Name: Travailler avec des cellules Auditory HEI-OC1 (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: Apprenez les procédures standardisées pour cultiver les cellules HEI-OC1, une lignée auditive murine utilisée pour étudier les effets pharmacologiques sur les cellules de l'oreille interne et caractériser la protéine motrice prestin.

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Ce travail a été soutenu par les subventions R01-DC010146 et R01-DC010397 des NIH. Son contenu relève de la seule responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement l’opinion officielle des National Institutes of Health.

<ol><li>Jat, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+derivation+of+conditionally+immortall+cell+lines+from+an+H-2Kb-tsA58+transgenic+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Direct derivation of conditionally immortall cell lines from an H-2Kb-tsA58 transgenic mouse.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 88, 5096-5100 (1991).</li>
<li>Kalinec, G. M., Webster, P., Lim, D. J., Kalinec, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cochlear+cell+line+as+an+in+vitro+system+for+drug+ototoxicity+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Audiol.+Neurootol%22%5BJournal%5D)">A cochlear cell line as an in vitro system for drug ototoxicity screening.</a> Audiol. Neurootol. 8, 177-189 (2003).</li>
<li>Devarajan, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cisplatin-induced+apoptosis+in+auditory+cells%3A+role+of+death+receptor+and+mitochondrial+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Hear+Res%22%5BJournal%5D)">Cisplatin-induced apoptosis in auditory cells: role of death receptor and mitochondrial pathways.</a> Hear Res. 174, 45-54 (2002).</li>
<li>Chen, F. Q., Hill, K., Guan, Y. J., Schacht, J., Sha, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+apoptotic+pathways+in+the+absence+of+cell+death+in+an+inner-ear+immortomouse+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Hear+Res%22%5BJournal%5D)">Activation of apoptotic pathways in the absence of cell death in an inner-ear immortomouse cell line.</a> Hear Res. 284, 33-41 (2012).</li>
<li>Hayashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+autophagy+pathway+maintained+signaling+crosstalk+with+the+Keap1-Nrf2+system+through+p62+in+auditory+cells+under+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Signal%22%5BJournal%5D)">The autophagy pathway maintained signaling crosstalk with the Keap1-Nrf2 system through p62 in auditory cells under oxidative stress.</a> Cell Signal. 27, 382-393 (2015).</li>
<li>Tsuchihashi, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+through+4EBP1+and+AMPK+regulates+oxidative+stress-induced+premature+senescence+in+auditory+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Autophagy through 4EBP1 and AMPK regulates oxidative stress-induced premature senescence in auditory cells.</a> Oncotarget. 6, 3644-3655 (2015).</li>
<li>Youn, C. K., Kim, J., Park, J. H., Do, N. Y., Cho, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+autophagy+in+cisplatin-induced+ototoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Pediatr+Otorhinolaryngol%22%5BJournal%5D)">Role of autophagy in cisplatin-induced ototoxicity.</a> Int J Pediatr Otorhinolaryngol. 79, 1814-1819 (2015).</li>
<li>Kalinec, G., Thein, P., Park, C., Kalinec, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HEI-OC1+cells+as+a+model+for+investigating+drug+cytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Hear+Res%22%5BJournal%5D)">HEI-OC1 cells as a model for investigating drug cytotoxicity.</a> Hear Res. 335, 105-117 (2016).</li>
<li>Park, C., Thein, P., Kalinec, G., Kalinec, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HEI-OC1+cells+as+a+model+for+investigating+prestin+function%5BTitle%5D)+AND+%22Hear+Res%22%5BJournal%5D)">HEI-OC1 cells as a model for investigating prestin function.</a> Hear Res. 335, 9-17 (2016).</li>
<li>Celis, J. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCelis%2C+JE+%22Cell+Biology%3A+A+Laboratory+Handbook%22">Cell Biology: A Laboratory Handbook</a>. 1, 3rd, Elsevier Academic Press. (2006).</li>
<li>Bertolaso, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis+in+the+OC-k3+immortalized+cell+line+treated+with+different+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Audiology%22%5BJournal%5D)">Apoptosis in the OC-k3 immortalized cell line treated with different agents.</a> Audiology. 40, 327-335 (2001).</li>
<li>Kalinec, F., Kalinec, G., Boukhvalova, M., Kachar, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+characterization+of+conditionally+immortalized+organ+of+corti+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biol+Int%22%5BJournal%5D)">Establishment and characterization of conditionally immortalized organ of corti cell lines.</a> Cell Biol Int. 23, 175-184 (1999).</li>
<li>Belyantseva, I., Kalinec, G. M., Kalinec, F., Kachar, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+differentiation+of+two+immortalized+cell+lines+derived+from+the+stria+vascularis+of+a+transgenic+mouse%5BTitle%5D)+AND+%2221st+Midwinter+Meeting+Association+for+Research+in+Otolaryngology%22%5BJournal%5D)">In vitro differentiation of two immortalized cell lines derived from the stria vascularis of a transgenic mouse.</a> 21st Midwinter Meeting Association for Research in Otolaryngology. 620a, (1998).</li>
<li>Gratton, M. A., Meehan, D. T., Smyth, B. J., Cosgrove, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strial+marginal+cells+play+a+role+in+basement+membrane+homeostasis%3A+in+vitro+and+in+vivo+evidence%5BTitle%5D)+AND+%22Hear+Res%22%5BJournal%5D)">Strial marginal cells play a role in basement membrane homeostasis: in vitro and in vivo evidence.</a> Hear Res. 163, 27-36 (2002).</li>
<li>Debacq-Chainiaux, F., Erusalimsky, J. D., Campisi, J., Toussaint, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocols+to+detect+senescence-associated+beta-galactosidase+%28SA-betagal%29+activity%2C+a+biomarker+of+senescent+cells+in+culture+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Protocols to detect senescence-associated beta-galactosidase (SA-betagal) activity, a biomarker of senescent cells in culture and in vivo.</a> Nat Protoc. 4, 1798-1806 (2009).</li>
<li>Santos-Sacchi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversible+inhibition+of+voltage-dependent+outer+hair+cell+motility+and+capacitance%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Reversible inhibition of voltage-dependent outer hair cell motility and capacitance.</a> J. Neurosci. 11, 3096-3110 (1991).</li>
<li>Fink, S. L., Cookson, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis%2C+pyroptosis%2C+and+necrosis%3A+mechanistic+description+of+dead+and+dying+eukaryotic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Apoptosis, pyroptosis, and necrosis: mechanistic description of dead and dying eukaryotic cells.</a> Infect Immun. 73, 1907-1916 (2005).</li>
<li>Majno, G., Joris, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis%2C+oncosis%2C+and+necrosis.+An+overview+of+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Apoptosis, oncosis, and necrosis. An overview of cell death.</a> Am J Pathol. 146, 3-15 (1995).</li>
<li>Vanden Berghe, T., Linkermann, A., Jouan-Lanhouet, S., Walczak, H., Vandenabeele, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulated+necrosis%3A+the+expanding+network+of+non-apoptotic+cell+death+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Regulated necrosis: the expanding network of non-apoptotic cell death pathways.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 15, 135-147 (2014).</li>
<li>Sun, L., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+kind+of+cell+suicide%3A+mechanisms+and+functions+of+programmed+necrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem+Sci%22%5BJournal%5D)">A new kind of cell suicide: mechanisms and functions of programmed necrosis.</a> Trends Biochem Sci. 39, 587-593 (2014).</li>
<li>Chan, F. K., Luz, N. F., Moriwaki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programmed+necrosis+in+the+cross+talk+of+cell+death+and+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Programmed necrosis in the cross talk of cell death and inflammation.</a> Annu Rev Immunol. 33, 79-106 (2015).</li>
<li>Vercammen, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+signaling+of+the+Fas+receptor%3A+initiation+of+both+apoptotic+and+necrotic+cell+death+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Dual signaling of the Fas receptor: initiation of both apoptotic and necrotic cell death pathways.</a> J Exp Med. 188, 919-930 (1998).</li>
<li>Campisi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging%2C+cellular+senescence%2C+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Physiol%22%5BJournal%5D)">Aging, cellular senescence, and cancer.</a> Annu Rev Physiol. 75, 685-705 (2013).</li>
<li>Bian, S., Koo, B. W., Kelleher, S., Santos-Sacchi, J., Navaratnam, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+highly+expressing+Tet-inducible+cell+line+recapitulates+in+situ+developmental+changes+in+prestin%27s+Boltzmann+characteristics+and+reveals+early+maturational+events%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">A highly expressing Tet-inducible cell line recapitulates in situ developmental changes in prestin's Boltzmann characteristics and reveals early maturational events.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 299, C828-C835 (2010).</li>
<li>Abe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+expression+of+the+outer+hair+cell+motor+prestin+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Membr+Biol%22%5BJournal%5D)">Developmental expression of the outer hair cell motor prestin in the mouse.</a> J Membr Biol. 215, 49-56 (2007).</li>
<li>Oliver, D., Fakler, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+density+and+functional+characteristics+of+the+outer+hair+cell+motor+protein+are+regulated+during+postnatal+development+in+rat%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Expression density and functional characteristics of the outer hair cell motor protein are regulated during postnatal development in rat.</a> J Physiol. 519 Pt 3, 791-800 (1999).</li>
<li>Tsunoo, M., Perlman, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cochlear+Oxygen+Tension%3A+Relation+to+Blood+Flow+and+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Otolaryngol%22%5BJournal%5D)">Cochlear Oxygen Tension: Relation to Blood Flow and Function.</a> Acta Otolaryngol. 59, 437-450 (1965).</li>
</ol>

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts existant ou potentiel.

Dans ce rapport, nous décrivons comment la culture de cellules HEI-OC1 et les utiliser pour évaluer les mécanismes de la cytotoxicité induite par le médicament et d&#39;étudier les propriétés fonctionnelles des prestine, le moteur moléculaire cochléaire CCEs. Les procédures techniques, cependant, sont suffisamment généraux pour être facilement adapté à différentes études. Tous les protocoles décrits ici nécessitent l&#39;utilisation correcte des techniques de culture cellulaire bien établies...

Maison-oreille Institut organe de Corti 1 (CP1) HEI-cellules sont dérivées de l&#39;organe auditif d&#39;un 1,2 de souris transgéniques. L&#39; incubation d&#39;une cellule à partir de cette souris transgénique à 33 ° C / 10% de CO 2 (conditions permissives) induit l&#39; expression d&#39;un gène immortalisant qui déclenche la dé-différenciation et de la prolifération accélérée; en déplaçant les cellules à 39 ° C / 5% de CO 2 (conditions non permissives) conduisent à une diminution de la prolifération, la différenciation et, au moins dans le cas de HEI-OC1, la mort cellulaire 2,3. cellules HEI-OC1 ont été clonés et caractérisés dans notre laboratoire il y a plus d&#39;une décennie, et les études initiales ont indiqué qu&#39;ils expriment des marqueurs spécifiques des cellules ciliées de la cochlée, comme prestine, myosine 7a, Atoh1, BDNF, calbindine et calmoduline, mais aussi des marqueurs de soutien des cellules telles que la connexine 26 et le récepteur du facteur de croissance des fibroblastes (FGF-R) 2. Par conséquent, il a été suggéré que HEI-OC1 pourrait représenter un common progénitrices des cellules sensorielles et de soutien de l&#39;organe de Corti 2. Des études parallèles fournis des preuves solides que archétypales médicaments ototoxiques comme le cisplatine, la gentamicine et streptomycine caspase-3 activation induite dans ces cellules, tandis que les médicaments considérés comme non-ototoxiques, comme la pénicilline, ne l&#39; ont pas 2,3. Par conséquent, cette lignée cellulaire a été proposé comme un système in vitro pour étudier les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans l&#39; ototoxicité et pour le dépistage de l&#39;ototoxicité potentiel ou propriétés otoprotective de nouveaux médicaments pharmacologiques. On estime que les cellules HEI-OC1 ont été utilisés dans plus de cent cinquante études publiées au cours des dix dernières années. Considérant que , en regardant l&#39;effet pro-apoptotique potentiel des différents médicaments a été le principal objectif de la plupart des études portant sur ​​cette lignée cellulaire, d&#39; autres processus cellulaires importants tels que l&#39; autophagie et la sénescence ont tout juste commencé à étudier dans les cellules HEI-OC1 4-7. jena étude récente de notre laboratoire 8, nous avons utilisé des cellules HEI-OC1 pour collecter un ensemble complet de données sur la mort cellulaire, la survie, la prolifération, la sénescence et l&#39; autophagie induite par différents médicaments pharmacologiques fréquemment utilisés dans la clinique. Nous avons également comparé certaines des réponses des cellules HEI-OC1 avec ceux de HEK-293 (cellules rénales embryonnaires humaines) et des cellules HeLa (cellules épithéliales humaines) recevant un traitement identique. Nos résultats indiquent que les cellules HEI-OC1 répondent à la chaque médicament d&#39;une manière typique, avec une dose unique et de la sensibilité en fonction du temps à au moins l&#39;un des mécanismes à l&#39;étude. Nous avons également souligné dans cette étude qu&#39;une interprétation correcte des résultats expérimentaux , il faudra effectuer des études parallèles avec plus d&#39;une technique 8. Dans une autre étude , nous avons étudié l&#39;utilisation de cellules HEI-OC1 pour évaluer la réponse fonctionnelle de prestine, la protéine motrice de cellules externes cochléaires de cheveux (CCEs) 9 </sup&gt;. Nous avons signalé cytométrie en flux et des études de microscopie confocale à balayage laser sur le motif d&#39;expression prestine, ainsi que la capacité non linéaire (NLC) et des études de serrage des cellules plaquées entières dans les cellules HEI-OC1 cultivées à permissive (P-HEI-OC1) et non permissives (NP-HEI-OC1) conditions. Nos résultats indiquent que les deux augmentation de la localisation de l&#39;expression Prestin et de la membrane plasmatique totale d&#39;une manière dépendant du temps dans les cellules NP-HEI-OC1. Chose intéressante, nous avons également constaté que l&#39;augmentation de la localisation Prestin à la membrane plasmique des cellules NP-HEI-OC1 en corrélation avec une diminution de la Na + K + ATPase, qui translocation de la membrane plasmique vers le cytoplasme sans changements significatifs dans l&#39; expression totale des cellules. De plus, nous avons démontré que les cellules P-HEI-OC1 ont un solide CNL associé à Prestin la fonction motrice, ce qui diminue lorsque la densité des molécules de Prestin présentes à la membrane plasmatique augmente. Au total, ces résultats appuient fortement l&#39;utilité de HEI-OC1 cellules pour étudier les protéines auditives. Dans cet article, vidéo, nous décrivons comment la culture de cellules HEI-OC1, pourquoi il est commode d&#39;utiliser des cellules de plus en plus dans des conditions permissives (P-HEI-OC1) pour les études de cytotoxicité, comment évaluer le mécanisme / s de la cytotoxicité induite par le médicament et comment d&#39;effectuer des études électrophysiologiques (par exemple, patch-clamp, la capacité non-linéaire (NLC)) pour étudier les propriétés fonctionnelles des prestine, le moteur moléculaire CCEs cochléaires.

<table><tbody><tr>Cellules <td></td><td></td><td>HEI-OC1</td><td>TOUS LES KITS DE DOSAGE, ÉQUIPEMENTS&nbsp ;</td></tr><tr><td>Classe II Armoire de sécurité biologique</td><td>La société Baker</td><td>Sterilgard III</td><td>ET LES SOCIÉTÉS INDIQUÉES DANS LA</td></tr><tr><td>CENTRIFUGEUSE RÉFRIGÉRÉE</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td>PRÉCÉDENT 2 COLONNES NE SONT QUE</td></tr> DES EXEMPLES DE <tr><td>MICROSCOPE INVERSÉ</td><td>Zeiss</td><td>Axiovert 25</td>, <td>ET TOUT AUTRE PRODUIT SIMILAIRE</td></tr><tr>À<td>BAIN D’EAU</td><td>Stovall</td><td>HWB115</td><td>POURRAIT ÊTRE UTILISÉ.</td></tr><tr><td>Compteur de cellules</td><td>Nexcelom</td><td>Cellomètre Auto T4</td><td></td></tr><tr><td>Deux (2) incubateurs de cellules, un à 33 &deg ; C/10 % CO2 et autres à 39 &deg ; C/5 % CO2</td><td>Forma Scientific</td><td>3110</td><td></td></tr><tr><td>Boîtes de culture cellulaire, PS, 100 mm x 20 mm avec évents</td><td>Greinier Bio-One</td><td>664-160</td><td></td></tr><tr><td>Boîtes de culture cellulaire, PS,&nbsp ; 60 mm x 15 mm avec évents&nbsp ;</td><td>Greiner Bio-One</td><td>628160</td><td></td></tr><tr><td>Fioles de culture tissulaire Cellstar&nbsp ; 250 ml</td><td>Greiner Bio-One</td><td>658-175</td><td></td></tr><tr><td>Flacons de culture tissulaire Cellstar 550 ml</td><td>Greiner Bio-One</td><td>660-175</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp ; Plaque de culture cellulaire 6 puits, avec couvercle-Cellstar</td><td>Greiner Bio-One</td><td>657-160</td><td></td></tr><tr><td>Microtest Plaque de culture tissulaire, 96 puits, fond plat avec couvercle</td><td>Becton Dickinson</td><td>353072</td><td></td></tr><tr><td>Micro-Assay-Plate, Chimmey, 96 puits blanc, fond transparent</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655098</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Tube conique en polypropylène avec bouchon Cellstars</td><td>Becton Dickinson&nbsp ;</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>15 ml Tubes coniques en polypropylène avec capuchon-Cellstars</td><td>Greiner Bio-One</td><td>188-271</td><td></td></tr><tr><td>PBS pH 7,4 (1x)&nbsp ;</td><td>Life Technologies</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Aigle modifié' s Medium (DMEM)</td><td>Life Technologies</td><td>11965-084</td><td></td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin (FBS)&nbsp ;</td><td>Hyclone</td><td>SH10073.1</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz’s L-15 Medium, sans rouge de phénol</td><td>Gibco/Invitrogen</td><td>21083-027</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine, 0,25 %&nbsp ;</td><td>Life Technologies</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>TACS MTT Kit d’essai de prolifération cellulaire</td><td>Trevigen</td><td>4890-25-K</td><td></td></tr><tr><td>Caspase-Glo 3/7 Essai&nbsp ; kit</td><td>Promega</td><td>&nbsp ; G8091&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Kit de test de prolifération cellulaire BrdU&nbsp ;</td><td>Signalisation cellulaire</td><td>6813</td><td></td></tr><tr><td>Solution de dissociation cellulaire non enzymatique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5789</td><td></td></tr><tr><td>Cell-Tox Green Kit de test de cytotoxicité</td><td>Promega</td><td>&nbsp ; G8741&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Instrument FACSAriaIII&nbsp ;</td><td>BD Biosciences</td><td>&nbsp ; FACSAriaIII</td><td>Avec excitation 488 nm (laser bleu)</td></tr><tr><td>Scanner numérique par transfert</td><td>LI-COR</td><td>C-DiGit</td> Unité d’électrophorèse <td></td></tr><tr><td>et de transfert</td><td>Hoefer</td><td>SE300 miniVE</td><td></td></tr><tr><td>Spectra Max Max 5 Lecteur de plaques avec logiciel Soft Max Pro 5.2</td><td>Dispositifs moléculaires</td><td>SpectraMax 5</td><td></td></tr><tr><td>Amplificateur Patch-clamp</td><td>HEKA</td><td>EPC-10</td><td></td></tr><tr><td>Extracteur pour la préparation électrodes patch</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-97</td><td></td></tr></tbody></table>

travailler avec des cellules auditory hei-oc1

Working with Auditory HEI-OC1 Cells

HEI-OC1 est l’une des rares lignées cellulaires auditives de souris disponibles à des fins de recherche. Proposées à l’origine comme système in vitro pour le criblage de médicaments ototoxiques, ces cellules ont été utilisées pour étudier les voies apoptotiques activées par les médicaments, l’autophagie, la sénescence, le mécanisme de protection cellulaire, les réponses inflammatoires, la différenciation cellulaire, les effets génétiques et épigénétiques des médicaments pharmacologiques, les effets de l’hypoxie, le stress oxydatif et endoplasmique du réticulum et l’expression des canaux et récepteurs moléculaires. Parmi plusieurs autres marqueurs importants des cellules ciliées cochléaires, les cellules HEI-OC1 expriment de manière endogène la préstine, la protéine motrice paradigmatique des cellules ciliées externes. Ainsi, ils peuvent être très utiles pour élucider de nouveaux aspects fonctionnels de cette importante protéine auditive. Les cellules HEI-OC1 sont très robustes et leur culture ne présente généralement pas de grandes complications. Cependant, ils nécessitent certaines conditions particulières telles que l’évitement de l’utilisation de cocktails antibactériens courants contenant de la streptomycine ou d’autres antibiotiques ainsi que l’incubation à 33 °C pour stimuler la prolifération cellulaire et l’incubation à 39 °C pour déclencher la différenciation cellulaire. Nous décrivons ici comment cultiver des cellules HEI-OC1 et comment les utiliser dans certains tests typiques, tels que la prolifération cellulaire, la viabilité, la mort, l’autophagie et la sénescence, ainsi que comment effectuer des mesures de capacité patch-clamp et non linéaires.

Dans quelques publications récentes , nous avons signalé un ensemble complet d&#39;études visant à évaluer la réponse des cellules HEI-OC1 à plusieurs médicaments pharmacologiques couramment utilisés, ainsi que l&#39; enquête de la fonction prestine 8,9. Dans ces études, nous avons fait usage de tous les protocoles décrits dans les sections précédentes. L&#39; un des résultats de ces études antérieures est que les c...

House Ear Institute-Organ of Corti 1 (HEI-OC1) est l’une des rares lignées de cellules auditives de souris actuellement disponibles à des fins de recherche. Ce protocole décrit comment travailler avec des cellules HEI-OC1 pour étudier les effets cytotoxiques des médicaments pharmacologiques ainsi que les propriétés fonctionnelles des protéines de l’oreille interne.

Travailler avec des cellules Auditory HEI-OC1

HEI-OC1 is one of the few mouse auditory cell lines available for research purposes. Originally proposed as an in vitro system for screening of ototoxic ...

L'objectif général de ce protocole est de décrire les procédures de base pour travailler avec les cellules HEI-OC1, qui peuvent être utilisées pour étudier les effets de médicaments pharmacologiques sur les cellules auditives et contribuer à la caractérisation fonctionnelle de la protéine motrice prestine. Les cellules HEI-OC1 sont utilisées par de nombreux chercheurs à travers le monde dans diverses expériences ayant des objectifs différents et utilisant des techniques variées. Espérons que les procédures décrites ici fourniront une base commune permettant de rendre ces études comparables.Bien entendu, ces procédures expérimentales pourraient être encore améliorées. Toutefois, les différences par rapport à celles décrites ici pourraient être essentielles pour comprendre et expliquer d'éventuels résultats contradictoires. Dans cette démonstration, nous décrirons comment manipuler les cellules HEI-OC1 à partir d'un aliquot congelé jusqu'à l'obtention d'échantillons prêts à être utilisés pour diverses études, en recourant à des techniques largement accessibles.Pour commencer cette procédure, retirez un flacon de cellules HEI-OC1 cryopréservées de l'azote liquide et placez-le dans un bain-marie à 37 degrés Celsius. Immergez uniquement la moitié inférieure du flacon et laissez-le décongeler jusqu'à ce qu'il ne reste qu'une petite quantité de glace dans le flacon. Dans une hotte de sécurité biologique, essuyez l'extérieur du flacon avec de l'alcool à 70 %.Ensuite, prélevez les cellules du flacon et ajoutez-les goutte à goutte, lentement, dans un tube conique de 15 millilitres contenant 10 millilitres de milieu de croissance préchauffé, tel que le DMEM supplémenté en 10 % de FBS. Puis, éliminez le DMSO par centrifugation du tube pendant cinq minutes. Au bout de cinq minutes, éliminez le surnageant et resuspendez les cellules dans neuf millilitres de milieu de croissance frais.Disperser les agrégats ou feuillets de cellules en faisant passer la suspension cellulaire de l'une à l'autre entre la pipette et le milieu trois à quatre fois, la pointe de la pipette touchant le fond du tube. Ensuite, placer le volume total de cellules en suspension dans un milieu de culture dans une boîte de culture cellulaire en plastique non traitée de 100 millimètres de diamètre. Incuber les cellules à 33 degrés Celsius avec 10 %CO2.À cette étape, retirez le milieu ancien et lavez les cellules avec deux millilitres de PBS. Ensuite, recouvrez la monocouche cellulaire avec de la trypsine à 0,25 %. Examinez les cellules à l’aide d’un microscope inversé lorsque 40 % d’entre elles se sont détachées.Si nécessaire, agiter doucement la boîte de culture pour détacher les cellules restantes. Resuspendre les cellules et éliminer la trypsine par centrifugation du tube pendant cinq minutes. Ensuite, jeter le surnageant et resuspendre les cellules dans neuf millilitres de milieu de croissance frais. Puis, disloquer les agrégats ou feuillets cellulaires en aspirant et en rejetant la suspension cellulaire entre la pipette et le milieu, trois à quatre fois, la pointe de la pipette touchant le fond du tube.Procéder à la mise en culture des cellules dans des boîtes de culture de 100 millimètres de diamètre. Les incuber à 33 degrés Celsius avec 10 % CO2 et les diviser autant de fois que nécessaire pour les expériences prévues ou pour générer un nouveau stock. Pour la différenciation, incuber les cellules HEI-OC1 dans des conditions permises jusqu'à ce qu'elles atteignent environ 80 % de confluence.Ensuite, incuber les cellules à 39 degrés Celsius avec 5 %CO2 pendant deux à trois semaines et changer le milieu tous les deux jours pour éliminer les cellules mortes. Commencer cette procédure en comptant les cellules à l’aide d’un compteur cellulaire automatique ou d’un hémocytomètre et ajuster la concentration cellulaire à la valeur requise. Ensuite, semer les cellules dans une plaque de 96 puits transparente à fond plat, dans une plaque de 96 puits à parois blanches ou dans une plaque de 6 puits.Si nécessaire selon le test particulier, incubez les cellules toute la nuit pour une fixation sur le substrat avant de les traiter avec les médicaments d'intérêt. Ensuite, mesurez le résultat du traitement par cytométrie en flux ou une autre technique appropriée. Pour recueillir les cellules, lavez-les deux fois avec 10 millilitres de PBS sans calcium ni magnésium.Ajoutez deux millilitres de la solution détachante sans enzyme et incubez les cellules pendant trois minutes à 37 degrés Celsius avec 5 %CO2. Utilisez un microscope inversé pour vérifier le détachement des cellules. Si nécessaire, déplacez doucement la boîte de culture cellulaire afin de détacher davantage de cellules, et faites attention de ne pas la secouer.Ensuite, ajoutez 10 millilitres de DMEM complété avec 10 % de FBS et aspirez et dispensez les cellules cinq fois délicatement à l’aide d’une pipette. Ensuite, observez les cellules au microscope. Si plus de 80 % des cellules sont déjà dissociées, aucune pipetage supplémentaire n’est nécessaire.Si les cellules sont encore en amas, continuer à pipeter doucement jusqu'à ce que plus de 80 % des cellules ne soient plus regroupées. Un contrôle optique des cellules doit montrer de nombreuses cellules uniques et rondes aux bords membranaires lisses. Ensuite, procéder aux mesures de patch-clamp et de CLN, comme décrit dans le protocole textuel.Les cellules HEI-OC1 cultivées dans des conditions non permissives ont montré une diminution très significative de la viabilité cellulaire, ainsi qu'une augmentation tout aussi significative de la mort cellulaire par rapport aux cultures cellulaires maintenues dans des conditions permissives. Étant donné que les effets des médicaments sur des cellules déjà en voie de mort ou dont la viabilité est réduite pourraient différer de ceux observés sur des cellules saines, des efforts considérables doivent être consacrés à distinguer les effets des médicaments des effets liés aux conditions de culture dans toute étude de cytotoxicité réalisée sur des cellules HEI-OC1 non permissives. Par conséquent, nous recommandons d'utiliser des cellules HEI-OC1 cultivées dans des conditions permissives pour les expériences qui ne nécessitent pas spécifiquement de cellules différenciées.Les images de microscopie confocale présentées ici confirment l'expression de la protéine motrice auditive préstine dans les cellules HEI-OC1 cultivées à 33 degrés Celsius et à 39 degrés Celsius. Remarquez que la préstine s'immunolocalise principalement dans le cytoplasme des cellules HEI-OC1 se développant dans des conditions perméables, et qu'elle est davantage concentrée au niveau de la membrane plasmique dans les cellules plus différenciées. Des études par cytométrie en flux ont montré une augmentation nette de l'expression de la préstine dans les deux conditions, suggérant que la translocation s'accompagnait d'une synthèse de nouvelles molécules de préstine.D'autre part, les études électrophysiologiques ont révélé une NLC robuste dans les cellules HEI-OC1 cultivées à 33 degrés Celsius, dont la valeur maximale diminuait et dont la tension correspondant à la capacité maximale se déplaçait vers des valeurs plus dépolarisées au fur et à mesure que les cellules étaient transférées dans des conditions non permissives pendant une et deux semaines. Fait intrigant, ces résultats suggèrent que la fonction motrice pourrait être altérée si la densité des molécules de préstin dans la membrane plasmique est trop élevée. Il est important de rappeler que les protocoles décrits ici exigent une utilisation correcte de techniques bien établies de culture cellulaire.De plus, n'oubliez pas d'éviter l'utilisation d'antibiotiques. En outre, rappelez-vous que le phénotype et la réponse des cellules HEI-OC1 dépendront fortement des paramètres de culture.

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