéder à un deuxième écran qui affiche les graphiques et les statistiques clés des échantillons pour chacun des huit paramètres par sélection en haut de l’écran. Ensuite, sélectionnez Histogrammes 2D"pour tracer des combinaisons de deux paramètres quelconques via les menus déroulants Mesure sur l’axe X et Mesure sur l’axe Y à gauche de l’écran. Cliquez sur Fermer » pour quitter et revenir à l’écran Afficher les résultats ».

Ensuite, sélectionnez le bouton d’exportation en haut à gauche de l’écran pour enregistrer des données numériques détaillées sous forme de fichier csv à ouvrir et à manipuler dans un tableur. Enfin, sélectionnez Fermer » pour quitter l’écran d’affichage des résultats » et revenez à l’écran d’accueil. Cliquez sur Quitter" pour assurer la sauvegarde de la base de données contenant les séquences vidéo analysées.

Certains paramètres de la natation, tels que le taux d’initiation des vagues, l’indice d’activité, le coup de pinceau et la vitesse de déplacement ont progressivement diminué avec l’âge, même dans des contextes génétiques favorables. D’autre part, le nombre d’ondes corporelles, l’asymétrie, l’étirement et les paramètres de courbure ont tendance à augmenter avec l’âge chez les adultes mutants de type sauvage et vieillissants. Bien que tous les nématodes commencent à l’âge adulte en bonne santé, certains perdent rapidement leur forme physique, tandis que d’autres conservent leur vigueur pendant de plus longues périodes, ce qui indique que les mauvais âges ont une durée de vie en bonne santé considérablement plus courte que les âges gracieux.

Une fois maîtrisée, l’analyse de quatre vers nageurs peut être acquise en quelques minutes. Le calcul prend environ six minutes par vidéo et peut être effectué à distance. Il est possible de traiter 250 animaux par jour.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’acquérir des vidéos d’essais de natation et de traiter les données pour obtenir une évaluation de la locomotion dans un liquide.