Reprogrammation fibroblastes embryonnaires de souris avec les facteurs de transcription pour induire un programme Hemogenic

L'objectif général de ce protocole d'induction hémogène est d'initier un processus développemental dans des fibroblastes de souris par surexpression de facteurs de transcription afin de générer in vitro des cellules progénitrices hématopoïétiques capables de produire des cellules hématopoïétiques après une culture prolongée. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la programmation hématopoïétique, telles que la possibilité de développer un protocole permettant d'obtenir de façon dé novo des cellules souches hématopoïétiques authentiques capables d'une différenciation multilignée et d'un engraftement. Le principal avantage de cette technique réside dans le fait qu'en surexprimant un nombre minimal de facteurs de transcription, le processus développemental peut être initié dans des cellules reprogrammées sans passer par un intermédiaire pluripotent.

Après la culture de fibroblastes embryonnaires de souris ou MEFS, et la production du virus selon le protocole décrit, utilisez 0,1 % de gélatine dans du PBS pour pré-enduire des plaques de 6 puits. Veillez à ce que la gélatine recouvre entièrement la surface de chaque puits. Incubez les plaques à 37 degrés Celsius pendant au moins 20 minutes.

Ensuite, retirez les plaques et aspirez la gélatine. Ensemencez les CEM dans du DMEM standard à une densité de 25 000 cellules par puits et laissez les cellules s'attacher toute la nuit à 37 degrés Celsius. Préparez un cocktail viral de 100 microlitres en mélangeant 50 microlitres de M2RTTA et 12,5 microlitres chacun de GATA2, GFI1B, CFOS et ETV6.

Aspirez le milieu des MEF et ajoutez deux millilitres de DMEM standard contenant 8 microgrammes par millilitre de bromure d'hexadiméthrine. Ensuite, transduisez chaque puits de MEF avec 15 microlitres du cocktail viral et incubez à 37 degrés Celsius pendant la nuit. Après une incubation de 16 à 20 heures, remplacez le milieu de chaque puits par deux millilitres de DMEM standard frais, supplémenté avec un microgramme par millilitre de DOX.

Incuber à 37 degrés Celsius pendant trois jours. Le quatrième jour, préparer le milieu de culture hématopoïétique supplémenté en hydrocortisone, facteur de croissance des cellules souches, ligand du récepteur tyrosine kinase trois lié au MFS, interlukine trois, interlukine six et DOX. Ensuite, aspirer le milieu des MEF et utiliser un millilitre de PBS pour laver les cellules.

Ensuite, après avoir aspiré le PBS, ajouter un millilitre de trypsine à 0,05 pour cent par puits pour dissocier et recueillir les cellules. À l’aide du compteur hématométrique, dénombrer les cellules, puis centrifuger à 300 × g pendant cinq minutes et utiliser 12 millilitres du milieu hématopoïétique préparé précédemment pour resuspendre les cellules. Ensuite, ensemencer 10 000 cellules par puits dans des plaques de six puits revêtues de gélatine.

Tous les six jours, remplacez le milieu par du milieu de culture hématopoïétique frais supplémenté pendant toute la durée de la culture. Analysez les cellules selon le protocole décrit dans le texte. Après avoir disséqué les placentas de souris gestantes selon le protocole décrit dans le texte, utilisez deux à cinq millilitres de collagénase de type I à 0,2 pour cent dans du PBS contenant 20 pour cent de FBS pour laver le tissu et, à l’aide d’une aiguille de calibre 18 fixée à une seringue de cinq millilitres, dissociez mécaniquement le tissu dans la solution de PBS.

Incuber les cellules placentaires dans deux à cinq millilitres de solution de collagénase à 37 degrés Celsius pendant 1,5 heure. Ensuite, passer les cellules plusieurs fois à travers des aiguilles de 20 à 25 gauge fixées sur des seringues de 5 millilitres afin de les dissocier davantage par action mécanique. Puis, filtrer les suspensions de cellules uniques à l’aide de tamis cellulaires de 70 microns.

Ensuite, à l’aide d’un hémocytomètre, comptez les cellules et irradiez à 2 000 centigrays pour une inactivation mitotique. Ajoutez dix millilitres de milieu de culture hématopoïétique supplémenté avec les éléments suivants à une boîte de dix centimètres de diamètre. Placez le filtre de 0,65 micron directement sur le milieu de culture dans la boîte, laissez-le flotter pour créer une interface liquide-gaz, puis mettez la boîte de côté.

Dissocier les MEF transduits du jour 25 comme démontré précédemment dans cette vidéo et mélanger 33 000 des MEF transduits avec 167 000 cellules issues des agrégats placentaires mitotiquement inactivés. Pour former un agrégat, centrifuger le mélange de cellules MEF et placentaires à 300 × g pendant cinq minutes. Aspirer le milieu et utiliser de 30 à 50 microlitres de DMEM standard pour resuspendre les cellules en culot, en aspirant la suspension monocellulaire dans une pipette de 200 microlitres à embout non biseauté.

Ensuite, obturez la pointe de la pipette avec un film paraffiné. Puis, placez la pointe bouchée dans un tube conique de 15 millilitres et centrifugez à 300 ×g pendant cinq minutes afin qu'un culot se forme à l'extrémité couverte de la pointe. Retirez délicatement la pointe du tube de 15 millilitres et fixez-la à l'extrémité d'une pipette P200.

Jetez le film de paraffine et extrudez le culot cellulaire sur le filtre flottant dans la boîte de milieu de culture. Incubez les agrégats sur les filtres flottants à 37 degrés Celsius et 5 pour cent de dioxyde de carbone pendant quatre à cinq jours. À l’aide d’un grattoir à cellules, récupérez les agrégats, puis regroupez-les et utilisez une solution de collagénase à 0,5 pour cent pour les digérer.

Après la dissociation, utilisez deux à cinq millilitres de PBS contenant 5 % de FBS pour laver les agrégats et centrifugez à 300 × g pendant cinq minutes. Resuspendez les agrégats dans 500 microlitres de DMEM sans FBS, sans Pen-Strep ni L-glutamine. Ajoutez toute la suspension à trois millilitres de milieu de méthylcellulose à 1 %, supplémenté avec 10 nanogrammes par millilitre de Tepo, en évitant soigneusement la formation de bulles.

Plaquez des volumes égaux de ce mélange dans trois boîtes de culture non traitées de 35 par 10 millimètres pour les essais d'UFC. En tant que témoin, cultivez des agrégats placentaires irradiés. Enfin, comptez manuellement les colonies hématopoïétiques au microscope après 10 à 14 jours de culture à 37 degrés Celsius avec 5 pour cent de dioxyde de carbone.

Au cours du processus de reprogrammation des MEFs en HSCs, les cellules sont transduites avec des facteurs de transcription comme illustré ici. Après trois jours d'expansion et d'exposition à la DOX pour initier l'activation des transgènes, les cellules sont dissociées, divisées et cultivées sur des plaques revêtues de gélatine dans un milieu hématopoïétique supplémenté. Au jour 20 en culture, après la transduction avec le milieu de reprogrammation, les MEFs 34/H2BGFP présentent des modifications morphologiques nettes, incluant une morphologie endothéliale distincte de celle des MEFs.

Une culture supplémentaire jusqu'au jour 35 conduit à l'apparition de plusieurs cellules rondes de type hématopoïétique à partir d'intermédiaires de type endothélial, positives pour la GFP et marquées par les marqueurs hématopoïétiques Sca1 et CD45. Une culture prolongée donne des cellules exprimant CD45 tout en conservant l'expression du rapporteur humain CD34. Après agrégation placentaire, les cellules en culture acquièrent un potentiel clonogène et forment des colonies dans un milieu à base de méthylcellulose contenant diverses morphologies hématopoïétiques ainsi que des cellules de type blastique.

Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se rappeler d'effectuer chaque étape lentement afin d'éviter toute confusion. Toute erreur sera difficile à détecter avant plusieurs semaines après le début du reprogrammation. Après avoir suivi cette procédure, d'autres méthodes telles que les tests de formation de cellules en pavement et les tests d'initiation de culture à long terme peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires, comme de savoir si les cellules obtenues possèdent réellement une fonction hématopoïétique, comme le démontrent les tests fonctionnels.

Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la programmation des cellules souches hématopoïétiques pour explorer d'autres stratégies de reprogrammation et des protocoles d'optimisation dans les cellules sanguines, endothéliales et d'autres types cellulaires. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'induire un programme hémogénique dans des fibroblastes de souris, de la surexpression des facteurs de transcription et de la façon d'analyser fonctionnellement la cellule obtenue. Merci d'avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.