Anionique Polymérisation d'un copolymère amphiphile pour la préparation du copolymère bloc micelles Stabilisé par π-tc Interactions Stacking

L'objectif général de ce travail est de démontrer les étapes essentielles nécessaires à la synthèse de matériaux en copolymères séquencés par polymérisation anionique en ouverture de cycle, et de montrer la démarche indispensable pour formuler des micelles en copolymères séquencés contenant un médicament hydrophobe. Ce protocole illustre la bonne exécution des étapes et procédures requises pour la synthèse d'un copolymère séquencé par polymérisation anionique. Le principal avantage de la polymérisation anionique en ouverture de cycle réside dans la synthèse de matériaux avec un bon rendement et une faible dispersité.

Ainsi que la possibilité de produire le procédé à plus grande échelle. C'est une période passionnante pour les systèmes de délivrance de médicaments polymériques. Un certain nombre de médicaments reposant sur des formulations et des micelles de copolymères à blocs sont actuellement en phase préclinique avancée ou en développement clinique.

Préparer les réactifs et les matériaux pour le transfert comme décrit dans le protocole écrit. Peser le méthoxypolyéthylène glycol ayant un poids moléculaire de 5 000. Ajouter le mPEG dans un flacon séché contenant un barreau d'agitation, puis sceller l'adaptateur de purge avec un septum en haut.

Reliez le ballon au collecteur et purgez-le avec de l'argon pendant deux à trois minutes. Tournez le robinet vers la position sous vide pour purger le ballon. Faites tourner le ballon manuellement et séchez de manière homogène le récipient réactionnel à l’aide d’un sèche-cheveux ou d’un pistolet thermique, jusqu’à ce que le mPEG fonde.

Après une minute, rompre le vide en tournant rapidement la vanne du collecteur vers la position Argon par plusieurs mouvements secs afin de refroidir le ballon. Maintenir le macroamorceur polymère sous vide pendant environ deux heures, puis sous Argon avant le début de la réaction. Ensuite, monter deux appareils de distillation sous vide élevé préalablement séchés dans une étuve sous la hotte.

Un appareil sert à la distillation du DMSO, et un autre appareil sert à la distillation du monomère, l'éther de phényl glycérol. Relier les flacons séparés aux deux appareils, puis les installer sur un manteau chauffant hémisphérique ou dans un bain d'huile. Connecter l'eau froide en haut de chaque appareil et au collecteur.

Veillez à ce que chaque appareil soit bien fixé et hermétiquement scellé. Activez le vide à l’aide du robinet. Réglez le chauffage à l’aide d’un régulateur de température et commencez à agiter les solutions.

Après deux heures de distillation en circulation de DMSO, fermer le robinet de vide poussé pour recueillir environ 20 millilitres de solution. Ensuite, relâcher la fraction dans le ballon et répéter l'opération une fois de plus afin de garantir la pureté de la fraction souhaitée qui sera recueillie ultérieurement. Chauffer le ballon contenant le mPEG sous vide à l’aide du pistolet thermique jusqu’à ce que le polymère fonde, puis reconditionner sous argon.

Après deux heures, fermez le robinet de vide poussé et récupérez le volume de solvant. Arrêtez le chauffage et relâchez le vide à partir du collecteur. Libérez de l'argon dans la chambre, comme décrit précédemment.

Sous une pression positive d'argon, reliez un côté de la canule à un cylindre gradué, ou directement au flacon contenant le mPEG, également sous argon, et immergez l'autre extrémité avec précaution dans la fraction fraîchement distillée. Branchez un barboteur supplémentaire sur le flacon, interrompez l'écoulement d'argon et utilisez uniquement la pression d'argon provenant de l'appareil de distillation. Pour éviter tout accident dû à la pression d'argon, ouvrez le bouchon en verre pendant une à deux secondes, puis refermez-le pour poursuivre l'écoulement du DMSO jusqu'à ce que le transfert complet soit terminé.

Ensuite, sous argon, reliez un côté de la canule du cylindre gradué séché, scellé par un septum, à une solution mère de naphtalène potassique 0,3 molaire. Puis, ajoutez un barboteur supplémentaire au cylindre gradué, fermez l'écoulement d'argon vers le cylindre et, sous pression d'argon positive, transférez cinq millilitres de naphtalène potassique 0,3 molaire par canulation depuis la solution mère vers le cylindre gradué. Insérez une autre aiguille du manifold dans le cylindre et retirez le barboteur supplémentaire.

Retirer avec précaution la canule reliée à la solution mère, l'insérer rapidement dans le ballon de réaction, puis relier un piège à bulles supplémentaire. Ensuite, comme décrit précédemment, ajouter la base goutte à goutte jusqu'à ce que la solution devienne foncée. Après la disparition lente de la couleur, ajouter une autre portion jusqu'à ce que la couleur foncée réapparaisse, et répéter jusqu'au transfert complet.

Comme décrit précédemment, transférez le volume souhaité de monomère dans la réaction afin d'atteindre un degré de polymérisation de l'éther de polyphénol glycol d'environ 18 à 20 unités. Laissez la réaction pendant 48 heures à 80 degrés Celsius, sous atmosphère d'argon et avec agitation constante, afin de garantir une polymérisation complète. Arrêtez la réaction par l'ajout de gouttes d'acide chlorhydrique normalisé et de méthanol, comme observé par la disparition de la couleur.

Extraire le naphtalène de la solution de DMSO à l'hexane. Éliminer environ 70 millilitres de DMSO par distillation sous vide. Refroidir la solution, puis ajouter 15 millilitres de THF.

Éliminer le sel de la solution par centrifugation à 5 000 fois g pendant dix minutes. Transférer le surnageant et l'ajouter goutte à goutte à 500 millilitres d'éther diéthylique froid. Recueillir le précipité par filtration ou par centrifugation.

Après avoir répété la précipitation deux fois, sécher le précipité à température ambiante sous la hotte, pendant la nuit, puis sous vide à 30 degrés Celsius pendant 24 à 48 heures, pour un rendement de 85 %. Le copolymère est désormais prêt à être caractérisé, comme décrit dans le protocole textuel. Dissoudre 12 milligrammes de doxorubicine dans un millilitre d'acétonitrile. Ajouter 10 microlitres de triéthylamine et laisser tourner la solution à l’abri de la lumière pendant deux heures.

Dissoudre 45 milligrammes de copolymère dans un millilitre de THF, et agiter pendant la même durée. Ajouter la solution de copolymère à la solution de doxorubicine, puis rincer le flacon contenant le copolymère résiduel avec un volume supplémentaire de THF. Ensuite, ajouter le mélange copolymère-médicament goutte à goutte dans un flacon de 20 millilitres contenant 15 millilitres de solution saline à 0,9 % sous agitation.

Transférez la solution dans un sac de dialyse et effectuez une dialyse contre 500 millilitres de solution saline à 0,9 %. Transférez le dialysat dans un tube de 15 millilitres et centrifugez à 5 000 ×g pendant 15 minutes. Ensuite, transférez le surnageant vers un système d'ultrafiltration contenant une membrane de dialyse.

Placer l'adaptateur d'agitation dans le système d'ultrafiltration, fermer le couvercle et ouvrir le flux d'azote. Concentrer la solution de micelles de copolymères en bloc à un volume de quatre millilitres, puis ajouter six millilitres de sérum physiologique frais. Ensuite, concentrer à nouveau la solution de micelles de copolymères en bloc à 4 millilitres, rincer la chambre avec 0,5 millilitre de sérum physiologique et ajouter le rinçage à la solution.

Conserver la solution obtenue dans des flacons bruns à température ambiante à l’abri de la lumière, avant une utilisation ultérieure. La polymérisation anionique par ouverture de cycle de l’éther de phényl glycérol sur l’initiateur macro-mPEG a été utilisée pour préparer le copolymère dibloc amphiphile par profonde protonation du groupe hydroxyle du mPEG. En utilisant le naphtalène potassium comme anion radicalaire, suivi de la polymérisation du monomère d’éther de phényl glycérol.

La caractérisation du copolymère bloc par chromatographie d'exclusion stérique et par analyse de spectroscopie RMN du proton a confirmé une distribution étroite des masses moléculaires avec un degré de polymérisation de l'éther de phényl glycérol de 15 unités. En milieu aqueux, les copolymères blocs amphiphiles s'assemblent pour former des micelles constituées d'un cœur hydrophobe entouré d'une couche hydrophile. La microscopie électronique en transmission a confirmé une morphologie sphérique, et la diffusion dynamique de la lumière a indiqué un diamètre hydrodynamique de 25 nanomètres.

La doxorubicine a été encapsulée avec succès dans les micelles de copolymères à blocs. Par rapport au médicament protoné libre en solution, l'auto-extinction de la doxorubicine, observée par spectroscopie de fluorescence, a confirmé l'incorporation du médicament dans les micelles polymériques, avec une capacité de charge médicamenteuse allant jusqu'à 14 %. Le profil de libération de la doxorubicine à partir des micelles de copolymères à blocs a indiqué une bonne stabilité de cette formulation à pH neutre, ainsi qu'une libération prolongée du médicament sur quatre jours dans des conditions physiologiquement pertinentes.

Une fois maîtrisée, cette technique peut aider les stagiaires en sciences pharmaceutiques à préparer la synthèse de copolymères diblocs destinés à la vectorisation de médicaments. Cette procédure, décrite ici, peut être appliquée à la synthèse d'une large gamme de copolymères utilisant le PEG comme initiateur. L'accent a ici été mis sur le respect des bonnes pratiques de laboratoire, assurant des conditions anhydres et conduisant à des matériaux de haute qualité.

Après avoir visionné cette vidéo, je devrais avoir une bonne compréhension de la manière de travailler dans des conditions anhydres et être capable d'appliquer ces étapes à la synthèse de polyesters PEG ou de matériaux en polyester PEG. Lors de la réalisation de l'une des recherches décrites, il est essentiel de se rappeler que vous travaillez dans des conditions contrôlées, avec des solvants organiques potentiellement dangereux et d'autres agents. En outre, tous les médicaments sont toxiques et doivent être manipulés en prenant les précautions nécessaires.

Par exemple, porter des gants, une blouse de laboratoire, des chaussures fermées, ainsi qu'un masque lorsque vous souhaitez peser les médicaments.