Travailler avec des cellules Auditory HEI-OC1

L’objectif général de ce protocole est de décrire les procédures de base pour travailler avec les cellules HEI-OC1, qui peuvent être utilisées pour étudier les effets des médicaments pharmacologiques sur les cellules auditives, et aider à la caractérisation fonctionnelle de la protéine motrice prestin. Les cellules HEI-OC1 sont utilisées par de nombreux chercheurs du monde entier dans différentes expériences avec des objectifs différents et en utilisant des techniques différentes. Espérons que les procédures décrites ici fourniront une base commune pour rendre ces études comparables.

Bien entendu, ces procédures expérimentales peuvent être encore améliorées. Mais les différences avec celles décrites ici pourraient être essentielles pour comprendre et expliquer des résultats éventuellement contradictoires. Dans cette démonstration, nous décrirons comment travailler avec des cellules HEI-OC1 à partir d’une aliquote congelée jusqu’à avoir des échantillons prêts à réaliser différentes études avec des techniques largement disponibles.

Pour commencer cette procédure, retirez un flacon de cellules HEI-OC1 cryoconservées de l’azote liquide et placez-le dans un bain-marie à 37 degrés Celsius. Immergez uniquement la moitié inférieure du flacon et laissez-le décongeler jusqu’à ce qu’il ne reste qu’une petite quantité de glace dans le flacon. Dans une enceinte de sécurité biologique, essuyez l’extérieur du flacon avec de l’alcool à 70 %.

Ensuite, pipetez les cellules du flacon et déposez tout le volume goutte à goutte, lentement, dans un tube conique de 15 millilitres contenant 10 millilitres de milieu de croissance préchauffé tel que le DMEM complété par 10 % de FBS. Ensuite, retirez le DMSO en centrifugeant le tube pendant cinq minutes. Après cinq minutes, jetez le surnageant et remettez les cellules en suspension dans neuf millilitres de milieu de croissance frais.

Désagréger les amas ou les feuillets de cellules en fluxant et en refluant les cellules en suspension entre la pipette et le milieu trois à quatre fois, l’extrémité de la pipette touchant le fond du tube. Ensuite, placez le volume total des cellules en suspension dans le milieu de croissance dans une boîte de culture cellulaire en plastique non traitée de 100 millimètres de diamètre. Incuber les cellules à 33 degrés Celsius avec 10 % de CO2.

Dans cette étape, retirez l’ancien milieu et lavez les cellules avec deux millilitres de PBS. Ensuite, recouvrez la monocouche cellulaire avec 0,25 % de trypsine. Examinez les cellules à l’aide d’un microscope inversé lorsque 40 % d’entre elles ont été détachées.

Si nécessaire, secouez doucement la boîte de culture pour libérer les cellules restantes Remettez les cellules en suspension et éliminez la trypsine en centrifugeant le tube pendant cinq minutes. Ensuite, jetez le surnageant et remettez les cellules en suspension dans neuf millilitres de milieu de croissance frais. Ensuite, désagrégez les amas ou les feuilles de cellules en fluxant et en refluant les cellules en suspension entre la pipette et le milieu, trois à quatre fois avec la pointe de la pipette touchant le bas du tube.

Procédez à l’ensemencement des cellules dans des boîtes de culture cellulaire de 100 millimètres de diamètre. Incuber à 33 degrés Celsius avec 10 % de CO2 et les diviser autant de fois que nécessaire pour les expériences prévues, ou pour générer un nouveau stock. Pour la différenciation, incubez les cellules HEI-OC1 dans des conditions permissives jusqu’à ce qu’elles atteignent environ 80 % de confluence.

Ensuite, incubez les cellules à 39 degrés Celsius avec 5 % de CO2 pendant deux à trois semaines et changez de milieu tous les deux jours pour éliminer les cellules mortes. Commencez cette procédure en comptant les cellules à l’aide d’un compteur automatique de cellules ou d’un hémocytomètre et ajustez la concentration cellulaire à la valeur requise. Ensuite, ensemencez les cellules dans une plaque à fond plat transparent de 96 puits, une plaque de 96 puits à parois blanches ou une plaque à six puits.

Si le test particulier l’exige, incubez les cellules pendant la nuit pour la fixation du substrat avant de les traiter avec les médicaments d’intérêt. Ensuite, mesurez le résultat du traitement par cytométrie en flux ou une autre technique adéquate. Pour récolter les cellules, lavez-les deux fois avec 10 millilitres de PBS sans calcium ni magnésium.

Ajoutez deux millilitres de la solution de détachage sans enzyme et incubez les cellules pendant trois minutes à 37 degrés Celsius avec 5 % de CO2. Utilisez un microscope inversé pour vérifier le détachement des cellules. Si nécessaire, déplacez doucement la boîte de culture cellulaire pour détacher plus de cellules, et veillez à ne pas la secouer.

Ensuite, ajoutez 10 millilitres de DMEM plus 10 % FBS et pipetez les cellules de haut en bas, doucement, cinq fois. Après cela, examinez les cellules au microscope. Si plus de 80 % des cellules sont déjà séparées, il n’est pas nécessaire de procéder à un pipetage supplémentaire.

Si les cellules sont toujours en grappes, continuez à pipeter doucement jusqu’à ce que plus de 80 % des cellules ne soient plus en grappes. Un contrôle optique des cellules devrait montrer de nombreuses cellules rondes simples avec des bords de membrane lisses. Ensuite, procédez aux mesures patch-clamp et NLC, comme décrit dans le protocole texte.

cellules HEI-OC1 cultivées dans des conditions non permissives ont montré une diminution très significative de la viabilité cellulaire et une augmentation tout aussi significative de la mort cellulaire par rapport aux cultures cellulaires dans des conditions permissives. Étant donné que les effets des médicaments sur les cellules déjà mourantes ou dont la viabilité est réduite pourraient être différents des effets du même médicament sur les cellules saines, des efforts considérables devraient être consacrés à la distinction entre les effets des médicaments et les effets des conditions de culture dans toute étude de cytotoxicité réalisée sur des cellules NP-HEI-OC1. Par conséquent, nous recommandons d’utiliser des cellules HEI-OC1 cultivées dans des conditions permissives pour des expériences qui ne nécessitent pas spécifiquement de cellules différenciées.

Les images confocales présentées ici confirment l’expression de la protéine motrice auditive prestine dans les cellules HEI-OC1 cultivées à 33 degrés Celsius et 39 degrés Celsius. Notez que l’immunolocalisation de la prestine se situe principalement au niveau du cytoplasme des cellules HEI-OC1 qui se développent dans les conditions permissives, et qu’elle est plus concentrée au niveau de la membrane plasmique dans les cellules les plus différenciées. Les études de cytométrie en flux ont montré une nette augmentation de l’expression de la prestine dans les deux conditions, suggérant que la translocation était accompagnée de la synthèse d’un plus grand nombre de molécules de prestine.

D’autre part, les études électrophysiologiques ont montré une NLC robuste dans les cellules HEI-OC1 se développant à 33 degrés Celsius, avec une valeur de crête qui diminuait et une tension à la capacité de crête qui se déplaçait vers des valeurs plus dépolarisées à mesure que les cellules étaient déplacées vers des conditions non permissives pendant une et deux semaines. Curieusement, ces résultats suggèrent que la fonction motrice pourrait être compromise si la densité des molécules de prestine dans la membrane plasmique est trop élevée. Il est important de se rappeler que les protocoles décrits ici nécessitent l’utilisation correcte de techniques de culture cellulaire bien établies.

N’oubliez pas non plus d’éviter l’utilisation d’antibiotiques. De plus, n’oubliez pas que le phénotype et la réponse des cellules HEI-OC1 dépendront fortement des paramètres de culture.