Name: Travailler avec des cellules Auditory HEI-OC1 (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: Apprenez les procédures standardisées pour cultiver les cellules HEI-OC1, une lignée auditive murine utilisée pour étudier les effets pharmacologiques sur les cellules de l'oreille interne et caractériser la protéine motrice prestin.

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<li>Kalinec, G., Thein, P., Park, C., Kalinec, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HEI-OC1+cells+as+a+model+for+investigating+drug+cytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Hear+Res%22%5BJournal%5D)">HEI-OC1 cells as a model for investigating drug cytotoxicity.</a> Hear Res. 335, 105-117 (2016).</li>
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<li>Majno, G., Joris, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis%2C+oncosis%2C+and+necrosis.+An+overview+of+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Apoptosis, oncosis, and necrosis. An overview of cell death.</a> Am J Pathol. 146, 3-15 (1995).</li>
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<li>Sun, L., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+kind+of+cell+suicide%3A+mechanisms+and+functions+of+programmed+necrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem+Sci%22%5BJournal%5D)">A new kind of cell suicide: mechanisms and functions of programmed necrosis.</a> Trends Biochem Sci. 39, 587-593 (2014).</li>
<li>Chan, F. K., Luz, N. F., Moriwaki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programmed+necrosis+in+the+cross+talk+of+cell+death+and+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Programmed necrosis in the cross talk of cell death and inflammation.</a> Annu Rev Immunol. 33, 79-106 (2015).</li>
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<li>Abe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+expression+of+the+outer+hair+cell+motor+prestin+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Membr+Biol%22%5BJournal%5D)">Developmental expression of the outer hair cell motor prestin in the mouse.</a> J Membr Biol. 215, 49-56 (2007).</li>
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</ol>

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts existant ou potentiel.

Dans ce rapport, nous décrivons comment la culture de cellules HEI-OC1 et les utiliser pour évaluer les mécanismes de la cytotoxicité induite par le médicament et d&#39;étudier les propriétés fonctionnelles des prestine, le moteur moléculaire cochléaire CCEs. Les procédures techniques, cependant, sont suffisamment généraux pour être facilement adapté à différentes études. Tous les protocoles décrits ici nécessitent l&#39;utilisation correcte des techniques de culture cellulaire bien établies...

Maison-oreille Institut organe de Corti 1 (CP1) HEI-cellules sont dérivées de l&#39;organe auditif d&#39;un 1,2 de souris transgéniques. L&#39; incubation d&#39;une cellule à partir de cette souris transgénique à 33 ° C / 10% de CO 2 (conditions permissives) induit l&#39; expression d&#39;un gène immortalisant qui déclenche la dé-différenciation et de la prolifération accélérée; en déplaçant les cellules à 39 ° C / 5% de CO 2 (conditions non permissives) conduisent à une diminution de la prolifération, la différenciation et, au moins dans le cas de HEI-OC1, la mort cellulaire 2,3. cellules HEI-OC1 ont été clonés et caractérisés dans notre laboratoire il y a plus d&#39;une décennie, et les études initiales ont indiqué qu&#39;ils expriment des marqueurs spécifiques des cellules ciliées de la cochlée, comme prestine, myosine 7a, Atoh1, BDNF, calbindine et calmoduline, mais aussi des marqueurs de soutien des cellules telles que la connexine 26 et le récepteur du facteur de croissance des fibroblastes (FGF-R) 2. Par conséquent, il a été suggéré que HEI-OC1 pourrait représenter un common progénitrices des cellules sensorielles et de soutien de l&#39;organe de Corti 2. Des études parallèles fournis des preuves solides que archétypales médicaments ototoxiques comme le cisplatine, la gentamicine et streptomycine caspase-3 activation induite dans ces cellules, tandis que les médicaments considérés comme non-ototoxiques, comme la pénicilline, ne l&#39; ont pas 2,3. Par conséquent, cette lignée cellulaire a été proposé comme un système in vitro pour étudier les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans l&#39; ototoxicité et pour le dépistage de l&#39;ototoxicité potentiel ou propriétés otoprotective de nouveaux médicaments pharmacologiques. On estime que les cellules HEI-OC1 ont été utilisés dans plus de cent cinquante études publiées au cours des dix dernières années. Considérant que , en regardant l&#39;effet pro-apoptotique potentiel des différents médicaments a été le principal objectif de la plupart des études portant sur ​​cette lignée cellulaire, d&#39; autres processus cellulaires importants tels que l&#39; autophagie et la sénescence ont tout juste commencé à étudier dans les cellules HEI-OC1 4-7. jena étude récente de notre laboratoire 8, nous avons utilisé des cellules HEI-OC1 pour collecter un ensemble complet de données sur la mort cellulaire, la survie, la prolifération, la sénescence et l&#39; autophagie induite par différents médicaments pharmacologiques fréquemment utilisés dans la clinique. Nous avons également comparé certaines des réponses des cellules HEI-OC1 avec ceux de HEK-293 (cellules rénales embryonnaires humaines) et des cellules HeLa (cellules épithéliales humaines) recevant un traitement identique. Nos résultats indiquent que les cellules HEI-OC1 répondent à la chaque médicament d&#39;une manière typique, avec une dose unique et de la sensibilité en fonction du temps à au moins l&#39;un des mécanismes à l&#39;étude. Nous avons également souligné dans cette étude qu&#39;une interprétation correcte des résultats expérimentaux , il faudra effectuer des études parallèles avec plus d&#39;une technique 8. Dans une autre étude , nous avons étudié l&#39;utilisation de cellules HEI-OC1 pour évaluer la réponse fonctionnelle de prestine, la protéine motrice de cellules externes cochléaires de cheveux (CCEs) 9 </sup&gt;. Nous avons signalé cytométrie en flux et des études de microscopie confocale à balayage laser sur le motif d&#39;expression prestine, ainsi que la capacité non linéaire (NLC) et des études de serrage des cellules plaquées entières dans les cellules HEI-OC1 cultivées à permissive (P-HEI-OC1) et non permissives (NP-HEI-OC1) conditions. Nos résultats indiquent que les deux augmentation de la localisation de l&#39;expression Prestin et de la membrane plasmatique totale d&#39;une manière dépendant du temps dans les cellules NP-HEI-OC1. Chose intéressante, nous avons également constaté que l&#39;augmentation de la localisation Prestin à la membrane plasmique des cellules NP-HEI-OC1 en corrélation avec une diminution de la Na + K + ATPase, qui translocation de la membrane plasmique vers le cytoplasme sans changements significatifs dans l&#39; expression totale des cellules. De plus, nous avons démontré que les cellules P-HEI-OC1 ont un solide CNL associé à Prestin la fonction motrice, ce qui diminue lorsque la densité des molécules de Prestin présentes à la membrane plasmatique augmente. Au total, ces résultats appuient fortement l&#39;utilité de HEI-OC1 cellules pour étudier les protéines auditives. Dans cet article, vidéo, nous décrivons comment la culture de cellules HEI-OC1, pourquoi il est commode d&#39;utiliser des cellules de plus en plus dans des conditions permissives (P-HEI-OC1) pour les études de cytotoxicité, comment évaluer le mécanisme / s de la cytotoxicité induite par le médicament et comment d&#39;effectuer des études électrophysiologiques (par exemple, patch-clamp, la capacité non-linéaire (NLC)) pour étudier les propriétés fonctionnelles des prestine, le moteur moléculaire CCEs cochléaires.

<table><tbody><tr>Cellules <td></td><td></td><td>HEI-OC1</td><td>TOUS LES KITS DE DOSAGE, ÉQUIPEMENTS&nbsp ;</td></tr><tr><td>Classe II Armoire de sécurité biologique</td><td>La société Baker</td><td>Sterilgard III</td><td>ET LES SOCIÉTÉS INDIQUÉES DANS LA</td></tr><tr><td>CENTRIFUGEUSE RÉFRIGÉRÉE</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td>PRÉCÉDENT 2 COLONNES NE SONT QUE</td></tr> DES EXEMPLES DE <tr><td>MICROSCOPE INVERSÉ</td><td>Zeiss</td><td>Axiovert 25</td>, <td>ET TOUT AUTRE PRODUIT SIMILAIRE</td></tr><tr>À<td>BAIN D’EAU</td><td>Stovall</td><td>HWB115</td><td>POURRAIT ÊTRE UTILISÉ.</td></tr><tr><td>Compteur de cellules</td><td>Nexcelom</td><td>Cellomètre Auto T4</td><td></td></tr><tr><td>Deux (2) incubateurs de cellules, un à 33 &deg ; C/10 % CO2 et autres à 39 &deg ; C/5 % CO2</td><td>Forma Scientific</td><td>3110</td><td></td></tr><tr><td>Boîtes de culture cellulaire, PS, 100 mm x 20 mm avec évents</td><td>Greinier Bio-One</td><td>664-160</td><td></td></tr><tr><td>Boîtes de culture cellulaire, PS,&nbsp ; 60 mm x 15 mm avec évents&nbsp ;</td><td>Greiner Bio-One</td><td>628160</td><td></td></tr><tr><td>Fioles de culture tissulaire Cellstar&nbsp ; 250 ml</td><td>Greiner Bio-One</td><td>658-175</td><td></td></tr><tr><td>Flacons de culture tissulaire Cellstar 550 ml</td><td>Greiner Bio-One</td><td>660-175</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp ; Plaque de culture cellulaire 6 puits, avec couvercle-Cellstar</td><td>Greiner Bio-One</td><td>657-160</td><td></td></tr><tr><td>Microtest Plaque de culture tissulaire, 96 puits, fond plat avec couvercle</td><td>Becton Dickinson</td><td>353072</td><td></td></tr><tr><td>Micro-Assay-Plate, Chimmey, 96 puits blanc, fond transparent</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655098</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Tube conique en polypropylène avec bouchon Cellstars</td><td>Becton Dickinson&nbsp ;</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>15 ml Tubes coniques en polypropylène avec capuchon-Cellstars</td><td>Greiner Bio-One</td><td>188-271</td><td></td></tr><tr><td>PBS pH 7,4 (1x)&nbsp ;</td><td>Life Technologies</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Aigle modifié' s Medium (DMEM)</td><td>Life Technologies</td><td>11965-084</td><td></td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin (FBS)&nbsp ;</td><td>Hyclone</td><td>SH10073.1</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz’s L-15 Medium, sans rouge de phénol</td><td>Gibco/Invitrogen</td><td>21083-027</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine, 0,25 %&nbsp ;</td><td>Life Technologies</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>TACS MTT Kit d’essai de prolifération cellulaire</td><td>Trevigen</td><td>4890-25-K</td><td></td></tr><tr><td>Caspase-Glo 3/7 Essai&nbsp ; kit</td><td>Promega</td><td>&nbsp ; G8091&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Kit de test de prolifération cellulaire BrdU&nbsp ;</td><td>Signalisation cellulaire</td><td>6813</td><td></td></tr><tr><td>Solution de dissociation cellulaire non enzymatique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5789</td><td></td></tr><tr><td>Cell-Tox Green Kit de test de cytotoxicité</td><td>Promega</td><td>&nbsp ; G8741&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Instrument FACSAriaIII&nbsp ;</td><td>BD Biosciences</td><td>&nbsp ; FACSAriaIII</td><td>Avec excitation 488 nm (laser bleu)</td></tr><tr><td>Scanner numérique par transfert</td><td>LI-COR</td><td>C-DiGit</td> Unité d’électrophorèse <td></td></tr><tr><td>et de transfert</td><td>Hoefer</td><td>SE300 miniVE</td><td></td></tr><tr><td>Spectra Max Max 5 Lecteur de plaques avec logiciel Soft Max Pro 5.2</td><td>Dispositifs moléculaires</td><td>SpectraMax 5</td><td></td></tr><tr><td>Amplificateur Patch-clamp</td><td>HEKA</td><td>EPC-10</td><td></td></tr><tr><td>Extracteur pour la préparation électrodes patch</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-97</td><td></td></tr></tbody></table>

travailler avec des cellules auditory hei-oc1

Working with Auditory HEI-OC1 Cells

HEI-OC1 est l’une des rares lignées cellulaires auditives de souris disponibles à des fins de recherche. Proposées à l’origine comme système in vitro pour le criblage de médicaments ototoxiques, ces cellules ont été utilisées pour étudier les voies apoptotiques activées par les médicaments, l’autophagie, la sénescence, le mécanisme de protection cellulaire, les réponses inflammatoires, la différenciation cellulaire, les effets génétiques et épigénétiques des médicaments pharmacologiques, les effets de l’hypoxie, le stress oxydatif et endoplasmique du réticulum et l’expression des canaux et récepteurs moléculaires. Parmi plusieurs autres marqueurs importants des cellules ciliées cochléaires, les cellules HEI-OC1 expriment de manière endogène la préstine, la protéine motrice paradigmatique des cellules ciliées externes. Ainsi, ils peuvent être très utiles pour élucider de nouveaux aspects fonctionnels de cette importante protéine auditive. Les cellules HEI-OC1 sont très robustes et leur culture ne présente généralement pas de grandes complications. Cependant, ils nécessitent certaines conditions particulières telles que l’évitement de l’utilisation de cocktails antibactériens courants contenant de la streptomycine ou d’autres antibiotiques ainsi que l’incubation à 33 °C pour stimuler la prolifération cellulaire et l’incubation à 39 °C pour déclencher la différenciation cellulaire. Nous décrivons ici comment cultiver des cellules HEI-OC1 et comment les utiliser dans certains tests typiques, tels que la prolifération cellulaire, la viabilité, la mort, l’autophagie et la sénescence, ainsi que comment effectuer des mesures de capacité patch-clamp et non linéaires.

Dans quelques publications récentes , nous avons signalé un ensemble complet d&#39;études visant à évaluer la réponse des cellules HEI-OC1 à plusieurs médicaments pharmacologiques couramment utilisés, ainsi que l&#39; enquête de la fonction prestine 8,9. Dans ces études, nous avons fait usage de tous les protocoles décrits dans les sections précédentes. L&#39; un des résultats de ces études antérieures est que les c...

House Ear Institute-Organ of Corti 1 (HEI-OC1) est l’une des rares lignées de cellules auditives de souris actuellement disponibles à des fins de recherche. Ce protocole décrit comment travailler avec des cellules HEI-OC1 pour étudier les effets cytotoxiques des médicaments pharmacologiques ainsi que les propriétés fonctionnelles des protéines de l’oreille interne.

Travailler avec des cellules Auditory HEI-OC1

HEI-OC1 is one of the few mouse auditory cell lines available for research purposes. Originally proposed as an in vitro system for screening of ototoxic ...

L'objectif général de ce protocole est de décrire les procédures de base pour travailler avec les cellules HEI-OC1, qui peuvent être utilisées pour étudier les effets de médicaments pharmacologiques sur les cellules auditives et contribuer à la caractérisation fonctionnelle de la protéine motrice prestine. Les cellules HEI-OC1 sont utilisées par de nombreux chercheurs à travers le monde dans diverses expériences ayant des objectifs différents et utilisant des techniques variées. Espérons que les procédures décrites ici fourniront une base commune permettant de rendre ces études comparables.Bien entendu, ces procédures expérimentales pourraient être encore améliorées. Toutefois, les différences par rapport à celles décrites ici pourraient être essentielles pour comprendre et expliquer d'éventuels résultats contradictoires. Dans cette démonstration, nous décrirons comment manipuler les cellules HEI-OC1 à partir d'un aliquot congelé jusqu'à l'obtention d'échantillons prêts à être utilisés pour diverses études, en recourant à des techniques largement accessibles.Pour commencer cette procédure, retirez un flacon de cellules HEI-OC1 cryopréservées de l'azote liquide et placez-le dans un

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Whole-cell patch-clamp enregistrements de dendrites auditives fibres nerveuses au niveau des synapses du ruban des cellules ciliées internes de la cochlée de mammifère.

Enregistrements postsynaptiques au dendrites afférentes Contacter cochléaires cellules ciliées internes: Communiqué multivésiculaires surveillance à une synapse ruban

Une méthode fiable pour enquêter sur des cellules ciliées externes (CCE) des réponses mobiles, y compris électromotilité, la motilité lente et à la flexion, est décrite. Motilité OHC est provoqué par la stimulation par un champ électrique externe en alternance, et la méthode tire parti de l'enregistrement d'images à haute vitesse, un éclairage à base de LED, et la dernière génération de logiciels d'analyse d'image.

Enquêter Outer motilité cellulaire cheveux avec une combinaison de stimulation externe champ électrique alternatif et analyse d&#39;images à haute vitesse

Les implants cochléaires (IC) de permettre l'audition par la stimulation électrique directe du nerf auditif. Cependant, la mauvaise fréquence et la résolution d'intensité limite la qualité de l'audience avec les IC. Nous décrivons ici la stimulation optogenetic du nerf auditif chez la souris comme une stratégie alternative pour la recherche et le développement auditif futurs IC.

Stimulation optogenetic du nerf auditif

Diverses méthodes existent pour introduire des agents ototoxiques dans les cochlées de modèles animaux. Il s’agit d’un protocole chirurgical pour l’administration d’agents ototoxiques dans la niche de la fenêtre ronde. La procédure est fiable, crée des lésions intra-cochléaires ciblées et évite les dommages mécaniques à la microarchitecture. L’examen de l’auto-réparation/régénération cochléaire est possible.

L&#39;approche de la souris ronde-fenêtre pour ototoxiques Delivery Agent: Un rapide et fiable Technique d&#39;incitation à Cochlear dégénérescence cellulaire

Les protocoles actuels pour maintenir les cellules progénitrices otiques multipotentes immortalisées (iMOP) et la différenciation otique sont décrits.  Les conditions de culture et les marqueurs moléculaires qui indiquent la différenciation en épithélium sensoriel et neurones du ganglion spiralé (SGN) sont mis en évidence.

Lancement de différenciation dans immortalisées cellules multipotentes progénitrices otique

Ce protocole décrit les méthodes pour enregistrer la réponse auditif du tronc cérébral de ratons postnatal. Pour examiner le développement fonctionnel des cellules ciliées externes, la procédure expérimentale de cellules entières patch clamp d’enregistrement en isolé les cellules ciliées externes est décrit étape par étape.

Réponse auditif du tronc cérébral et des cellules ciliées externes Whole-cell Patch Clamp enregistrement chez le rat Postnatal

Modèles animaux des implants cochléaires peuvent faire avancer les connaissances des bases technologiques de traiter la surdité permanente avec une stimulation électrique. Cette étude présente un protocole chirurgical pour assourdissant aiguë et de l’implantation cochléaire d’un tableau d’électrode dans la souris ainsi que l’évaluation fonctionnelle avec réponse auditif du tronc cérébral.

Implant cochléaire et les enregistrements de réponse électriquement évoqué auditif du tronc cérébral chez les souris C57BL/6

Cet article présente une méthode modifiée de préparation de surface cochléaire qui exige la décalcification et l'utilisation d'un adhésif de cellules et de tissu pour adhérer aux morceaux d'épithélium cochléaire aux feuillets ronds de couverture de 10 mm pour l'immunohistochimie dans les cochléées adultes de souris.

Préparation de surface cochléaire dans la souris adulte

Nous présentons ici un protocole pour la microscopie à conductance ionique à sonde sautillante (HPICM), une technique de sonde à balayage sans contact qui permet l’imagerie à l’échelle nanométrique des faisceaux de stéréocils dans les cellules ciliées auditives vivantes.

Imagerie de faisceaux stéréocilaires avec résolution à l’échelle nanométrique dans des cellules ciliées auditives de mammifères vivants

Les porcs miniatures (mini-porcs) sont un modèle animal idéal pour la recherche sur les implants cochléaires. La chirurgie d’implantation cochléaire chez les mini-porcs peut être utilisée pour fournir des preuves initiales de la sécurité et de la performance potentielle de nouveaux réseaux d’électrodes et d’approches chirurgicales dans un système vivant similaire aux êtres humains.

Le cochon miniature : un grand modèle animal pour la recherche sur les implants cochléaires

Nous présentons ici un protocole détaillé pour l’isolement et la culture des cellules ciliées cochléaires primaires de souris. Initialement, l’organe de Corti a été disséqué à partir de cochlées murines néonatales (âgées de 3 à 5 jours) au microscope. Par la suite, les cellules ont été digérées enzymatiquement dans une suspension unicellulaire et identifiées par immunofluorescence après plusieurs jours de culture.

Isolement et culture de cellules ciliées cochléaires primaires de souris néonatales

Apprenez les procédures standardisées pour cultiver les cellules HEI-OC1, une lignée auditive murine utilisée pour étudier les effets pharmacologiques sur les cellules de l'oreille interne et caractériser la protéine motrice prestin.

Travailler avec des cellules Auditory HEI-OC1

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