Name: Conception de dispositifs microfluidiques pour étudier les réponses cellulaires Sous simple ou Coexistence chimique / électrique / Shear Stress Stimuli (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 35 s
Description: Découvrez la conception de dispositifs microfluidiques en polyméthacrylate de méthyle pour étudier les réponses cellulaires aux stimuli chimiques, électriques et de cisaillement. Cette plateforme in vitro reproduit fidèlement les conditions in vivo.

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Ce travail a été soutenu financièrement par le ministère de la Science et de la Technologie de Taïwan dans le cadre du contrat n°. MOST 104-2311-B-002-026 (K. Y. Lo), n° MOST 104-2112-M-030-002 (Y. S. Sun), et National Taiwan University Career Development Project (103R7888) (K. Y. Lo). Les auteurs remercient également le Center for Emerging Material and Advanced Devices de l’Université nationale de Taïwan pour l’utilisation de la salle de culture cellulaire.

1. Chip Conception et fabrication <ol><li> Dessiner des motifs à ablater sur des substrats en PMMA et bandes double-face en utilisant un logiciel commercial 24. <ol><li> Pour étudier les effets des concentrations chimiques et les contraintes de cisaillement, dessiner un motif &quot;arbre de Noël&quot; avec une largeur variable à son extrémité dans chacune des cinq zones de culture (Figure 1A et 1B). </li><li> Pour étudier les effets des concentrations chimiques et les champs électriques, dessiner un motif &quot;arbre de Noël&quot; avec deux canaux plus fluidiques pour les ponts de sel (Figure 2A et 2B). </li></ol></li><li> Scribe un pattern individuel sur une feuille de PMMA ou d&#39; un ruban adhésif double-face en chargeant le fichier correspondant dans le Traceur laser CO 2. <ol><li> Allumez le Traceur laser, et vérifier sa connexion à l&#39;ordinateur. Ouvrir le modèle pour ablater à l&#39;aide du logiciel commercial. </li><li> Placez une feuille de PMMA ou d&#39;un ruban adhésif double face on haut de la scène du scriber. Réglez la mise au point du laser CO 2 si nécessaire en utilisant la barre d&#39;étalonnage et le visible laser He-Ne. </li><li> Chargez le motif dans le scriber pour l&#39;ablation sur la feuille de PMMA ou de la bande. </li><li> Ramasser la feuille à motifs ou de ruban, retirez les morceaux non désirés, et nettoyer la surface avec insufflation d&#39;azote. NOTE: L&#39;épaisseur de la feuille de PMMA est de 1 mm, et celle du ruban adhésif double face est de 0,07 mm ou 0,22 mm. </li></ol></li></ol> 2. Assemblée Chip <ol><li> Avec la colle super, fixer des adaptateurs acryliques (longueur x largeur x hauteur = 10 mm x 10 mm x 5 mm, avec des filets de vis dans le milieu) vers le haut-couche la plus de la puce en alignant les filetages et les trous sur le dessus couche -la plupart. Ces adaptateurs servent de support entrées / sorties et des connecteurs de pont de sel. </li><li> Assembler la puce microfluidique dans une hotte à flux laminaire. </li><li> Assembler la puce microfluidique contrainte chimique cisaillement (puce CSS). <ol><li> UNEttach 3 feuilles de plaques de PMMA prescrites en utilisant 2 morceaux de ruban adhésif double face décrit. (Figure 1A et 1B). </li><li> Ajouter un morceau de la bande double face 0,07 mm d&#39;épaisseur plus au fond de la puce et fixer la puce à un diamètre boîte de Pétri de 10 cm. </li><li> Mettre la puce d&#39;assemblage dans la chambre à vide pour la nuit. </li></ol></li><li> Pour assembler la puce de domaine chimique-électrique (puce CEF), fixer la feuille de PMMA à un ruban adhésif double face d&#39;épaisseur = 0,22 mm (figure 2A et 2B). <ol><li> Fixer la feuille de PMMA décrit et ruban adhésif double face à un diamètre boîte de Pétri de 10 cm en utilisant ce même morceau de ruban adhésif. </li></ol></li><li> Laissez la puce assemblé à l&#39;intérieur du capot et l&#39;exposer aux UV pendant 30 min pour la stérilisation. </li><li> Connecter les entrées à deux seringues de 3 ml par des tubes en plastique et les écrous des doigts serrés. Connectez la sortie à un tuyau d&#39;évacuation par l&#39;intermédiaire d&#39;un tube en plastique et un écrou serré à la main. NOTE: Autoclavetous les tubes et les écrous à 121 ° C pendant 15 minutes avant utilisation. </li><li> Appuyez doucement sur le piston de la seringue pour les premiers canaux fluidiques avec PBS. Poussez les seringues avant et en arrière pour éliminer les bulles. </li><li> Placer les puces à l&#39; intérieur d&#39; un incubateur pendant une nuit à 37 ° C sous 5% de CO 2. NOTE: Ces deux étapes ont pour but de se laver la puce et éliminer les bulles restant dans la puce. </li><li> Prenez la puce de l&#39;incubateur. </li><li> Préparer des ponts de sel d&#39;agar pour générer des champs électriques dans la puce CEF. <ol><li> Dissoudre 3% bas point de fusion d&#39;agarose dans un tampon phosphate salin (PBS) 1 x tampon en utilisant un micro-ondes. </li><li> Injecter solution progressive d&#39;agarose dans le canal de pont de sel et d&#39;insérer les électrodes avant solution se solidifie. </li><li> Placez des électrodes en argent / chlorure d&#39;argent dans les écrous tubulaires. </li></ol></li><li> Connecter les seringues aux pompes à seringue, et l&#39;écoulement continu du milieu de culture (Modifié eagler Dulbecco17; s milieu DMEM) dans le canal fluidique pendant 10 min à un débit de 20 ul / min pour remplacer le PBS. </li></ol> 3. Préparation des cellules et configuration expérimentale NOTE: Pré-chaud 1x PBS, milieu de culture (DMEM plus FBS), et de la trypsine dans un bain de 37 ° C de l&#39;eau avant utilisation. <ol><li> Plaque cellules CL1-5 2 x 10 5 cancer du poumon 25,26 dans une boîte de Petri de 10 cm fourni avec du DMEM plus 10% de sérum de fœtus bovin (FBS). Incuber les cellules dans un incubateur sous 5% de CO2 à 37 ° C jusqu&#39;à 90% de confluence. </li><li> Aspirer le milieu et laver les cellules une fois avec préchauffé 1x PBS. Ajouter 2 ml de tampon de trypsine à 0,05% dans les cellules et attendre pendant 2 à 3 min à 37 ° C pour détacher les cellules. </li><li> Transférer les cellules dans un tube de centrifugation stérile de 15 ml et on ajoute 6 ml de milieu de culture dans le tube. Retourner doucement le tube pour mélanger et retirer 5 ul du milieu contenant des cellules pour compter le nombre de cellules dans un hemocytometer. </li><li> Centrifuger le tube à 300 x g pendant 5 min. Suspendre 10 6 cellules dans 1 ml de milieu de culture et placer le milieu contenant des cellules dans une seringue de 1 ml. </li><li> Infuser le milieu contenant des cellules dans la puce microfluidique de la prise et assurez-vous que la solution distribue tout au long des cinq zones de culture. Incuber la puce à l&#39; intérieur d&#39; un incubateur sous 5% de CO 2 à 37 ° C pendant 2 heures. </li></ol> 4. Configuration expérimentale <ol><li> Prenez la puce de l&#39;incubateur et le placer sur le dessus d&#39;un transparent d&#39;oxyde d&#39;indium-étain (ITO) de chauffage de verre. NOTE: Le verre d&#39;ITO est relié à un régulateur (PID) proportionnel-intégral-dérivé pour maintenir la température à 37 ± 0,5 ° C par l&#39;intermédiaire de la rétroaction d&#39;un coupleur thermique pincé hermétiquement entre le chauffe-ITO et la puce. </li><li> Mettez l&#39;ensemble puce chauffe sur une platine motorisée XY d&#39;un microscope inversé pour le suivi de la migration cellulaire ou à un stade fixe XYun microscope à fluorescence inversé pour mesurer la production de ROS. </li><li> Pour générer différentes concentrations de produits chimiques, remplir deux seringues avec 5 ml de solutions chimiques de concentrations relatives 0 et 1 (dissous dans un milieu de culture) et pomper les dans la puce à des débits souhaités: dans la puce CSS, à un débit de 0,3 ml de débit / min pendant 1 heure; dans la puce de CEF, à un débit de 20 ul / min pour les 20 premières minutes et un débit de 20 ul / h pendant 120 min (temps total = 2 heures). </li><li> Dans la puce CEF, pour le suivi de la migration des cellules, programme la phase XY du microscope pour répéter la prise de photos, via un reflex mono-objectif numérique (DSLR) appareil photo, de certains champs de vision (FOV) dans les zones de culture toutes les 15 min pour 2 heure. </li><li> Pour la mesure de la production de ROS, utiliser l&#39;indicateur basé sur la fluorescence-2&#39;-7&#39;-dichlorodihydrofluoresce diacétate (2&#39;-7&#39;-DCFDA). <ol><li> Préparer le stock de 2&#39;-7&#39;-DCFDA à 10 mM dans qualité de biologie moléculaire diméthylsulfoxyde (DMSO). DCFDA diluer dans du DMEM sans sérum seul (5 uM dans du DMEM). Le déacétylase potentiel pourrait augmenter les signaux de fond et de diminuer les signaux dans les cellules. </li><li> Après 1 h de cisaillement stimulus de stress dans la puce CSS ou après 2 h de EF stimulus dans la puce CEF, pompe 2&#39;-7&#39;-DCFDA (5 uM dans DMEM) dans la puce à un débit de 20 ul / min pour les 20 premières minutes et un débit de 20 ul / h pendant 20 min. Pour le lavage, la pompe DMEM dans la puce à un débit de 20 ul / h pendant 20 min. </li><li> Prenez des photos, via une caméra dispositif à couplage de charge (CCD), de certains FOV dans les zones de culture pour analyser les intensités de fluorescence. </li></ol></li></ol> 5. Calculs de concentrations chimiques, des contraintes de cisaillement, et les champs électriques <ol><li> Dans les deux la puce CSS et la puce de CEF, calculer les concentrations de produits chimiques dans les cinq domaines de la culture. Par exemple, par injection de H 2 O 2 de concentrations 0 et 200 pM des deux orifices d&#39;entrée, des concentrations de 0, 25, 100, 175 et 200 um sont générés. NOTE: En supposant que tous les liquides d&#39;écoulement divisé en douceur et aussi autour de la fourchette, les concentrations relatives dans les cinq domaines de la culture sont 0, 1/8, 1/2, 7/8 et 1, respectivement. </li><li> Dans la puce CSS, calculer la contrainte de cisaillement (de τ) dans chacune des zones de culture en utilisant <img alt="L&#39;équation 1" src="/files/ftp_upload/54397/54397eq1.jpg" /> 27, où Q est le débit volumique, η est la viscosité fluidique, h est la hauteur du canal, et w est la largeur du canal. NOTE: En réglant Q = 0,3 ml / min dans chaque entrée (Q = 0,12 ml / min dans chaque zone de culture), η = 0,0008 Pa · s pour un milieu de culture, h = 1 mm, et w = 1 ~ 4 mm, le contrainte de cisaillement est calculée à aller de 0,0048 Pa (4 mm de large région) à 0,0192 Pa (1 mm de large région). </li><li> Dansla puce CEF, calculer la force de EF dans chacune des zones de culture en utilisant E = I / (aA eff) (la loi d&#39;Ohm), où I est le courant électrique circulant à travers le canal fluidique, σ est la conductivité électrique du milieu de culture, et A eff est la surface en coupe transversale effective du canal. REMARQUE: L&#39; utilisation σ = 1,38 Ω -1 m -1 pour le milieu de culture et A eff = 0,22 mm 2 (largeur = 1 mm et hauteur = 0,22 mm), la résistance EF est calculée pour être E (mV / mm) = I ( A) × 3,3 × 10 6. <ol><li> Comme le montre la figure 2D, traiter le circuit équivalent de cinq circuits C-section avec quatre (8 + 35 + 8) segments et un (5 + 35 + 5) segment. NOTE: En analysant ce circuit parallèle selon la loi de tension de Kirchhoff et la loi d&#39;Ohm, les courants circulant à travers la culture sont cinqcomme, I 1 à I 5 de bas en haut, sont calculés pour être autour de 0,49 I (zone 1), 0,25 I (zone 2), 0,13 I (zone 3), 0,08 I (zone 4), et 0,05 I (zone 5), respectivement, où I est le total courant continu (cC). Avec un courant continu appliqué de 0,157 mA, FE de 254, 130, 67, 41, et 26 mV / mm sont générées dans les cinq domaines de la culture. NOTE: Pour une analyse électrique simplifiée du réseau microfluidique, tous les segments fluidiques sont considérés comme des résistances avec une résistance proportionnelle à leur longueur. </li></ol></li></ol> Analyse 6. Données Remarque: L&#39;analyse des données est effectuée à l&#39;aide du logiciel ImageJ. <ol><li> Analyser la production de ROS. <ol><li> Exécutez le logiciel ImageJ. Allez dans &quot;Fichier&quot; → Ouvrir pour charger une image fluorescente à analyser. </li><li> Aller à &quot;Image&quot; → &quot;Type&quot; → &quot;16-bit&quot; pour changer l&#39;imâge à une échelle de gris. </li><li> Dessiner un polygone pour entourer une cellule. Allez sur &quot;Analyser&quot; → &quot;Mesure&quot; pour mesurer l&#39;intensité de fluorescence moyenne de la cellule. </li><li> Répétez 6.1.3 pour recueillir des intensités d&#39;au moins 50 cellules de trois expériences indépendantes, et de calculer l&#39;intensité moyenne avec l&#39;erreur standard de la moyenne (SEM). </li><li> Répétez 6.1.1-6.1.4 pour chaque condition expérimentale. </li></ol></li><li> Analyser la migration cellulaire. <ol><li> Exécutez le logiciel ImageJ. Allez dans &quot;Fichier&quot; → Ouvrir pour charger une image prise au temps = 0 à analyser. </li><li> Dessiner un polygone pour entourer une cellule. Allez sur &quot;Analyser&quot; → &quot;Mesure&quot; pour mesurer le centre de masse de la cellule (x 1, y 1). </li><li> Répéter 6.2.1- 6.2.2 pour mesurer le centre de masse de la même cellule que (x 2, y 2) d&#39; une autre image prendre au temps = t. </li><li> Calculer le taux de migration (en um / h) decette cellule <img alt="équation 2" src="/files/ftp_upload/54397/54397eq2.jpg" /> . </li><li> Répétez 6.2.1-6.2.4 pour recueillir les taux de migration à partir d&#39;au moins 50 cellules de trois expériences indépendantes, et de calculer le taux de migration moyenne avec l&#39;erreur standard de la moyenne (SEM). </li><li> De 6.2.2 et 6.2.3, calculer la directedness de migration de cette cellule comme cosinus θ ou <img alt="l&#39;équation 3" src="/files/ftp_upload/54397/54397eq3.jpg" /> Où θ est l&#39;angle entre le vecteur de l&#39;EF appliquée (du positif au négatif) et le vecteur du début à la position finale de la cellule (figure 2G). </li><li> Répétez 6.2.6 pour recueillir la migration directedness à partir d&#39;au moins 50 cellules de trois expériences indépendantes, et de calculer le directedness de migration moyenne avec l&#39;erreur standard de la moyenne (SEM). </li><li> Calculer le taux de migration moyenne avec SEM et la directedness de migration moyenne avec SEM pour chaque condition expérimentale. NOTE: Un directednessde 1 indique que toutes les cellules migrent vers la cathode, et une valeur -1 indique que toutes les cellules migrent vers l&#39;anode. Le directedness d&#39;un groupe de cellules se déplaçant au hasard est proche de 0. </li></ol></li><li> Analyser l&#39;alignement des cellules. <ol><li> Exécutez le logiciel ImageJ. Allez dans &quot;Fichier&quot; → &quot;Ouvrir&quot; pour charger une image à analyser. </li><li> Traiter la cellule comme une ellipse et tracer une ligne pour indiquer l&#39;axe long d&#39;une cellule. Allez sur &quot;Analyser&quot; → &quot;Mesure&quot; pour mesurer l&#39;angle β entre la ligne et la direction de EF horizontale. </li><li> Répétez 6.3.2 pour recueillir β à partir d&#39; au moins 50 cellules de trois expériences indépendantes, et calculer moyenne cosinus β avec l&#39; erreur standard de la moyenne (SEM). </li><li> Répétez 6.3.1-6.3.3 pour chaque condition expérimentale. REMARQUE: Un cos β de 1 indique que toutes les cellules alignées parallèlement à l&#39;EF appliquée, et une valeur 0 indique que toutes les cellules alignées perpendicularly à l&#39;EF appliquée. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

puces à base de PMMA-sont fabriqués en utilisant l&#39;ablation laser et l&#39;écriture qui sont des méthodes moins coûteuses et plus faciles par rapport aux puces à base de PDMS qui nécessitent la lithographie douce plus compliquée. Après la conception d&#39;une puce microfluidique, la fabrication et l&#39;assemblage peut être fait en seulement 5 min. Il y a quelques étapes critiques que l&#39;attention devrait être accordée à l&#39;exécution de l&#39;expérience. Le premier est la question &quot;assemblage&quot;. Les a...

In vivo dans les cellules sont entourées par une variété de biomolécules , y compris la matrice extracellulaire (ECM), des glucides, des lipides et d&#39; autres cellules. Ils fonctionnaliser en réagissant aux micro-environnement stimuli tels que les interactions avec l&#39;ECM et les réponses aux gradients chimiques de divers facteurs de croissance. Traditionnellement, les études in vitro de cellules sont réalisées dans des boîtes de culture cellulaire dans lesquels la consommation de cellules et les réactifs est grande et les cellules se développent dans un statique (sans circulation) l&#39; environnement. Récemment, des dispositifs micro-fabriqué avec des composants fluidiques intégrés ont fourni une plate-forme alternative pour les études sur les cellules d&#39;une manière plus contrôlable. De tels dispositifs sont capables de créer un micro-environnement précis des stimuli physiques et chimiques, tout en minimisant la consommation des cellules et des réactifs. Ces puces microfluidiques peuvent être constitués de substrats de verre, des plaquettes de silicium, des polydiméthylsiloxanes (PDMS), les polymères de polyméthacrylate de méthyle (PMMA), des substrats ou polyethyleneterephtalate (PET) substrats 1-3. dispositifs à base de PDMS sont transparents, biocompatible et perméable aux gaz, les rendant aptes à la culture et les études cellulaire à long terme. PMMA et PET substrats doivent être traitées par ablation laser et l&#39;écriture pas cher et facile. Les dispositifs microfluidiques devraient fournir des cellules avec un micro-environnement stable et contrôlable, où les cellules sont soumises à des stimuli chimiques et physiques différentes. Par exemple, les puces microfluidiques sont utilisées pour étudier la chimiotaxie des cellules. Au lieu des méthodes traditionnelles qui emploient chambre de Boyden et capillaire 4,5 ces dispositifs fluidiques miniaturisés peuvent générer des gradients chimiques précis pour étudier le comportement des cellules 1,6,7. Un autre exemple est d&#39;étudier la migration directionnelle de cellules dans des champs électriques (SFE), un phénomène nommé électrotaxie. Comportements Electrotactic de cellules ont été signalés à être liés à la régénération nerveuse 8, le développement embryonnaire 9,et la cicatrisation des plaies 10,11. Et de nombreuses études ont été réalisées pour étudier la électrotaxie de divers types de cellules , y compris les cellules cancéreuses 12,13, 14,15 lymphocytes, des cellules de leucémie 11, et les cellules souches 16. Classiquement, des boîtes de Pétri et les verres de couverture sont utilisés pour construire des chambres electrotactic pour générer 17 FE. Ces configurations simples posent des problèmes d&#39;évaporation moyen et FE imprécis, mais ils peuvent être surmontés par des dispositifs microfluidiques de canaux fluidiques clos, bien définies 12,18,19. Pour étudier systématiquement les réponses cellulaires sous, des stimuli chimiques et électriques contrôlables précis, il serait d&#39;une grande utilité pour développer des dispositifs microfluidiques capables de fournir des cellules avec de multiples stimuli en même temps. Par exemple, Li et al. fait état ​​d&#39; un dispositif microfluidique à base de PDMS pour la création simple ou coexistant gradients chimiques et FE 20. Kao et al. developed une puce microfluidique similaire à moduler le chimiotactisme des cellules de cancer du poumon par EF 6. Par ailleurs, pour augmenter le débit, Hou et al. conçu et fabriqué une puce multicanal à double champ électrique à base de PMMA pour fournir des cellules avec 8 stimuli combinés différents, (concentrations 2 points forts EF x 4 chimiques) étant 21. Pour augmenter encore la partout et ajouter la contrainte de cisaillement stimulus, nous avons développé deux dispositifs microfluidiques à base de PMMA-pour étudier les réponses cellulaires sous chimiques unique ou coexistant / électriques / cisaillement stimuli de stress. Rapporté par Lo et al. 22,23, ces appareils contiennent cinq canaux de culture cellulaire indépendants , soumis à continu fluidiques fluide, imitant le système circulatoire in vivo. Dans la première puce (la puce chimique contrainte de cisaillement ou de la puce CSS), cinq concentrations relatives de 0, 1/8, 1/2, 7/8 et 1 sont générés dans les régions de culture, et un gradient de contrainte de cisaillement est produced l&#39;intérieur de chacune des cinq zones de culture. Dans la seconde puce (la puce chimique-champ électrique ou la puce CEF), à l&#39;aide d&#39;un seul ensemble d&#39;électrodes et de 2 pompes à seringue, cinq forces de EF sont générés en plus de cinq concentrations chimiques différentes dans ces zones de culture. les calculs et les simulations numériques sont réalisées pour mieux concevoir et exploiter ces puces, et les cellules de cancer du poumon en culture à l&#39;intérieur de ces appareils sont soumis à des stimuli simples ou coexistants pour observer leurs réactions par rapport à la production d&#39;espèces réactives de l&#39;oxygène (ROS), le taux de migration, et la direction de la migration. Ces puces sont mises en évidence pour être un gain de temps, à haut débit et des dispositifs fiables pour étudier comment les cellules répondent à divers stimuli micro-environnement.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>11965-092</td><td>Milieu de culture cellulaire</td></tr><tr><td>Trypsine</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td>détacher la cellule de la boîte</td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin (FBS)</td><td>Gibco</td><td>10082147</td><td>Milieu de culture cellulaire</td></tr><tr><td>10 cm culture cellulaire Boîte de Pétri</td><td>Nunc</td><td>150350</td><td>Culture cellulaire</td></tr><tr><td>Bright-Line&nbsp ; Hémacytomètre</td><td>Sigma</td><td>Z359629</td><td>Équipement de comptage de cellules</td></tr><tr><td>PMMA</td><td>Adaptateur</td> de <td>puce microfluidique</td><td>personnalisé</td></tr><tr><td>Personnalisé</td><td></td><td>Puce microfluidique personnalisée Ruban adhésif</td><td></td></tr><tr><td>double face 0,07/0,22 mm&nbsp ;</td><td>3M</td><td>8018/9088</td><td>Puce microfluidique</td></tr><tr><td>Agarose à faible point de fusion</td><td>Sigma</td><td>A9414</td><td>Pont salin</td></tr><tr><td>2'-7'-dichlorodihydrofluoresce diacétate</td><td>Sigma</td><td>D6883</td><td>Mesure intracellulaire des ROS</td></tr><tr><td>Indium et oxyde d’étain (ITO) verre</td><td>Merck</td><td>300739</td><td>Chauffage</td></tr><tr><td>Contrôleur proportionnel-intégral-dérivé</td><td>JETEC Electronics Co.</td><td>TTM-J4-R-AB</td><td>Régulateur de température</td></tr><tr><td>Coupleur thermique</td><td>TECPEL</td><td>TPK-02A</td><td>Régulateur</td></tr><tr><td>de température CO2 traceur laser</td><td>Outils laser & Technics Corp.</td><td>ILS2</td><td>Fabrication de puces microfluidiques</td></tr><tr><td>Pompes à seringue</td><td>New Era</td><td>NE-300</td><td>Pompage de fluides et de produits chimiques dans la puce</td></tr><tr><td>Alimentation Principales</td><td>sciences&nbsp ;</td><td>MP-300V</td><td>Alimentation en courants continus Microscope</td></tr><tr><td>inversé</td><td>Olympus</td><td>CKX41</td><td>Surveillance de la migration des cellules</td></tr><tr><td>Microscope à fluorescence inversée</td><td>Nikon</td><td>TS-100</td><td>Surveillance de la migartion des cellules et des signaux fluorescents</td></tr><tr><td>Appareil photo reflex numérique</td><td>Canon</td><td>60D</td><td>Enregistrement d’images en fond clair.</td></tr><tr><td>Caméra CCD</td><td>Nikon</td><td>DS-Qi1</td><td>Enregistrement d’images fluorescentes&nbsp ;</td></tr><tr><td>super colle</td><td>3M Scotch</td><td>7004</td><td>Fixation des adaptateurs sur des substrats en PMMA</td></tr><tr><td>AutoCAD</td><td>Autodesk Inc.</td><td></td><td>Conception de puces microfluidiques</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D8418</td><td>Dissolvant DCFDA</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>National Institutes of Health</td><td></td><td>Quantifier les intensités fluorescentes et la migration cellulaire</td></tr></tbody></table>

conception de dispositifs microfluidiques pour étudier les réponses cellulaires sous simple ou coexistence chimique / électrique / shear stress stimuli

Designing Microfluidic Devices for Studying Cellular Responses Under Single or Coexisting Chemical/Electrical/Shear Stress Stimuli

Les dispositifs microfluidiques sont capables de créer un micro-environnement précis et contrôlable cellulaire du pH, température, concentration de sel, et d&#39;autres stimuli physiques ou chimiques. Ils ont été couramment utilisés pour les études in vitro de cellules en fournissant in vivo comme un cadre. Surtout, comment les cellules réponse aux gradients chimiques, les champs électriques et les contraintes de cisaillement a attiré beaucoup d&#39;intérêts étant donné que ces phénomènes sont importants dans la compréhension des propriétés et des fonctions cellulaires. Ces puces microfluidiques peuvent être constitués de substrats de verre, des plaquettes de silicium, les huiles polydiméthylsiloxanes (PDMS), les polymères polyméthacrylate de méthyle (PMMA), ou des substrats polyéthylènetéréphtalate (PET) substrats. Parmi ces matériaux, les substrats PMMA sont pas cher et peuvent être facilement traitées par ablation laser et l&#39;écriture. Bien que quelques dispositifs microfluidiques ont été conçus et fabriqués pour générer multiple, coexistant stimuli chimiques et électriques, aucun d&#39;entre eux a été considéréassez efficace dans la réduction des répétitions expérimentales, notamment à des fins de dépistage. Dans ce rapport, nous décrivons notre conception et la fabrication de deux puces microfluidiques à base de PMMA-pour étudier les réponses cellulaires, dans la production d&#39;espèces réactives de l&#39;oxygène et de la migration, sous chimiques / électriques / cisaillement stimuli de stress simples ou coexistant. La première puce génère cinq concentrations relatives de 0, 1/8, 1/2, 8/7 et 1 dans les zones de culture, conjointement avec un gradient de contrainte de cisaillement produite à l&#39;intérieur de chacun de ces domaines. La seconde puce génère les mêmes concentrations relatives, mais avec cinq différentes forces de champ électrique créé dans chaque zone de culture. Ces dispositifs fournissent non seulement des cellules avec un micro-environnement contrôlable précise, mais aussi augmenter considérablement le débit expérimental.

Le stress chimique-cisaillement (CSS) Chip La puce CSS est constituée de trois plaques de PMMA, chacune d&#39; une épaisseur de 1 mm, fixés entre eux par deux rubans double face, chacun d&#39;épaisseur 0,07 mm (figure 1A et 1B). La structure &quot;arbre de Noël&quot; génère cinq concentrations relatives de 0, 1/8, 1/2, 7/8, et 1 dans les cinq domaines de la culture. En concevant la zone de cul...

Des dispositifs microfabriqués intégrés à des composants fluidiques fournissent une plate-forme in vitro pour des études cellulaires imitant le micro-environnement in vivo. Nous avons développé des puces microfluidiques à base de polyméthacrylate de méthyle pour étudier les réponses cellulaires sous des stimuli de stress chimique/électrique/de cisaillement uniques ou coexistants.

Conception de dispositifs microfluidiques pour étudier les réponses cellulaires Sous simple ou Coexistence chimique / électrique / Shear Stress Stimuli

Microfluidic devices are capable of creating a precise and controllable cellular micro-environment of pH, temperature, salt concentration, and other ...

L'objectif général de cette procédure est de concevoir et de fabriquer des dispositifs microfluidiques permettant d'observer la réponse des cellules à des stimuli environnementaux. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés en biologie cellulaire et en génie biomédical, telles que la manière dont les cellules réagissent sous différents stimuli environnementaux, notamment des produits chimiques, des contraintes de cisaillement et des champs électriques. Le principal avantage de cette technique est que les tubes sont faciles à fabriquer et à assembler. De plus, ces dispositifs microfluidiques peuvent reproduire des conditions in vivo avec des capacités remarquables. La démonstration de la procédure sera réalisée par Tzu-Yuan Chou, un étudiant de licence de mon laboratoire, et Hsien-San Hou, un chercheur postdoctoral du laboratoire du Dr Julian Chung. Pour commencer, allumez le graveur au laser au dioxyde de carbone et vérifiez sa connexion à l'ordinateur. Chargez ensuite un motif prédessiné de sapin de Noël, tel qu'un des motifs illustrés ici, dans le graveur. Placez ensuite une feuille de PMMA ou un morceau de ruban adhésif double face sur la platine du graveur. Réglez la mise au point du laser au dioxyde de carbone à l’aide de la barre d’étalonnage et du laser visible hélium-néon. Gravez ensuite le motif sur le substrat. Une fois terminé, prenez le substrat gravé, retirez les pièces indésirables et utilisez un flux d’azote pour nettoyer la surface de tout débris résiduel. Répétez ce processus pour chaque composant de la puce. Assemblez la puce microfluidique de cisaillement chimique. Pour ce faire, fixez trois feuilles de PMMA gravées selon le motif de cisaillement chimique à l’aide de deux morceaux de ruban adhésif double face gravé. Utilisez de la colle cyanoacrylate pour fixer des adaptateurs en acrylique munis de filetages au centre sur la couche supérieure de PMMA de la puce, en alignant les filetages et les trous. Ces adaptateurs serviront d’entrées, de sorties pour le milieu et de connecteurs pour les ponts salins. Ajoutez ensuite un autre morceau de ruban adhésif double face de 0,7 mm d’épaisseur sur la face inférieure de la puce, puis fixez la puce sur une boîte de Pétri de 10 cm de diamètre. Une fois assemblée, placez la puce dans une chambre sous vide pendant toute la nuit. Assemblez maintenant la puce champ chimique-électrique. Fixez la feuille de PMMA gravée pour la puce champ chimique-électrique avec du ruban adhésif double face sur une boîte de Pétri de 10 cm de diamètre. Avant d'utiliser les puces, exposez-les à la lumière UV pendant 30 minutes afin de les stériliser. Ensuite, reliez les entrées des puces à des seringues de 3 ml remplies de PBS à l’aide de tubes en plastique et d’écrous vissés à la main. De la même manière, reliez les sorties à un tube de récupération des déchets. Appuyez lentement sur le piston de la seringue pour amorcer les canaux fluidiques avec du PBS. Poussez et tirez la seringue plusieurs fois pour éliminer les bulles, puis placez les puces dans une étuve à 37 °C pendant toute la nuit. Pour configurer les puces champ chimique-électrique, remplissez les écrous tubulaires avec de l’agarose à 3 % afin de mettre en place les ponts salins. Insérez ensuite des électrodes en argent-chlorure d’argent dans les écrous tubulaires. Faites croître des cellules de cancer du poumon CL1-5 dans du D-MEM supplémenté avec 10 % de FBS jusqu’à ce qu’elles atteignent une confluence de 90 %. Aspirez ensuite le milieu. Lavez les cellules une fois avec du PBS préchauffé. Ajoutez 2 ml d’une solution tampon de trypsine à 0,5 % dans une plaque de 10 cm de diamètre. Replacez les cellules à 37 °C

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Conception de dispositifs microfluidiques pour étudier les réponses cellulaires Sous simple ou Coexistence chimique / électrique / Shear Stress Stimuli (Vidéo) | JoVE Journal

Conception de dispositifs microfluidiques pour étudier les réponses cellulaires Sous simple ou Coexistence chimique / électrique / Shear Stress Stimuli

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