Mesure de l’activité enzymatique Lactase dans le laboratoire d’enseignement
6 août 2018
L’activité enzymatique de la lactase est essentielle pour le traitement catabolique du lactose disaccharides. Ici, l’activité de la lactase dans les compléments alimentaires est analysée à l’aide d’un dosage colorimétrique. Cela prépare les stagiaires à une plateforme expérimentale permettant de comprendre l’activité de la lactase et enzyme cinétique.
Cette méthode est un outil utile pour initier les élèves aux concepts régissant les réactions enzymatiques. Le principal avantage de cette technique est qu’elle convient aux étudiants ayant très peu d’expérience en laboratoire humide, fournissant des résultats robustes que les étudiants peuvent observer et interpréter. Pour commencer le protocole, étiquetez un tube de suspension de 15 millilitres.
Écrasez un comprimé de lactase contenant 200 milligrammes d’enzyme en une poudre uniforme à l’aide d’un mortier et d’un pilon. Placez la poudre obtenue dans le tube étiqueté et mettez-la en suspension dans 10 millilitres de solution saline tamponnée au phosphate de 100 millimolaires, ou PBS. Vortex la solution pendant une minute pour maximiser l’extraction enzymatique.
Ensuite, transférez un millilitre de la suspension dans un tube de 1,5 millilitre et faites tourner l’échantillon pendant une minute à 10 000 fois G pour sédimenter les particules solides. Transférez 500 microlitres de surnageant dans un tube propre de 1,5 millilitre étiqueté extrait de lactase. Placez 390 microlitres de PBS de 100 millimolaires dans un tube de 1,5 millilitre étiqueté réaction A.Ensuite, ajoutez 100 microlitres de solution ONPG de cinq millimolaires et mélangez bien par vortexing.
Ajoutez 10 microlitres d’extrait dans le tube de réaction A et vortex le contenu. Observez souvent le mélange réactionnel pendant cinq minutes et notez tout changement colorimétrique de la solution. Installez deux tubes de 1,5 millilitre, l’un étiqueté réaction B, l’autre étiqueté contrôle.
Ajoutez 390 microlitres de PBS de 100 millimolaires dans le tube de réaction B, 400 microlitres de PBS de 100 millimolaires dans le tube de contrôle, puis ajoutez 100 microlitres d’ONPG de cinq millimolaires dans chaque tube. Mélangez le contenu par vortex. Ajoutez 10 microlitres d’extrait de lactase dans le tube de réaction B, mélangez par vortex et laissez la réaction se poursuivre pendant une minute à température ambiante.
Une fois qu’une minute s’est écoulée, ajoutez 500 microlitres d’une molaire de carbonate de sodium dans les deux tubes pour inhiber l’enzyme lactase en augmentant le pH, arrêtant ainsi la réaction. Transférez 500 microlitres de chaque tube dans des cuvettes de spectrophotomètre propres et mesurez l’absorbance à 420 nanomètres. Installez trois tubes de contrôle et trois tubes de réaction et étiquetez-les à quatre degrés Celsius, température ambiante et 37 degrés Celsius.
Après l’ajout de l’extrait enzymatique, incubez un tube sur de la glace, un à température ambiante et un à 37 degrés Celsius dans un bain-marie préchauffé pendant une minute. Ensuite, arrêtez la réaction en ajoutant 500 microlitres d’une molaire de carbonate de sodium dans chaque tube. Mesurez l’absorbance à 420 nanomètres pour chaque tube.
Notez les valeurs, en soustrayant la valeur de contrôle de la valeur de réaction dans chaque cas. En utilisant le protocole, le contrôle reste clair tandis que la solution réactionnelle contenant l’extrait du comprimé de lactase devient jaune lorsque l’ONPG est hydrolysé, libérant de l’ortho nitrophénol. Après analyse d’échantillons à l’aide du spectrophotomètre, la production d’orthonitrophénol est la plus faible lorsque la réaction est incubée sur de la glace et la plus élevée lorsque la réaction est effectuée à 37 degrés Celsius.
Lors de cette procédure, il est important de se rappeler d’avoir les réactions à la température appropriée avant d’ajouter l’extrait enzymatique.
Aperçu
Cet article présente un dosage colorimétrique permettant de mesurer l'activité enzymatique de la lactase, essentielle à la digestion du lactose. La méthode est conçue pour des étudiants possédant une expérience minimale en laboratoire humide, leur permettant ainsi d'observer et d'interpréter efficacement la cinétique enzymatique.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Biochimie
- Cinétique enzymatique
- Formation aux techniques de laboratoire
Contexte
- La lactase est une enzyme qui dégrade le lactose en glucose et en galactose.
- La compréhension de l'activité enzymatique est fondamentale en biochimie et dans les domaines connexes.
- Les dosages colorimétriques fournissent une représentation visuelle des réactions enzymatiques.
- Cette méthode est accessible aux étudiants ayant une expérience limitée en laboratoire.
Objectif de l'étude
- Initier les étudiants à la cinétique enzymatique au moyen d'une expérience pratique.
- Fournir une méthode fiable pour mesurer l'activité de la lactase.
- Approfondir la compréhension des facteurs influant sur les réactions enzymatiques.
Méthodes utilisées
- Préparation d'un extrait de lactase à partir de compléments alimentaires.
- Mesure colorimétrique de la production d'ortho-nitrophénol.
- Comparaison de l'activité enzymatique à différentes températures.
- Utilisation de la spectrophotométrie pour quantifier les variations d'absorbance.
Résultats principaux
- Le mélange réactionnel devient jaune lorsque l'ONPG est hydrolysé par la lactase.
- L'activité enzymatique est maximale à 37 degrés Celsius et minimale sur de la glace.
- Les échantillons témoins restent limpides, confirmant la spécificité du test.
- Les résultats démontrent l'impact de la température sur la cinétique enzymatique.
Conclusions
- Le test colorimétrique illustre efficacement l'activité de la lactase.
- Cette méthode convient aux fins éducatives en biochimie.
- La compréhension de la cinétique enzymatique est essentielle pour les études futures sur les processus métaboliques.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
Ce protocole pédagogique démontre un essai fondamental d'activité enzymatique utilisant la lactase, une cible thérapeutiquement pertinente dans les troubles gastro-intestinaux. La méthode colorimétrique offre une approche reproductible et évolutive pour enseigner les principes de la cinétique enzymatique, applicables à la validation précoce des cibles et au développement d'essais en recherche et développement biopharmaceutique. En reliant la fonction enzymatique à un substrat cliniquement significatif (ONPG), cet essai soutient la réduction des risques mécanistiques et renforce la confiance prédictive dans les stratégies thérapeutiques ciblant les enzymes.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Valeur scientifique : Permet l'analyse de la fonction de l'enzyme lactase et de sa spécificité envers le substrat, soutenant les tests d'hypothèses ciblées dans les modèles de maladies gastro-intestinales.
- Valeur opérationnelle : Utilise une lactase disponible commercialement provenant de compléments alimentaires, offrant un système peu coûteux et facilement accessible pour des études préliminaires d'engagement ciblé.
- Valeur prédictive : Des mesures quantitatives de l'absorbance à 420 nm permettent d'évaluer l'activité enzymatique dans différentes conditions, fournissant des informations sur les relations structure-activité et le criblage de candidats prometteurs.
Développement de criblages et de tests
- Prêt-à-l’emploi du test : La réaction colorimétrique basée sur l’ONPG produit un composé jaune quantifiable (ortho-nitrophénol), permettant des lectures compatibles avec le criblage à haut débit pour l’inhibition ou l’activation enzymatique.
- Reproductibilité : L’extraction standardisée à partir de comprimés et des conditions d’incubation contrôlées (sur glace, à température ambiante, à 37 °C) garantissent des résultats cohérents entre les réplicats, assurant la robustesse du test.
- Extensibilité : Le format simple en tubes associé à une détection spectrophotométrique permet une adaptation facile aux plateformes multi-puits pour le criblage de bibliothèques de composés.
Recherche translationnelle et préclinique
- Pertinence pour la maladie : Le déficit en lactase est directement lié à l'intolérance au lactose, ce qui fait de ce dosage un outil pertinent pour évaluer les thérapies de remplacement enzymatique ou les interventions alimentaires.
- Continuité translationnelle : Le profil d'activité dépendant de la température (le plus faible sur glace, le plus élevé à 37 °C) reflète les conditions physiologiques, facilitant la prédiction du comportement de l'enzyme in vivo.
- Réduction des risques mécanistiques : La distinction claire entre les tubes de réaction et les tubes témoins confirme la spécificité du dosage, réduisant ainsi les risques de faux positifs lors de la validation thérapeutique ultérieure.
Intégration des pipelines et des flux de travail
Le dosage de l'activité de la lactase s'inscrit dans la phase précoce de la découverte, en soutenant la validation de la cible par la mesure fonctionnelle de l'enzyme et en permettant le développement de tests pour des campagnes de criblage axées sur des cibles gastro-intestinales.
- Biologie de la découverte : Mesure l'hydrolyse de l'ONPG médiée par la lactase afin d'évaluer la fonction enzymatique, contribuant ainsi à la détection biologique du risque associé à la lactase en tant que cible thérapeutique.
- Écrantage : Génère des résultats quantitatifs et colorimétriques adaptés à l'évaluation des effets de modulateurs dans des procédures d'écrantage centrées sur les enzymes.
- Analytique : La mesure spectrophotométrique à 420 nm fournit des données objectives permettant de comparer l'activité enzymatique dans différentes conditions, facilitant ainsi une sélection rationnelle des candidats actifs.
- Recherche translationnelle : Établit un lien entre l'activité enzymatique et le métabolisme du lactose, reliant ainsi les résultats in vitro à leur pertinence clinique dans les troubles de malabsorption.
- Réutilisation en entreprise : Le protocole utilise du matériel de laboratoire standard (vortex, centrifugeuse, spectrophotomètre), favorisant son adoption généralisée au sein des équipes de découverte et précliniques.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Fournit des informations mécanistiques sur les interactions enzyme-substrat, renforçant la confiance dans la cible et réduisant l'ambiguïté lors de la validation précoce des cibles.
- Valeur opérationnelle : Met en œuvre des étapes robustes et standardisées (extraction à partir de comprimé, centrifugation, incubation à température contrôlée) garantissant la reproductibilité et une variabilité minimale.
- Valeur stratégique : Permet de prendre des décisions éclairées d'aller ou de ne pas aller plus loin en fournissant des données d'activité claires et quantitatives, réduisant ainsi la dépendance aux marqueurs indirects ou de substitution.
- Impact sur le portefeuille : Permet une priorisation ajustée au risque des interventions ciblant la lactase, fondée sur des profils d'activité empiriques obtenus dans des conditions physiologiquement pertinentes.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite des compétences biochimiques de base en manipulation des enzymes, en spectrophotométrie et en préparation de solutions.
- Suppose l'accès à un spectrophotomètre capable de mesurer l'absorbance à 420 nm et à une centrifugeuse pour la clarification du surnageant.
- Exige une standardisation de la préparation des extraits et du chronométrage des réactions afin d'assurer des résultats cohérents entre utilisateurs et lots.
- L'adaptation à d'autres enzymes peut nécessiter une optimisation du substrat et du tampon, la spécificité de l'ONPG étant limitée à l'activité galactosidase.
- La modification du pH par l'ajout de carbonate de sodium est essentielle pour l'arrêt de la réaction ; une inhibition incomplète peut affecter la précision de la mesure d'absorbance.
