Name: Transplantation Dans le tapis de souris ovarien Fat (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 25 s
Description: Apprenez la transplantation dans le tapis de graisse ovarienne de souris pour étudier les épithéliums normaux et transformés du tractus reproducteur féminin. Cette méthode permet d'analyser le potentiel différenciateur et néoplasique des cellules.

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Nous tenons à remercier le Dr Andrew K. Godwin, University of Kansas Medical Center, pour fournir les cellules humaines HIO118. Ces études ont été soutenues par les subventions du Programme de cellules souches New York (NYSTEM; T028095) et les Instituts nationaux de la santé / Institut national de la santé de l&#39;enfant et du développement humain (P50HD076210) à l&#39;APN, et par les subventions de NYSTEM (C028125, C024174 et T028095), national Institutes of / Institut national de santé du cancer (CA182413) et le Fonds de l&#39;ovaire Cancer Research (327516) à AYN.

Tout le travail in vivo décrit est approuvé par le Comité institutionnel de protection et de l&#39;utilisation des animaux de l&#39;Université Cornell. 1. Exemples de préparation pour l&#39;ovaire Fat Pad Assays <ol><li> Isolement et culture de primaire Tubal épithélium (TE) Cellules <ol><li> Euthanasier donneur de 6 à 8 semaines d&#39;âge vierge β-actine-Enhanced Green Fluorescent Protein (EFGP) ou Red Fluorescent Protein (DsRed) souris β actine-Discosoma par CO 2 l&#39; administration suivie par dislocation cervicale. Vérifier l&#39;euthanasie réussie par un pincement de l&#39;orteil. </li><li> Placez une souris individuelle sur un drap absorbant, ventrale vers le haut, puis essuyez l&#39;abdomen avec 70% d&#39;éthanol. Ouvrir la peau par une incision latérale au niveau de la ligne médiane du corps et du bout des doigts tirer la peau au-dessus et au-dessous de l&#39;incision en direction de la tête et la queue de la souris. </li><li> Tenir le péritoine en utilisant une pince contondants et faire une coupe avec des ciseaux fins pour ouvrir la cavité du corps. Poussez doucement la bobine de l&#39;intestine de côté et localiser les organes reproducteurs. </li><li> Avec une pince fine ramasser une corne utérine et couper 0,5 cm au-dessus du point où les cornes utérines séparent. Tout en maintenant la corne utérine, disséquer le tissu conjonctif attaché à la corne de l&#39;utérus, trompe utérine, coussinet adipeux de l&#39;ovaire et de l&#39;ovaire. Placer l&#39;appareil reproducteur disséquée dans un plat avec 6 ml stérile saline tamponnée au phosphate (PBS). Procéder à la deuxième appareil reproducteur. </li><li> Transférer le plat à une armoire de biosécurité et laver les tissus 3 fois dans 6 ml de PBS stérile. Poursuivre le travail sous un microscope de dissection situé dans l&#39;armoire de biosécurité. Prenez la corne de l&#39;utérus avec une pince fine et déconnecter la corne utérine de la trompe utérine en coupant à la jonction utéro-tubaire. Découpez la bourse ovarienne entourant l&#39;ovaire à l&#39;aide d&#39;une aiguille 25 G. Remarque: Après la bourse ovarienne a été supprimé, la dissection est terminée et le tube individuel de l&#39;utérus reste dans la solution PBS. </li><li> Transférer un single tube de l&#39;utérus dans une goutte de 50 pi de PBS à un plat de 3,5 cm et émincer en morceaux de 0,1 mm en utilisant 28 aiguilles de calibre. Transfert à 200 pi de tampon de digestion 1 (Modified Medium (DMEM) F12 de Eagle de Dulbecco () du milieu de Ham additionné de 300 unités ml - 1 collagénase et de 100 unités ml - 1 hyaluronidase) et incuber pendant 1 heure à 37 ° C dans 5% de CO 2 incubateur. </li><li> Après l&#39;incubation, ajouter 1 ml de 0,25% trypsine-Ethylenediaminetetraacetic acide (EDTA) et de suspendre la solution à l&#39;aide d&#39;une pointe de pipette 1 ml (aka pointe bleue) 20 fois pendant 3 minutes. Ajouter 5 ml + 4 ° C DMEM / F12 de milieu (Ham) contenant 2% de sérum de foetus de bovin. </li><li> Collecter des tissus par centrifugation (600 fcr, 5 minutes, température ambiante (TA)) et ajouter un tampon de digestion de 1 ml 2 (DMEM F12 () du milieu de Ham additionné de 7 mg ml -1 dispase II et 10 pg ml - 1 de la désoxyribonucléase I ( désoxyribonucléase I)). Suspendre pastille de tissu 20 fois avec l&#39;aide d&#39;une pipette de 1 ml tip. </li><li> Ajouter un milieu complet gratuit 5 ml de sérum de croissance souris épithélium tubaire (M-TE-GM, le tableau 1). </li><li> Recueillir les cellules par centrifugation (600 rcf, 5 min, RT). Ajouter 1 ml M-TE-GM, suspendre et compter les cellules par hémocytomètre. Seed 1 x 10 5 cellules dans 1 ml par puits dans une plaque de fixation 24 puits à faible et incuber dans M-TE-GM à 37 ° C dans un incubateur à CO 2 de 5% pendant 4 jours. </li><li> Changer le milieu tous les jours. </li><li> Préparer des suspensions de cellules uniques de cellules cultivées en suspension primaire TE à partir de souris ß-actine-EGFP ou β-actine DsRed. <ol><li> Recueillir des cultures en suspension TE de 24 puits de plaques de fixation faibles. Centrifugeuse (600 fcr, 5 min, RT) et suspendent les culots cellulaires avec 1 ml de 0,25% de trypsine-EDTA. Incuber pendant 10 min à 37 ° C dans un incubateur à CO2 à 5%. </li><li> Arrêter l&#39;activité de la trypsine en ajoutant 5 ml de DMEM / F12 de moyenne (Ham) contenant 5% de sérum bovin foetal. Recueillir les culots cellulaires par centrifugation (600 fcr, 5 min, RT). </li></ol></li><li> culots cellulaires Laver deux fois avec 4 ml de PBS froid (4 ° C), ajouter 1 ml de PBS par culot cellulaire, et suspendre. Compter les cellules par hémocytomètre et transférer 1,7 ml tubes de centrifugation. Travailler sur la glace, ajouter 1 x 10 5 cellules à 10 pi de PBS, puis ajouter 10 ul matrice de membrane basale. Suspendre et transporter sur de la glace à la salle des animaux. Remarque: Effectuer toutes dissection et tissus travaux de culture dans une armoire de biosécurité dans des conditions stériles. </li></ol></li><li> Préparation de Immortalisé Human Cell Line <ol><li> Cultiver séparément lentivirus EGFP et -mCherry marqué immortalisée surface de l&#39; ovaire lineHIO118 de cellules de l&#39; épithélium humain jusqu&#39;à 80-90% de confluence sur les boîtes de 10 cm à 37 ° C dans un incubateur à CO2 à 5%. </li><li> Laver la vaisselle à deux reprises avec 10 ml de PBS, ajouter 1 ml de 0,25% de trypsine-EDTA par boîte et on incube pendant 10 min à 37 ° C dans un incubateur à CO2 à 5%. Arrêter la réaction en ajoutant 10 ml de DMEM / F12 de moyenne (Ham) contenant 5% de sérum bovin foetal. Collecteculots cellulaires par centrifugation (600 RCF, 5 min, RT). </li><li> culots cellulaires Laver deux fois avec 10 ml de PBS froid (4 ° C), ajouter 1 ml de PBS par culot cellulaire, et suspendre. Compter les cellules par hémocytomètre et transférer 1,7 ml tubes de centrifugation. </li><li> Travailler sur la glace, ajouter 1,0 x 10 6 cellules Lenti-mCherry marqués + 1,0 x 10 6 Lenti-EGFP étiquetés cellules à 10 ul de PBS. Ajouter 10 ul de la matrice de membrane basale. Suspendre et transporter sur de la glace à la salle des animaux. </li></ol></li><li> Préparation de la trompe utérine <ol><li> Disséquer tubes utérins individuels de 6 à 8 semaines vieilles souris vierges β-actine-DsRed dans PBS comme décrit dans les étapes 1.1.1-1.1.5. Transférer les trompes utérines uniques dans une goutte 200 ul de PBS sous un microscope de dissection. dérouler doucement trompes utérines à l&#39;aide d&#39;une pince à épiler et 28 des aiguilles de calibre en retirant la mésosalpinx, une partie du ligament large qui supporte les segments de la trompe utérine. Placez trompes utérines spiralées simples dans une goutte de 2PBS 00 ul glacée jusqu&#39;à ovarien coussinet adipeux du destinataire est exposée et prête à recevoir la greffe. </li></ol></li></ol> 2. ovarien Fat Pad Transplantation Note: Désinfecter instruments entre chaque chirurgie animale. Préparer et organiser tout le matériel à l&#39;avance. transplantations dorsaux à droite coussinet adipeux de l&#39;ovaire sont préférentiel car cela évite la rate. Cependant, les bénéficiaires peuvent avoir des greffes dans les deux coussinets adipeux ovariens. <ol><li> Utiliser des souris syngéniques ou déficit immunitaire combiné sévère (SCID / RNC) souris en tant que bénéficiaires de cellules primaires. Pour les cellules humaines, telles que HIO118 cellules / SCID / gamma souris utilisation Nod (NSG) ou des souris SCID. </li><li> Anesthésier souris receveuse avec une seule injection intra-péritonéale de 2,2,2-tribromoéthanol à une dose de 0,15 ml / 10 poids corporel g. Placez l&#39;animal sur un coussin chauffant, dans la hotte des animaux et confirmer anesthetization appropriée par la perte de la pédale réflexe (pincement de l&#39;orteil). Appliquer vétérinaire pommade sur les yeux pour prévenir la sécheresse alors que leanimal est sous anesthésie. Injecter la voie sous-cutanée de l&#39;animal avec le kétoprofène analgésique à une dose de 4 mg / g de poids corporel pour traiter la douleur post-chirurgicale. Remarque: Comme alternative, utilisez isoflurane pour l&#39;anesthésie. Placer l&#39;animal dans la chambre d&#39;admission et d&#39;ajuster le débitmètre d&#39;oxygène de 0,8 à 1,5 l / min et le vaporisateur isoflurane à 2-3%. Retirer l&#39;animal anesthésié de la chambre, laissez-le respirer isoflurane à partir d&#39;un masque et régler le débitmètre d&#39;oxygène à 0,4-0,8 L / min et le vaporisateur isoflurane à 1,5%, puis commencer à la chirurgie. </li><li> Rasez la zone chirurgicale avec # 40 coupe; enlever les poils d&#39;une zone 2 fois la surface chirurgicale, préparer la peau rasée avec trois gommages antiseptiques de povidone-iode, suivie par 70% d&#39;éthanol, et couvrir d&#39;un drap stérile. </li><li> Déplacer l&#39;animal sous un microscope de dissection situé dans une armoire de biosécurité. Exposer l&#39;appareil reproducteur par une incision dans la position dorso directement au-dessus du coussinet adipeux de l&#39;ovaire. Remarque: Critétape ical: Precise incision cutanée facilite la cicatrisation des plaies, l&#39;utilisation d&#39;un scalpel est recommandé à l&#39;étape 2.4. </li><li> Utiliser une pince fine contondants tirer le coussinet adipeux ovarien soigneusement à travers l&#39;incision vers la ligne médiane, minimisant les dommages aux nerfs et les vaisseaux sanguins principaux. Etape critique: En cas de saignement, arrêter la chirurgie et envisager la transplantation d&#39;un animal hôte différent. </li><li> Sous le contrôle du microscope de dissection avec l&#39;aide d&#39;une aiguille biseautée de calibre 28 faire un 2-4 mm incision profonde dans le coussinet adipeux de l&#39;ovaire, 3-4 mm au-dessus de l&#39;ovaire. étape critique: Assurez-vous que l&#39;incision va seulement à travers la moitié du coussinet adipeux; poinçonnement tout le long de la face inférieure provoque des fuites. Soyez rapide et procéder sans délai après cette étape. </li><li> Pour les greffes de cellules, remplir une seringue (aiguille de calibre 30) avec 10-20 ul de la cellule-membrane basale matrice du mélange et injecter dans le pad incision graisse. Pour trompe utérine transplantation, ramasser l&#39;esprit du tube utérinh pince fine et dans 10 - 20 ul matrice de membrane basale conservés dans la glace. L&#39;utilisation d&#39;un pl 0,1-10 / 20 XL diplômé pointe de filtre (raccourci de 3 mm) ramasser le tissu et la membrane basale matrice suspension et la libération dans l&#39;incision de coussinet adipeux. </li><li> Attendre 5 minutes pour la matrice de la membrane basale de se solidifier et placer l&#39;appareil reproducteur de retour dans le péritoine. Fermez les muscles avec 2 stiches de suture chirurgicale et la peau avec deux clips de petites plaies ou suture chirurgicale. </li><li> Répétez les étapes 2,4-2,8 transplanter une membrane PBS-sol matrice-mélange dans le coussinet adipeux contre-latéral de l&#39;animal qui servira de contrôle. étape critique: Après la chirurgie placer l&#39;animal sur un coussin chauffant, parce que la perte de chaleur est rapide chez les souris anesthésiés. </li><li> Laissez l&#39;animal récupérer sur un coussin chauffant dans la cage native et d&#39;observer l&#39;animal jusqu&#39;à complètement réveillé de l&#39;anesthésie. Ne pas laisser un animal sans surveillance jusqu&#39;à ce qu&#39;il ait repris connaissance suffisante pour maintenir sternal décubitus. Ne retournez pas un animal qui a subi une intervention chirurgicale à la compagnie d&#39;autres animaux jusqu&#39;à guérison complète. </li><li> Placez une poignée de boulettes de nourriture pré-humides à l&#39;intérieur de la cage, en plus de la nourriture sèche sur la cage après la chirurgie. Appliquer les analgésiques post-chirurgicales en cas de besoin pour les prochains jours et examiner la plaie quotidienne. Appliquer des antibiotiques selon le protocole animal approuvé si l&#39;infection des plaies se produit. Retirer des agrafes 10 jours après la chirurgie lorsque la plaie est complètement fermée. </li></ol> 3. histologie et Image Acquisition <ol><li> Graft Collection et conservation <ol><li> Préparer une solution de paraformaldehyde à 4% en mélangeant 26 ml ddH 2 O avec 4 ml de PBS et 10 fois une solution de paraformaldehyde 10 ml de 16%. </li><li> Disséquer dans un seul bloc, le tampon entée ovarien de graisse, de l&#39;ovaire, trompe utérine, 0,5 cm utérus comme décrit dans les étapes 1.1.1-1.1.4. Placer immédiatement dans 2 ml 4% de paraformaldéhyde et fixer pendant 2 heures, à la température ambiante. À partir du même animal, disséquer le non grefféecontrolatéral système de coussinet adipeux ovariens transplantés avec le mélange de matrice de la membrane PBS-sous-sol comme un contrôle (voir étape 2.9). Fix et le processus de la même manière. </li><li> Après lavage de fixation des tissus trois fois avec du PBS pendant 5 min et incuber pendant la nuit dans du PBS à 4 ° C. </li><li> Pour l&#39;ensemble de montage imagerie du coussinet adipeux ovarien passez à l&#39;étape 3.2.1. Remarque: Une fois les tissus d&#39;acquisition d&#39;image peuvent être congelés (3.3.1) ou transformés pour l&#39;inclusion en paraffine (3.3.2). incubation d&#39;une nuit dans 30% de saccharose dans du PBS à 4 ° C améliore la qualité des tissus congelés. </li></ol></li><li> Acquisition d&#39;image <ol><li> Placez l&#39;ensemble du montage des systèmes de coussinet adipeux ovariens dans les plats et image à l&#39;aide d&#39;un microscope inversé PBS rempli équipées de fixation epi-fluorescence et haute définition caméra couleur, avec 4, 10x objectifs, et un stéréomicroscope équipé d&#39;un accessoire de fluorescence, caméra couleur et plan Apo 1xWD70, objectifs plan d&#39;ED 1.5xWD45. </li></ol></li><li> Histologie <ol><li> Suivanttoute-mount acquisition d&#39;image (3.2.1) placer une goutte 200-500 pi de milieu d&#39;inclusion pour les spécimens de tissus congelés sur un morceau de film de laboratoire et en utilisant une pince 2 x 1 cm, transférer le tissu à la baisse. Décrochez le film à un bord et transférer la chute de tissu-milieu à un ml flacon cryogénique 1.8. Fermez le flacon et plonger dans l&#39;azote liquide. Stocker les tissus congelés à -80 ° C. </li><li> Vous pouvez également procéder à l&#39;enrobage de paraffine standard. Utilisez 20-40 volumes de volume de tissu pour chaque étape. <ol><li> Immergez tissus une fois dans 65% d&#39;éthanol pendant 30 minutes, en secouant doucement à la température ambiante. </li><li> Immergez tissus une fois dans 70% d&#39;éthanol pendant 30 minutes, en secouant doucement à la température ambiante. A ce stade, les échantillons peuvent être conservés pendant plusieurs mois à température ambiante. </li><li> Immergez tissus une fois dans 90% d&#39;éthanol pendant 30 minutes, en secouant doucement à la température ambiante. </li><li> Immergez tissus une fois dans 95% d&#39;éthanol pendant 30 minutes, en secouant doucement à la température ambiante. </li><li> Immergez tissus à deux reprises dans l&#39;éthanol absolu (200 preuve) pendant 30 min, en secouant doucement à la température ambiante. </li> &lt;li&gt; Immerger les tissus à deux reprises dans le chloroforme pendant 30 minutes, en secouant doucement à la température ambiante. </li><li> Immergez tissus une fois dans de la paraffine pendant 30 minutes, en agitant doucement à 58 ° C. </li><li> Immergez tissus une fois dans de la paraffine pendant 12 heures, en secouant doucement à 58 ° C. </li><li> Immergez tissus une fois dans de la paraffine pendant 3 heures, à 58 ° C. </li><li> Placez les tissus dans des moules d&#39;histologie métalliques et remplir les moules avec 58 ° C de la paraffine. Ajouter une cassette d&#39;histologie plastique sur le dessus de la paraffine et refroidir la paraffine à +4 ° C. Extraire le bloc de paraffine tissus et conserver à la température ambiante. Note: la température de la paraffine ne doit pas dépasser 58 ° C pour une conservation optimale du tissu approprié pour la coloration immunohistochimique. </li></ol></li><li> Vous pouvez également préparer à la Embedding Paraffine avec Gel de traitement des échantillons. <ol><li> Aspirer le PBS et transférer les tissus entiers monture à 70% d&#39;éthanol. Incuber à température ambiante pendant 2 h. Dans un bain d&#39;eau, spécimen de préchauffage traitement gel à 60 ° C. </li><li> Pipette 200 ul du gel de traitement des échantillons sur une boîte de Pétri laboratoire film doublé. Utilisation de fines pinces à dissection transférer l&#39;ensemble de montage système de tissu à la chute de gel de traitement des échantillons. </li><li> Laisser le bouchon de gel de traitement des échantillons se solidifier à la température ambiante, ou solidifier le bouchon pendant 10 min à 4 ° C. </li><li> Placer le gel de traitement des échantillons de tissu incorporé dans des cassettes de tissus histologiques sandwich entre coussins en mousse de biopsie. Incluez dans de la paraffine comme dans les étapes 3.3.2-3.3.2.10. Remarque: Spécimen traitement plongement de gel empêche la perte et permet la conservation des petits échantillons de tissus fragiles. Note: Les tissus conservés par congélation ou de la paraffine plongement conviennent pour la coloration immunohistochimique 14,15. </li></ol></li></ol></li></ol>

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<li>Ng, A., Barker, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ovary+and+fimbrial+stem+cells%3A+biology%2C+niche+and+cancer+origins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Ovary and fimbrial stem cells: biology, niche and cancer origins.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 16, 625-638 (2015).</li>
<li>Visvader, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cells+of+origin+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cells of origin in cancer.</a> Nature. 469, 314-322 (2011).</li>
<li>Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+statistics%2C+2015%5BTitle%5D)+AND+%22CA+Cancer+J+Clin%22%5BJournal%5D)">Cancer statistics, 2015.</a> CA Cancer J Clin. 65, 5-29 (2015).</li>
<li>Williams, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+for+high-resolution+imaging+of+epithelial+ovarian+cancer+by+laparoscopic+nonlinear+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Transl+Oncol%22%5BJournal%5D)">Strategies for high-resolution imaging of epithelial ovarian cancer by laparoscopic nonlinear microscopy.</a> Transl Oncol. 3, 181-194 (2010).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Nous avons établi un essai de transplantation de coussinet adipeux ovarien qui permet la livraison précise et la détection des cellules et des tissus épithéliaux. Le coussinet adipeux procédure test de transplantation ovarienne est techniquement moins difficile que l&#39; injection intrabursale 10-12 et permet une plus uniforme et localisation précise des cellules transplantées par rapport à l&#39; injection intrapéritonéale 9. Il est également bien adapté pour la transplantation à long terme d&#39;un organe entier, tel que le tube de l&#39;utérus. Fait important, le coussinet adipeux de l&#39;ovaire fournit un microenvironnement familier pour les épithéliums du système reproducteur féminin. Il devrait être particulièrement adapté à l&#39;étude des propriétés moléculaires et cellulaires de l&#39;ovaire humain et de souris et de cellules de l&#39;épithélium tubaire pendant la régénération et la transformation maligne. Contrairement à d&#39;autres organes, peu d&#39;études se sont concentrées sur l&#39;identification et la caractérisation de cellules souches dans l&#39;épithélium de la femelle rtractus 18,19 procréation correspondent. De telles études sont d&#39; une importance particulière parce que de nombreux cancers sont censés provenir de cellules souches adultes 20. Origines Pourtant cellulaires de cancers épithéliaux de l&#39; ovaire restent très discutables 18. Cancers de l&#39; ovaire épithéliales représentent la majorité des cancers de l&#39; ovaire et est en 5e place parmi tous les décès liés au cancer des femmes aux États - Unis 21. Ainsi , le développement d&#39;un test orthotopique avec plusieurs avantages par rapport aux techniques de transplantation existantes 9-12 devrait grandement faciliter les études dans ce domaine. Compte tenu de l&#39;emplacement superficiel du coussinet adipeux de l&#39;ovaire, de petits systèmes d&#39;imagerie animale peuvent être utilisés pour le suivi de engraftments marqué avec une forte fluorescent ou reporters bioluminescentes. Il devrait également être possible d&#39;établir à haute résolution en direct des tests d&#39;imagerie minimalement invasives, telles que la microscopie non-linéaire 22. Le coussinet adipeux de l&#39;ovaire peut également être conservé dans des cultures d&#39;organes, permettre ainsition de la culture tridimensionnelle de l&#39;épithélium normal et néoplasique dans des conditions étroitement récapitulant l&#39;organisation des cellules et la matrice extracellulaire. Les études futures devraient répondre à ces possibilités prometteuses. Plusieurs étapes critiques doivent être considérées. Fournir un coussin chauffant et de garder les rongeurs au chaud pendant la chirurgie améliore considérablement le taux de survie. Stérilité des instruments de manipulation du coussinet adipeux assure que les systèmes greffées sont maintenus stériles. Dans notre expérience, les résultats de saignements importants en retard de greffes de croissance. Fait important, la graisse pad incision doit être faite précisément parce que déchirer le coussinet adipeux ou perforer par des causes de saignement. Coagulants doivent être utilisés pour arrêter le saignement si nécessaire. Si engraftments ne se développent pas, une concentration plus élevée de cellules injectées doit être envisagée. Les premières excroissances réussies peuvent être observées dès une semaine après la transplantation et le plus engraftments devrait être visible unemois après la procédure. Pour la transplantation, les aiguilles de plus grand diamètre (23-25 ​​G) peuvent être utilisés pour empêcher le cisaillement de grandes cellules (plus de 10 m de diamètre). Cependant, de telles aiguilles peuvent être plus traumatisante pour le coussinet adipeux et leur utilisation devrait être testé à l&#39;avance. Pour nos expériences, nous avons utilisé des souris âgées donateurs et bénéficiaires 6 à 8 semaines. Pour les deux fins des souris plus jeunes ou plus âgés peuvent être utilisés. Cependant, le nombre de cellules injectées peut devoir être ajustée. La petite taille des coussinets adipeux de l&#39;ovaire chez les donneurs plus jeunes devront également être pris en considération. Comme avec toutes les méthodes, il y a certaines limites de la souris graisse ovarien test pad de transplantation. Bien que les souris immunocompétentes syngéniques peuvent être utilisés pour murins cellules / tissus primaires, notre technique nécessite GSN ou SCID pour la transplantation de matériel humain. Il est probable possible d&#39;humaniser le coussinet adipeux pour soutenir la croissance des cellules épithéliales humaines. Cependant, nous avons pas encore testé cette approche. L&#39;utilisation de moins de Feles hommes peuvent conduire à des coûts de reproduction inférieurs; Cependant, des souris femelles vierges matures (âgées de 8 à 10 semaines) ont un coussinet adipeux plus grande, ce qui permet la transplantation d&#39;échantillons plus grands. Enfin, le personnel de laboratoire devraient être formés à la chirurgie des animaux pour assurer l&#39;exécution réussie et opportune de la procédure.

essais de transplantation, qui impliquent l&#39;introduction de cellules et de tissus dans des sites spécifiques du corps chez la souris, représentent une approche essentielle pour les études de la régénération des tissus et la carcinogenèse. orthotopiques transplantations de cellules, qui est, leur placement dans un milieu autochtone, sont particulièrement importantes pour la caractérisation des cellules souches adultes. L&#39;existence de cellules souches mammaires premier a été suggéré par la transplantation de fragments des glandes mammaires épithéliales mammaires en coussinets adipeux libre glande-de souris 1. PRISE DE GREFFE essais à la graisse souris humanisée pad 2 ont été utilisés pour récapituler le développement potentiel et normal de régénération des cellules épithéliales mammaires humaines primaires. En outre, les transplantations de dilution en série et la limitation des types de cellules phénotypiquement distinctes dans le coussinet adipeux mammaire dégagé étaient cruciales pour tester la capacité d&#39; auto-renouvellement et la différenciation multilignée des cellules souches mammaires 3-5. essais de transplantation dans combination avec lignée génétique traçage a fourni des preuves de la cellule d&#39;origine dans la carcinogenèse mammaire 5. Les transplantations rénales de capsule sont couramment utilisés pour tester les propriétés de cellules souches de la prostate 6 putatif. Transplantation orthotopique de souris normales et néoplasiques et organites pancréatiques humaines a révélé gènes et les voies modifiées dans la progression du cancer 7. L&#39;importance de l&#39;environnement natif a également été soutenu par la démonstration de la régénération après diverse engraftments des glandes sudoripares dans des endroits différents, tels que des tampons mammaires de graisse, épaulettes de graisse et la peau arrière 8. La cavité péritonéale et la bourse ovarienne sont généralement utilisés comme lieux de transplantation orthotopique de cellules épithéliales du tractus génital féminin 9-12. Ces deux méthodes ont un certain nombre de limitations. L&#39;injection intrapéritonéale de cellules conduit à leurs implantations dans différents domaines de la cavité péritonéale, ce qui complicating surveillance de la croissance cellulaire. En outre, les variations dans le micro-environnement, tels que l&#39;étendue de la vascularisation, l&#39;innervation et la représentation des cellules immunitaires, peuvent être très importantes dans les différentes zones de la cavité péritonéale. La bourse séreuse ovarienne a un volume très limité, ce qui permet l&#39;injection d&#39;au plus 10 pi de liquide. Cela limite considérablement la quantité de cellules qui peuvent être administrées. De plus, les injections dans la bourse ovarienne peut être assez difficile techniquement et la procédure nécessite une quantité importante de temps. Pour répondre à ces limitations, nous avons tiré profit des propriétés de coussinet adipeux de l&#39;ovaire. L&#39;ovaire coussinet adipeux de la souris a une grande taille, est adjacente à l&#39;ovaire et de la trompe utérine, et est facilement accessible par la chirurgie. Il a été rapporté que trophoblaste équine peut être transplanté dans le tapis de souris de graisse 13 de l&#39; ovaire. Cependant, les détails de cette méthode ne sont pas décrits. Il a également été rapporté pas si cela methode peut être appliqué à des cellules et des tissus adultes. Ici, nous décrivons une méthode fiable pour la transplantation de souris et des cellules humaines du tractus génital féminin et montrent que cette méthode est également applicable à une transplantation d&#39;organe à long terme.

<table><tbody><tr><td>Aiguille de calibre 25</td><td>BD Becton Dickinson</td><td>305122</td><td></td></tr><tr><td>aiguille de calibre 28 (seringue hypodermique avec aiguille attachée)</td><td>Kendall</td><td>30339</td><td>Numéro de pièce : 8881500014</td></tr><tr><td>facteur de croissance des fibroblastes de base-2</td> Matrice de membrane basale <td>Sigma-Aldrich</td><td>F9786</td><td></td></tr><tr><td>(Geltrex)</td><td>Invitrogen</td><td>A1413202</td><td></td></tr><tr><td>&beta ;-actin-DsSouris</td> rouges<td>Le laboratoire Jackson</td><td>6051</td><td>B6. souris Cg-Tg(CAG-DsRed*MST)1Nagy/J</td></tr><tr><td>&beta ;-actin-EGFP</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>3291</td><td>C57BL/6-Tg(CAG-eGFP)1Osb/J</td></tr><tr><td>&beta ;-mercaptoéthanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7522</td><td></td></tr><tr><td>albumine bovine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3311</td><td></td></tr><tr><td>chloroforme</td><td>VWR</td><td>EM-CX1058-1</td><td></td></tr><tr><td>collagénase/hyaluronidase</td><td>Cellule souche Technologies</td><td>7912</td><td></td></tr><tr><td>flacons cryogéniques</td><td>Thermo Scientific Nunc</td><td>377267</td><td></td></tr><tr><td>dispase II</td><td>Worthington</td><td>NPRO2</td><td></td></tr><tr><td>DMEM F12 (HAM’s)</td><td>Corning</td><td>10-092-CV</td><td></td></tr><tr><td>DNaseI (Deoxyribonuclease I)</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>7900</td><td></td></tr><tr><td>milieu d’enrobage pour échantillons de tissus congelés (O. C. T.)</td><td>Sakura Finetek&nbsp ;</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>facteur de croissance épidermique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4127</td><td></td></tr><tr><td>éthanol 200 proof</td><td>Koptec</td><td>V1001</td><td>pour préparer 70 %&nbsp ;</td></tr><tr><td>sérum fœtal bovin</td><td>Sigma</td><td>F4135</td><td></td></tr><tr><td>pointe filtrante 0.1-10/20 &micro ; l XL&nbsp ;</td><td>USA Scientific</td><td>1120-3810</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps FOXJ1</td><td>eBioscience</td><td>E10109-1632</td><td>utilisé à une concentration de 1:1 000 (sans démasquage)</td></tr><tr><td>hydrocortisone</td><td>Sigma</td><td>H0135</td><td></td></tr><tr><td>Ketoprofen</td><td>Zoetis</td><td>4396H</td><td></td></tr><tr><td>film de laboratoire (Parafilm M)</td><td>American National Can</td><td>PM-999</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Corning</td><td>25-005-Cl</td><td></td></tr><tr><td>insuline-transferine-sélénite sodique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I884</td><td></td></tr><tr><td>isoflurane, 250 ml</td><td>Santa Cruz Santé animale</td><td>sc-363629Rx</td><td></td></tr><tr><td>plaque d’attache basse 24-puits</td><td>Costar</td><td>3473</td><td></td></tr><tr><td>MEM acides aminés non essentiels</td><td>Corning</td><td>25-025-Cl</td><td></td></tr><tr><td>moules d’histologie des métaux</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>Microscope 62527-22</td><td></td></tr><tr><td>, microscope inversé</td><td>Nikon</td><td>Eclipse TS 100</td><td></td></tr><tr><td>, souris stéréo</td><td>Nikon</td><td>SMZ800</td><td></td></tr><tr><td>Nod/SCID/gamma (NSG)</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>05557</td><td>NOD. Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ</td></tr><tr><td>solution de paraformaldéhyde à 16 %</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>paraffine (Paraplast, X-TRA)</td><td>Fisher Thermo Scientific</td><td>23-021-401</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps PAX8</td><td>Proteintech</td><td>10336-1-AP</td><td>utilisé à une concentration de 1:1 000 (sans démasquage)</td></tr><tr><td>PBS (solution saline tamponnée au phosphate)</td><td>Corning</td><td>&nbsp ; 21-030-CV</td><td></td></tr><tr><td>pénicilline streptomycine</td><td>Corning</td><td>30-002-Cl</td><td></td></tr><tr><td>immunodéficience combinée sévère (SCID/NCr) souris, contexte BALB/C)</td><td>NCI-Frederick Animal Production Program</td><td>01S11</td><td></td></tr><tr><td>pyruvate de sodium</td><td>Corning</td><td>25-000-Cl</td><td></td></tr><tr><td>gel de traitement d’échantillons (HISTOGEL)</td><td>Richard-Allan Scientific</td><td>HG-4000-012</td><td></td></tr><tr><td>saccharose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA, 25 %</td><td>Corning</td><td>25-053-Cl</td><td></td></tr></tbody></table>

transplantation dans le tapis de souris ovarien fat

Transplantation Into the Mouse Ovarian Fat Pad

Les tests de transplantation orthotopique chez la souris sont inestimables pour les études de régénération cellulaire et de transformation néoplasique. Les approches courantes pour la transplantation orthotopique de la surface ovarienne et de l’épithélium tubaire comprennent l’administration intrapéritonéale et intrabursive de cellules. Les limites respectives de ces méthodes comprennent l’emplacement mal défini des cellules injectées et le volume d’espace limité. De plus, ils sont mal adaptés à la préservation structurelle à long terme des organes transplantés. Pour relever ces défis, nous avons développé une approche alternative, basée sur l’introduction de cellules et de fragments de tissu dans le coussinet adipeux de la souris. Le coussinet adipeux ovarien de souris est situé à proximité immédiate de l’ovaire et de la trompe utérine (alias oviducte, trompe de Fallope) et fournit un microenvironnement familier pour les cellules et les tissus de ces organes. Dans notre approche, des cellules de souris et humaines marquées par fluorescence et des fragments du tube utérin sont greffés en utilisant une chirurgie d’incision dorsale peu traumatique. Les cellules transplantées et leurs excroissances sont facilement localisées dans le coussinet adipeux ovarien pendant plus de 40 jours. La transplantation à long terme de l’ensemble de la trompe utérine permet de préserver correctement tous les principaux composants tissulaires et n’entraîne pas d’effets secondaires indésirables, tels que la fibrose et l’inflammation. Notre approche devrait être particulièrement applicable pour répondre à d’importantes questions biologiques telles que la différenciation, le potentiel régénératif et néoplasique de populations cellulaires spécifiques. De plus, il devrait convenir à l’étude des facteurs microenvironnementaux dans le développement normal et le cancer.

Les cellules et les tissus expérimentaux peuvent être transplantés avec précision dans le coussinet adipeux de l&#39; ovaire sous un microscope de dissection (figure 1). Les exemples comprennent les souris primaires des cellules de l&#39; épithélium des trompes dérivées de souris exprimant de façon ubiquitaire EGFP (figure 2A) ou DsRed (figure 2B) et les cellules humaines immortalisées de la surface de l&#39; ovaire de l&#39; épithélium HIO118 16,17 cellules marquées par mCherry et EGFP lentivirus (figure 2C - F). Cette approche est également applicable pour la transplantation à long terme des organes, tels que le tube de l&#39; utérus de la souris (figure 3). Selon la coloration immunohistochimique, tant ciliées (FOXJ1 positif 14) et sécrétoires (PAX8 positif 15) , les cellules sont conservées dans l&#39;épithélium tubaire des tissus transplantés (Figure 3D et E). <imgalt = &quot;Figure 1&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 54444 / 54444fig1.jpg&quot; /&gt; Figure 1: ovarien Pad Fat Transplantation (A) Surface exposée de la transplantation (flèche).. (B) Une incision est faite par une aiguille 28 G (flèche). (C) UT / sous - sol de la matrice de membrane mélange greffe par pointe de la pipette (flèche). (D) UT entée (flèche, rouge vif, UT de souris-DsRed β-actine). FP, coussinet adipeux; Ov, de l&#39;ovaire; UT, trompe utérine. Barre d&#39; échelle = 2 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54444/54444fig1large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/54444/54444fig2.jpg" /> Figure 2:. Détection de transplanté souris primaires cellules Tubal épithélium et humaines immortalisées surface ovarien cellules épithéliales (A, B) Out<html> croissances de souris primaire des cellules de l&#39; épithélium des trompes (flèches) de souris β-actine-EGFP (A, vert) et la ß-actine DsRed (B, rouge) 8 jours après la transplantation dans une souris syngénique. (C, D) Engraftments de cellules mixtes HIO118 (flèches) marquées avec soit Lenti-EGFP (vert) ou Lenti-mCherry (rouge) 10 jours après la transplantation chez des souris NSG. (D) de la zone élargie de (C, flèche). (E, F) développée Graft 43 jours après la transplantation des mêmes cellules que dans C, D à la souris SCID (flèches). AD, F, fluorescence; E, champ lumineux, FP, coussinet adipeux; Ov, de l&#39;ovaire; UT, trompe utérine. (A, B, DF) Barre d&#39;échelle = 500 pm; (C) Barre d&#39; échelle = 1.600 um. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54444/54444fig2large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> ad / 54444 / 54444fig3.jpg &quot;/&gt; Figure 3: Caractérisation de l&#39; utérus Tube Transplant. (A) trompe utérine complète (flèche) de la β-actine-DsRed souris 6 jours après la transplantation dans le coussinet adipeux de l&#39; ovaire (flèche, rouge vif). (B) extemporané fluorescente du coussinet adipeux avec la greffe montré dans (A). Rouge, DsRed; Bleu, 4 &#39;, 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI), contre-coloration nucléaire. (C) greffé tube utérins (flèche) 40 jours après la transplantation dans la souris receveuse GSN (flèche). section Paraffine. Noter la bonne conservation de tous les composants principaux du tube de l&#39;utérus, et l&#39;absence de fibrose et de l&#39;inflammation associée à une transplantation. Hématoxyline et éosine. (D, E) Détection des marqueurs de l&#39; épithélium tubaire-box Couplé gène 8 (PAX8) et Forkhead boîte J1 (FOXJ1; couleur nucléaire brun, pointes de flèches) dans les cellules du greffon (flèches) figurant dans ( <strong&gt; C). système immunoperoxydase. Effectuer une contre avec le vert de méthyle. FP, coussinet adipeux; Ov, de l&#39;ovaire; UT, trompe utérine. (A) Barre d&#39;échelle = 1000 pm; (B) Barre d&#39;échelle = 200 um; (CE) Barre d&#39; échelle = 100 um. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54444/54444fig3large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> Composant </td><td> 1x DMEM F12 (Ham) </td></tr><tr><td> L-Glutamine </td><td> 2 mM </td></tr><tr><td> pruvate de sodium </td><td> 1 mM </td></tr><tr><td> le facteur de croissance épidermique </td><td> 10 ng ml - 1 </td></tr><tr><td> Base de facteur 2 de croissance des fibroblastes </td><td> 10 ng ml - 1 </td></tr><tr><td> hydrocortisone </td><td> 500 ng ml - 1 </td></tr><tr><td> Insuline </td><td> 5 pg ml - 1 </td></tr><tr><td> Transferrin </td><td> 5 pg ml - 1 </td></tr><tr><td> Le sélénite de sodium </td><td> 5 ng ml - 1 </td></tr><tr><td> albumine bovine </td><td> 0,10% </td></tr><tr><td> Pénicilline / Streptomycine </td><td> 100 unités ml -1/100 ug ml - 1 </td></tr><tr><td> Milieu de Eagle (MEM) acides aminés non essentiels minimales essentielles </td><td> 0,1 mM </td></tr><tr><td> Le bêta-mercaptoéthanol </td><td> 10 -4 M </td></tr></tbody></table> Tableau 1:. Souris Tubal Epithelim croissance moyenne (M-TE-GM) Composants répertoriés dans la colonne de gauche sont dissous dans 1x DMEM F12 de moyenne (Ham) aux concentrations indiquées, la colonne de droite. La composition du milieu final est exempt de sérum.

Nous décrivons un essai de transplantation de pad à la mode ovarienne appropriée pour les études de épithéliums normales et transformées de l&#39;appareil reproducteur féminin. Le coussinet adipeux de la souris permet la transplantation de grands fragments de tissus, est facilement accessible pour la chirurgie et l&#39;imagerie, et fournit l&#39;environnement natif le plus favorable pour les tissus d&#39;origine Müllerian.

Transplantation Dans le tapis de souris ovarien Fat

Orthotopic transplantation assays in mice are invaluable for studies of cell regeneration and neoplastic transformation. Common approaches for orthotopic ...

L'objectif général de cet essai de transplantation de la couche graisseuse ovarienne est de faciliter l'étude de l'épithélium normal et transformé du tractus reproducteur féminin dans l'environnement natif le plus favorable. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine, telles que le potentiel de différenciation, régénératif et néoplasique de populations cellulaires spécifiques du tractus reproducteur féminin. Le principal avantage de cette technique réside dans le fait que la couche graisseuse ovarienne de la souris permet la transplantation de cellules et de fragments tissulaires de grande taille.Il est facilement accessible pour la chirurgie et l'imagerie. La cavité péritonéale et la bourse ovarienne sont fréquemment utilisées comme sites de transplantation orthotopique de cellules épithéliales du tractus reproducteur féminin. Ces méthodes présentent plusieurs limitations.Après avoir euthanasié des souris bêta-actine EGFP ou bêta-actine DS rouge conformément au protocole décrit dans le texte, placer une souris individuelle sur un champ absorbant, le côté ventral vers le haut. Ouvrir la peau en pratiquant une incision médiane latérale, puis, à l’aide des doigts, tirer la peau située au-dessus et au-dessous de l’incision vers la tête et la queue de la souris. À l’aide de pinces contondantes, maintenir le péritoine et utiliser des ciseaux fins pour ouvrir la cavité abdominale.Ensuite, repoussez délicatement l'enroulement de l'intestin et localisez les organes reproducteurs. À l’aide de pinces fines, saisissez une corne utérine et coupez à 0,5 centimètre au-dessus du point de bifurcation des cornes utérines. Puis, tout en maintenant la corne utérine, disséquez les tissus conjonctifs attachés à la corne utérine, à la trompe utérine, à l’ovaire et au bourrelet graisseux ovarien.Placer le tractus reproducteur disséqué dans une boîte contenant six millilitres de PBS stérile et procéder au second tractus reproducteur avant la culture de cellules primaires d'épithélium tubaire, ou TE, selon le protocole décrit dans le texte. Après avoir disséqué des trompes utérines individuelles à partir des cornes utérines de souris beta-actin DS rouge vierges âgées de six à huit semaines dans du PBS selon le protocole décrit dans le texte, sous un microscope stéréoscopique, transférer chaque trompe utérine individuelle dans une goutte de 200 microlitres de PBS. À l’aide de pinces et d’aiguilles de calibre 28, dérouler délicatement les trompes utérines en retirant le mésosalpinge, une partie du ligament large qui soutient les segments de la trompe utérine.Placer des trompes utérines individuelles, partiellement déroulées, dans une goutte de 200 microlitres de PBS glacé jusqu'à ce que le bourrelet adipeux ovarien du receveur soit exposé et prêt à recevoir la greffe. Déplacer l'animal dans une hotte de sécurité biologique pour effectuer la transplantation du bourrelet adipeux. Après avoir anesthésié une souris syngénique selon le protocole décrit dans le texte, utiliser des ciseaux n°40 pour raser une zone deux fois plus grande que la zone chirurgicale.Utilisez la povidone-iodée, suivie d'éthanol à 70 %, pour effectuer trois frictions chirurgicales. Ensuite, placez l'animal sous un microscope stéréoscopique. Puis, à l'aide d'un scalpel, faites une incision en position dorsomédiale directement au-dessus du bourrelet graisseux ovarien et exposez le tractus reproducteur.Ensuite, recouvrez la zone avec un champ stérile. Puis, à l’aide de pinces fines non coupantes, tirez délicatement le bourrelet graisseux ovarien à travers l’incision vers la ligne médiane, en minimisant les lésions des nerfs et des vaisseaux sanguins importants. Pour éviter un ralentissement de la croissance des greffons, l’incision du bourrelet graisseux doit être réalisée avec la plus grande précision possible, car un déchirement ou une perforation complète du bourrelet entraîne un saignement.Des agents coagulants doivent être utilisés pour arrêter les saignements si nécessaire. Utilisez une aiguille biseautée de 28 g pour pratiquer une incision de 2 à 4 millimètres de profondeur dans la couche graisseuse ovarienne, à 3 à 4 millimètres au-dessus de l'ovaire, en veillant à ce que l'aiguille pénètre d'environ la moitié de l'épaisseur de la couche graisseuse. Pour les transplantations cellulaires, remplissez une seringue munie d'une aiguille de 30 g avec 10 à 20 microlitres du mélange de matrice membranaire basale contenant les cellules, puis injectez-le dans l'incision de la couche graisseuse.Pour la transplantation de la trompe utérine, utilisez une pince fine pour saisir la trompe utérine et placez-la dans 10 à 20 microlitres de matrice de membrane basale maintenue sur glace. Ensuite, à l’aide d’une pipette graduée munie d’une pointe filtrante de 0,1 à 10 à 20 microlitres XL, prélevez la suspension de tissu et de matrice de membrane basale et déposez-la dans l’incision du bourrelet adipeux. Attendez cinq minutes pour que la matrice de membrane basale durcisse, puis replacez l’appareil reproducteur dans le péritoine.Avec deux points de suture chirurgicale, fermer les muscles et utiliser de petits agrafes cutanées ou des sutures chirurgicales pour fermer la peau. Après la greffe, laisser l'animal se remettre selon le protocole décrit dans le texte. Pour collecter et conserver les greffons, préparer une solution de paraformaldéhyde à 4 %, ou PFA, en mélangeant 26 millilitres d'eau doublement distillée avec quatre millilitres de solution PBS 10X et 10 millilitres de solution de PFA à 16 %.Après avoir disséqué en un seul bloc le bourrelet graisseux ovarien greffé, l'ovaire, la trompe utérine et l'utérus, placer immédiatement le tissu dans deux millilitres de PFA à 4 % et fixer à température ambiante pendant deux heures. Chez le même animal, fixer et traiter de la même manière le greffon témoin du bourrelet graisseux ovarien controlatéral non greffé. Après la fixation, laver les tissus trois fois avec du PBS pendant cinq minutes chacun et incuber dans du PBS à quatre degrés Celsius toute la nuit.Réalisez l'imagerie en montage complet et l'histologie conformément au protocole décrit. Dans cette expérience, une trompe utérine provenant d'une souris bêta-actine DS rouge a été transplantée et greffée dans le bourrelet graisseux ovarien, comme visible sur cette image de fluorescence. On observe ici des proliférations de cellules épithéliales tubaires primaires de souris bêta-actine EGFP et de souris bêta-actine DS rouge, huit jours après transplantation chez une souris syngénique.Cette image montre des greffes de cellules HI0118 mixtes marquées soit avec Lenti-eGFP soit avec Lenti-mCherry, 10 jours après transplantation chez une souris NSG. Sur ces clichés, les flèches indiquent une greffe âgée de 43 jours, issue de la transplantation de cellules HI0118 mixtes chez une souris SCID. Sur cette image fluorescente, un tube utérin complet provenant d'une souris bêta-actine DS rouge est visible six jours après transplantation dans la couche graisseuse ovarienne.Une coupe congelée du bourrelet adipeux fluorescent est contre-colorée avec le DAPI dans ce panneau. Cette greffe de trompe utérine, 40 jours après transplantation chez une souris receveuse NSG, présente une préservation complète des composants de la trompe utérine ainsi qu'une absence de fibrose et d'inflammation. Enfin, les coupes ont été marquées pour les marqueurs épithéliaux tubaires Pax8 et FOXJ1 et contre-colorées au vert de méthyle afin de démontrer respectivement la préservation des cellules ciliées et des cellules sécrétoires.Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en 20 à 30 minutes si elle est effectuée correctement. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de préparer à l'avance les plaques chirurgicales, les réactifs et les instruments. Après cette procédure, d'autres méthodes, telles que l'imagerie intravitale et les injections de médicaments anticancéreux, peuvent aider à répondre à des questions supplémentaires, comme la formation du cancer et les effets des traitements anticancéreux.Cette technique ouvre la voie aux chercheurs dans les domaines de la biologie de la reproduction et du cancer de l'ovaire pour explorer les fonctions normales des cellules souches et le développement du cancer dans les tissus du tractus reproducteur féminin. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'isoler des cellules et du tissu de la trompe utérine, puis de les transplanter dans la couche graisseuse. N'oubliez pas que le travail avec des animaux en conditions stériles pendant une chirurgie vitale est extrêmement important pour un résultat réussi.Fournir une plaque chauffante pour maintenir les rongeurs au chaud améliore considérablement le taux de survie.

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