Name: La Synthèse des RGD-fonctionnalisé hydrogels comme un outil pour les applications thérapeutiques (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: Découvrez la synthèse d'hydrogels fonctionnalisés RGD par cycloaddition CuAAC et polycondensation assistée par micro-ondes. Cette méthode améliore la viabilité cellulaire pour l'ingénierie tissulaire et la médecine régénérative.

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Les auteurs tiennent à remercier le professeur Maurizio Masi à une discussion fructueuse et Miss Chiara Allegretti pour l&#39;édition de langue. La recherche des auteurs est soutenu par Bando Giovani Ricercatori 2010 (Ministero della Salute GR-2010- 2312573).

Remarque: Les produits chimiques sont utilisés tels que reçus. RGD linéaire est acheté, mais il peut être préparé par synthèse peptidique en phase solide Fmoc - type 16,19. Les solvants sont de qualité analytique. La dialyse nécessite l&#39;utilisation d&#39; une membrane avec une Mp de coupure égal à 3500 Da. Les composés synthétisés sont caractérisés par les spectres 1 H - RMN enregistré sur un spectromètre à 400 MHz en utilisant du chloroforme (CDCl 3) ou d&#39; oxyde de deutérium (D 2 O) en tant que solvants, et les déplacements chimiques sont rapportés en valeurs S en parties par million. En outre, les hydrogels sont soumis à une analyse FT-IR en utilisant une technique KBr de granulés et de leur caractérisation physique implique des études de gélification évalués en utilisant le tube à essai inversé à 37 ° C. 1. Synthèse du chlorure de 4-1 Azidobutanoyl <ol><li> Dissoudre 500 mg d&#39;acide 4-azidobutanoic (3,90 mmol) dans 10 ml de dichlorométhane et 0,5 ml de diméthylformamide. </li><li> On refroidit la solution à 0 ° C,, En utilisant un bain de glace. </li><li> Ajouter 505 pl de chlorure d&#39;oxalyle (5,85 mmol) dans 5 ml de dichlorométhane et on ajoute lentement goutte à goutte au système réactionnel, tout en agitant. </li><li> Au bout de 1 h à 0 ° C en utilisant un bain de glace, le retour à la température ambiante. </li><li> On élimine le solvant sous pression réduite en utilisant un évaporateur rotatif. </li><li> Caractériser le produit obtenu par spectroscopie 1 H-RMN, la dissolution de l&#39;échantillon dans CDCl 3 16. </li></ol> 2. Synthèse de RGD-azoture Derivative 2 <ol><li> Dissoudre 50 mg de RGD (0,145 mmol) dans 1 ml de 1 M de NaOH. </li><li> Dissoudre 24 mg de 1 (0,16 mmol) dans 2 ml de tétrahydrofuranne. </li><li> Ajouter toute la solution RGD à la solution 1 , goutte à goutte , à 0 ° C en utilisant un bain de glace. </li><li> Retour à la température ambiante et agitation pendant une nuit. </li><li> Ajouter 1 ml de 1 M HCl. </li><li> On élimine le solvant sous pression réduite en utilisant un évaporateur rotatif. </li><li> Caractériser l&#39;obtained produit par spectroscopie 1 H-RMN, la dissolution de l&#39;échantillon dans D 2 O 16. </li></ol> 3. PAA Acétylène Modification 3 <ol><li> Dissoudre 200 mg de 35% p / p de la solution de PAA (2,8 mmol) dans 15 ml d&#39;eau distillée. </li><li> Ajouter 15,4 mg de chlorhydrate de propargylamine (0,20 mmol). </li><li> Dissoudre 42,8 mg d&#39;hydrate de 1-hydroxybenzotriazole (HOBt, 0,28 mmol) dans 14 ml d&#39;un mélange 1: 1 v / v d&#39;acétonitrile: solution d&#39;eau distillée en chauffant à 50 ° C. </li><li> Ajouter la totalité de la solution de HOBt à la solution de PAA à la température ambiante. </li><li> Ajouter 53,6 mg de ethyldimethylaminopropylcarbodiimide (EDC, 0,28 mmol) au mélange réactionnel. </li><li> En utilisant du HCl 1 M pour ajuster le pH à 5,5 et on agite le système réactionnel pendant une nuit à température ambiante. </li><li> Dialyser la solution. Dissoudre 11,2 g de chlorure de sodium dans 2 litres d&#39;eau distillée, puis ajouter 0,2 ml de 37% p / p de HCl. Dialyser la solution en utilisant une membrane avec un M w coupure de 3,5 kDa. </li><li> Perform dialyse pendant trois jours. Changer la solution de dialyse par jour avec 2 litres d&#39;eau distillée fraîchement préparée contenant 0,2 ml de 37% p / p de HCl. </li><li> Conserver la solution finale à -80 ° C. Lyophiliser dans un lyophilisateur selon les protocoles du fabricant. </li><li> Caractériser le polymère fonctionnalisé par spectroscopie 1 H-RMN, la dissolution de l&#39;échantillon dans D 2 O 16. </li></ol> 4. Synthèse du PAA-RGD Polymer 4 <ol><li> Dissoudre 78 mg de PAA modifié alcyne 3 (1,083 mmol) dans 10 ml d&#39;eau distillée. </li><li> Dissoudre 25 mg du dérivé azoture 2 RGD (0,0722 mmol) dans 5 ml de tétrahydrofuranne. </li><li> Ajouter toute la solution RGD à la solution polymère. </li><li> Ajouter 2,2 mg d&#39;iodure de cuivre (0,0116 mmol) et 2,2 mg d&#39;ascorbate de sodium (0,0111 mmol). </li><li> Reflux le mélange résultant pendant une nuit à 60 ° C, sous agitation. </li><li> On refroidit le mélange à 25 ° C. </li><li> Dialyze la solution. Dissoudre 11,2 g de chlorure de sodium dans 2 litres d&#39;eau distillée, puis ajouter 0,2 ml de 37% p / p de HCl. Dialyser la solution en utilisant une membrane avec un M w coupure de 3,5 kDa. </li><li> Effectuer une dialyse pendant trois jours. Changer la solution de dialyse par jour avec 2 litres d&#39;eau distillée fraîchement préparée contenant 0,2 ml de 37% p / p de HCl. </li><li> Conserver la solution finale à -80 ° C. Lyophiliser dans un lyophilisateur selon les protocoles du fabricant. </li><li> Caractériser le produit obtenu par spectroscopie 1 H-RMN, la dissolution de l&#39;échantillon dans D 2 O 16. </li></ol> 5. RGD fonctionnalisés Hydrogel Synthèse <ol><li> Préparer le PBS. Dissoudre 645 mg de sel de PBS dans 50 ml d&#39;eau distillée. </li><li> Mélanger 40 mg de carbomère et de 10 mg de PAA fonctionnalisés 4 dans 9 ml de PBS (étape 5.1), à la température ambiante, jusqu&#39;à dissolution complète (30 minutes). </li><li> Ajouter 400 mg de PEG à la solution et maintenir l&#39;agitation pendant 45 min. </li><li> Arrêtez l&#39;agitation et permettre au système de se contenter de 30 min. </li><li> Utiliser NaOH 1 N pour ajuster le pH à 7,4. </li><li> 5 ml du mélange obtenu, on ajoute 25 mg de poudre d&#39;agarose. </li><li> Irradier le système avec un rayonnement micro-onde à 500 W jusqu&#39;à ce que l&#39;ébullition, pendant une durée généralement comprise entre 30 s et 1 min, et chauffer électromagnétiquement jusqu&#39;à 80 ° C. </li><li> Laisser le mélange est exposé à la température ambiante jusqu&#39;à ce que sa température tombe à 50 ° C et on ajoute 5 ml de PBS (étape 5.1), afin d&#39;obtenir une solution à un rapport 1: 1 volumétrique. </li><li> Préparer multipuits 12 cylindres en acier de la plaque contenant un diamètre de 1,1 cm. </li><li> Prendre des aliquotes de 500 ul de la solution et placez-les dans chacun des cylindres en acier. </li><li> Laisser au repos pendant 45 min jusqu&#39;à ce que la gélification complète du système. </li><li> Retirez les cylindres utilisant une pince en acier inoxydable pour obtenir les hydrogels. </li></ol> 6. Chargement des outils thérapeutiques (médicaments ou cellules) <ol><li> Répétez steps 5.1-5.7. </li><li> Lorsque le mélange (déjà à l&#39;état sol) atteint 37 ° C, ajouter 5 ml de la solution contenant la solution de médicament ou de la culture cellulaire désirée, afin d&#39;obtenir un système final à un rapport 1: 1 volumétrique. </li><li> Répétez les étapes 05.09 à 05.12 pour obtenir des réseaux polymères avec biocomposés physiquement piégées dans le gel. </li></ol> 7. Hydrogel Caractérisation <ol><li> Analyse FT-IR <ol><li> Après la formation de gel, faire tremper un des hydrogels synthétisées dans 2,5 ml d&#39;eau distillée pendant 24 heures. </li><li> Retirez les milieux aqueux où hydrogel est immergée et congelez-sec avec N2 liquide. </li><li> Laminé l&#39;échantillon d&#39;hydrogel selon la technique de pastille de KBr. <ol><li> Ajouter une spatule pleine de KBr dans un mortier en agate. Prenez une petite quantité d&#39;échantillon d&#39;hydrogel (environ 0,1-2% du montant KBr, ou juste assez pour couvrir la pointe de la spatule) et mélanger avec la poudre KBr. </li><li> Broyer le mélange jusqu&#39;à ce que la poudre est fine et homogène. &lt;/ Li&gt; <li> Utilisez le kit de pastille de KBr pour former le culot IR. Appuyez sur la poudre à l&#39;aide d&#39;une presse manuelle de laboratoire: pendant 3 min à la capacité de pression égale à 5 tonnes, puis pendant 3 min à la capacité de pression de 10 tonnes. </li><li> Relâchez la pression pour obtenir le culot final comme homogène et transparente en apparence. Insérez la pastille dans le porte-échantillon d&#39;IR et d&#39; exécuter le spectre 16. </li></ol></li></ol></li><li> Des études de gélification <ol><li> Remplir 2 ml microtube avec 900 pi de PBS et équilibrer à 37 ° C. </li><li> Ajouter 100 ul de la solution de polymère préparée pour former l&#39;hydrogel et incuber à 37 ° C. </li><li> Inversez le tube et observer si le gel coule à 1, 2, 5, 10 et 20 min. Enregistrer l&#39;heure à laquelle le gel ne coule pas comme le temps de gélification. </li></ol></li></ol>

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Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts et n’ont reçu aucun paiement pour la préparation de ce manuscrit.

La modification post-polymérisation du PAA avec des fractions alcynes et la fonctionnalisation du RGD avec le groupe azide garantissent la formation d’une liaison stable entre le polymère et le peptide. En effet, le triazole sert d’unité de liaison rigide entre les atomes de carbone, attachée aux positions 1,4 du cycle 1,2,3-triazole et il ne peut pas être clivé hydrolytiquement ou autrement. De plus, le triazole est extrêmement difficile à oxyder et à réduire, contrairement à d’autres structures cycliques telles que les...

Les hydrogels sont des réseaux tridimensionnels formés par des polymères réticulés hydrophiles, qui sont naturelles ou synthétiques, et caractérisé par une structure tridimensionnelle particulière. Ces dispositifs sont de plus en plus attrayante dans les domaines biomédical de délivrance de médicaments, l&#39; ingénierie tissulaire, les porteurs du gène et des capteurs intelligents 1,2. En effet, leur teneur élevée en eau, ainsi que leurs propriétés rhéologiques et mécaniques rendent les candidats aptes à imiter microenvironnement des tissus mous et les rendre des outils efficaces pour la cytokine soluble dans l&#39;eau ou la livraison de facteur de croissance. Un de l&#39;utilisation la plus prometteuse est comme un biomatériau injectable portant des cellules et des composés bioactifs. Les hydrogels peuvent améliorer la survie des cellules et de la tige de commande le destin des cellules en maintenant et délivrer précisément des signaux de régulation de cellules souches d&#39;une manière pertinente physiologique, comme observé in vitro et dans des expériences in vivo 3,4. Le principal avantage est la possibilitéà maintenir les cellules injectées dans la zone d&#39;inoculation (in situ), ce qui réduit la quantité de cellules qui quitte la zone extravasates et dans le torrent circulatoire, la migration de tout le corps et la perte de l&#39;objectif visé 5. La stabilité des réseaux tridimensionnels d&#39; hydrogel est due à ses sites de reticulation, formées par des liaisons covalentes ou des forces de cohésion entre les chaînes de polymère 6. Dans ce cadre, la chimie sélective orthogonale appliquée aux chaînes de polymère est un outil polyvalent capable d&#39;améliorer les performances d&#39; hydrogel 7. En effet, la modification de polymères avec des groupes chimiques appropriés peut aider à fournir des propriétés mécaniques et chimiques appropriées, physiques et d&#39;améliorer la viabilité des cellules et leur utilisation dans la formation des tissus. De la même façon, parmi les techniques de charger des cellules ou des facteurs de croissance dans la matrice de gel, l&#39;utilisation du peptide RGD permet l&#39;amélioration de l&#39;adhérence cellulaire et la survie. RGD est un tripeptide composéde l&#39; arginine, la glycine et l&#39; acide aspartique, qui est de loin le plus efficace et souvent employé tripeptide en raison de sa capacité à traiter plus d&#39;un récepteur d&#39;adhésion cellulaire et son effet biologique sur l&#39; ancrage des cellules, le comportement et la survie de 8,9. Dans ce travail, la synthèse des hydrogels RGD-fonctionnalisé est étudiée dans le but de concevoir des réseaux caractérisés par des propriétés biochimiques suffisantes pour un microenvironnement cellulaire hospitalier. L&#39;utilisation d&#39; un rayonnement micro - ondes dans la synthèse de l&#39; hydrogel propose une procédure simple pour minimiser les réactions secondaires et d&#39; obtenir des taux et des rendements de réaction plus élevés dans une période de temps plus courte par rapport aux procédés thermiques classiques 10. Cette méthode ne nécessite pas d&#39; étapes de purification et des rendements des hydrogels stériles en raison des interactions entre les polymères et l&#39;absence de solvant organique dans le système réactionnel 11. Par conséquent, il garantit un pourcentage élevé de RGD liés au réseau polymère, car aucun modificateurfications sont nécessaires pour les groupes chimiques de polymères impliqués dans la formation de gel. Les groupes carboxyles, de l&#39;AAP et le carbomère, et les groupes hydroxyle, de PEG et d&#39;agarose, donnent lieu à l&#39;hydrogel structure tridimensionnelle par une réaction de polycondensation. Les polymères mentionnés sont utilisés pour la synthèse d&#39;hydrogels dans la moelle lésion de la moelle 12 réparation des traitements. Ces dispositifs, tel que rapporté dans les précédents travaux 13,14, montrent une biocompatibilité élevée ainsi que des propriétés mécaniques et physico - chimiques qui ressemblent à celles de nombreux tissus vivants et dans la nature thixotrope. De plus, ils restent localisés in situ, dans la zone d&#39;injection. Dans ce travail, des groupes carboxyle PAA sont modifiés avec un alcyne (figure 1), et un composé RGD azoture est synthétisé en exploitant la réactivité du groupe terminal tripeptidique -NH 2 avec un composé chimique préparée avec la structure (CH 2) n - N 3 (&lt;strong&gt; Figure 2). Par la suite, l&#39;AAP modifiée réagit avec le dérivé RGD-azoture par CuAAC clic réaction 15-17 (Figure 3). L&#39;utilisation d&#39;un cuivre (I) catalyseur conduit à d&#39;importantes améliorations tant dans la vitesse de réaction et la régiosélectivité. La réaction CuAAC est largement utilisé dans la synthèse organique et en science polymère. Elle combine une efficacité élevée et une grande tolérance aux groupes fonctionnels, et il est affecté par l&#39;utilisation de solvants organiques. Une sélectivité élevée, un temps de réaction rapide et une procédure de purification simple , permettent l&#39;obtention de polymères en étoile, des copolymères séquencés ou des chaînes de greffage des fragments souhaités 18. Cette stratégie de clic permet de modifier des polymères après polymérisation pour personnaliser les propriétés physicochimiques selon l&#39;application biochimique final. Les conditions expérimentales sont facilement reproductibles CuAAC (la réaction est insensible à l&#39;eau, tandis que l&#39;oxydation du cuivre peut se produire très peu), et la nature detriazole formé assure la stabilité du produit. L&#39;utilisation du métal de cuivre peut être considéré comme un point critique en raison de ses effets toxiques potentiels sur les cellules et dans le micro-environnement biologique, mais la dialyse est utilisée comme méthode de purification pour permettre l&#39;élimination complète des résidus catalytiques. Enfin, PAA modifié RGD est utilisé dans la synthèse de l&#39; hydrogel (figure 4) et les propriétés physicochimiques des réseaux résultants sont étudiés, afin de vérifier la fonctionnalité potentielle de ces systèmes comme des cellules ou des médicaments porteurs. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/54445/54445fig1.jpg" /> Figure 1: PAA modifié la synthèse des alcyne Un schéma de PAA fonctionnalisation avec le groupe alcyne;. &quot;n&quot; indique les monomères avec un groupe carboxyle réagissant avec propargylamine. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54445/54445fig1large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir</a>une version plus grande de cette figure. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/54445/54445fig2.jpg" /> Figure 2:.. RGD-azoture synthèse La synthèse du dérivé RGD-azoture <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54445/54445fig2large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/54445/54445fig3.jpg" /> Figure 3: Cliquez sur le schéma de réaction de clic réaction entre un dérivé RGD-azoture et alcyne-PAA.. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54445/54445fig3large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/54445/54445fig4.jpg" /> Figure 4: Hydrogel synthesis. RGD fonctionnalisé procédure de synthèse d&#39;hydrogel. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54445/54445fig4large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>

<table><tbody><tr><td>Solution de poly(acide acrylique) moyenne Mw ~100 000, 35 % en poids dans H2O</td><td>Sigma Aldrich</td><td>523925</td><td>CAS 9003-01-4</td></tr><tr><td>Poly(éthylène glycol) 2 000</td><td>Sigma Aldrich</td><td>84797</td><td>CAS 25322-68-3</td></tr><tr><td>Carbomètre 974P</td><td>Fagron</td><td>1387083</td><td></td></tr><tr><td>Agarose&nbsp ;</td><td>Invitrogen Corp.</td><td>16500-500</td><td>UltraPure Agarose</td></tr><tr><td>RGD peptide</td><td>abcam</td><td>ab142698</td><td></td></tr><tr><td>4-azidobutanoïque</td><td>acide Aurum Pharmatech</td><td>Z-2421</td><td>&nbsp ; CAS 54447-68-6</td></tr><tr><td>Chlorure d’oxalyle</td><td>Sigma Aldrich</td><td>O8801</td><td>CAS 79-37-8</td></tr><tr><td>Chlorhydrate de propargylamine 95 %</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>P50919</td><td>CAS 15430-52-1</td></tr><tr><td>Iodure de cuivre(I)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>3140</td><td>CAS 7681-65-4</td></tr><tr><td>Ascorbate de sodium</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Y0000039</td><td>CAS 134-03-2</td></tr><tr><td>Solution saline tamponnée au phosphate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>Laboratoires de spectre membranaire de dialyse</td><td>, Inc.</td><td>132725</td><td>Spectra/Por 3 Membrane de dialyse&nbsp ; Tube RC standard MWCO : 3,5 kD</td></tr></tbody></table>

la synthèse des rgd-fonctionnalisé hydrogels comme un outil pour les applications thérapeutiques

The Synthesis of RGD-functionalized Hydrogels as a Tool for Therapeutic Applications

L’utilisation de polymères comme biomatériaux a fourni des avantages significatifs dans les applications thérapeutiques. En particulier, la possibilité de modifier et de fonctionnaliser des chaînes de polymères avec des composés capables d’améliorer la biocompatibilité, les propriétés mécaniques ou la viabilité cellulaire permet de concevoir de nouveaux matériaux pour répondre à de nouveaux défis dans le domaine biomédical. Avec les stratégies de fonctionnalisation des polymères, la chimie click est un outil puissant pour améliorer la compatibilité cellulaire et les propriétés d’administration de médicaments des dispositifs polymères. De même, le besoin fondamental de la biomédecine d’utiliser des outils stériles pour éviter d’éventuels effets secondaires indésirables, tels que la toxicité ou la contamination de l’environnement biologique, suscite un intérêt croissant pour la stratégie assistée par micro-ondes.
La combinaison de la chimie clic et de la méthode assistée par micro-ondes est adaptée pour produire des hydrogels biocompatibles avec les fonctionnalités souhaitées et des performances améliorées dans les applications biomédicales. Ce travail vise à synthétiser des hydrogels fonctionnalisés par RGD. Le RGD (acide arginylglycylaspartique) est un tripeptide qui peut imiter les protéines d’adhésion cellulaire et se lier aux récepteurs de surface cellulaire, créant ainsi un microenvironnement hospitalier pour les cellules au sein du réseau polymère 3D des hydrogels. La fonctionnalisation de la RGD se produit par cycloaddition 1,3-dipolaire de Huisgen. Certains groupes carboxyle PAA sont modifiés avec une fraction alcyne, tandis que le RGD est fonctionnalisé avec de l’acide azido en tant que résidu terminal de la séquence peptidique. Enfin, les deux produits sont utilisés dans une réaction de clic catalysée par le cuivre pour lier de manière permanente le peptide au PAA. Ce polymère modifié est utilisé avec du carbomère, de l’agarose et du polyéthylène glycol (PEG) pour synthétiser une matrice d’hydrogel. La structure 3D est formée par une réaction d’estérification impliquant des groupes carboxyle de PAA et des groupes carbomères et hydroxyles d’agarose et de PEG par polycondensation assistée par micro-ondes. L’efficacité du mécanisme de gélification assure un haut degré de fonctionnalisation RGD. De plus, la procédure de chargement de composés thérapeutiques ou d’outils biologiques au sein de ce réseau fonctionnalisé est très simple et reproductible.

Le dérivé PAA alcyne est efficacement synthétisé à partir de l&#39; acide polyacrylique et propargylamine, comme le montre la figure 1 , où n étiquettes les monomères dont les groupes carboxyle réagir avec l&#39;amine. L&#39;identité du produit est confirmée par spectroscopie de 1H-RMN. La figure 5 montre le spectre de 1H-RMN de PAA modifiés par triple liaison. <img alt="Figure 5" src="/files/ftp_upload/54445/54445fig...

Nous présentons un protocole pour la synthèse d’hydrogels fonctionnalisés par RGD en tant que dispositifs pour l’administration de cellules et de médicaments. La procédure implique une cycloaddition d’alcyne-azoture catalysée par le cuivre (CuAAC) entre de l’acide polyacrylique modifié par des alcynes (PAA) et un dérivé de l’azoture de RGD. Les hydrogels sont formés à l’aide de la polycondensation assistée par micro-ondes et leurs propriétés physicochimiques sont étudiées.

La Synthèse des RGD-fonctionnalisé hydrogels comme un outil pour les applications thérapeutiques

The use of polymers as biomaterials has provided significant advantages in therapeutic applications. In particular, the possibility to modify and ...

L'objectif général de cette méthodologie est de synthétiser très facilement des hydrogels destinés à des applications en ingénierie tissulaire. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l'ingénierie tissulaire, telles que la possibilité de maintenir une forte viabilité cellulaire dans des systèmes de culture cellulaire tridimensionnels. Le principal avantage de cette technique réside dans l'utilisation d'une réaction rapide, ce qui permet de modifier aisément les systèmes d'hydrogels afin d'améliorer leur capacité à maintenir les cellules viables.Les implications de cette technique s'étendent vers la thérapie des lésions de la moelle épinière, car les cellules chargées dans l'échafaudage peuvent reconstruire le tissu endommagé. En effet, cette méthode peut fournir des informations importantes sur les thérapies cellulaires en médecine régénérative et leurs implications dans de nombreuses méthodologies. Elle peut également être appliquée à plusieurs autres systèmes, comme l'os, le cœur et le cartilage.Pour synthétiser le dérivé RGD-azoture, dissoudre 50 milligrammes de RGD dans un millilitre d'hydroxyde de sodium un molaire. Ensuite, dissoudre 24 milligrammes de 4-azidobutanoyl chlorure dans deux millilitres de tétrahydrofuranne. Ajouter toute la solution de RGD à la solution de 4-azidobutanoyl chlorure à zéro degré Celsius, goutte à goutte.Revenir à la température ambiante et agiter toute la nuit. Ajouter un millilitre d'acide chlorhydrique un molaire. Éliminer le solvant sous pression réduite à l'aide d'un évaporateur rotatif.Caractériser le produit obtenu par spectroscopie de résonance magnétique nucléaire du proton, en dissolvant l'échantillon dans de l'oxyde de deutérium ou D2O. Pour effectuer la modification alkyne du PAA, dissoudre 200 milligrammes d'une solution de PAA à 35 % en masse dans 15 millilitres d'eau distillée. Ajouter 15,4 milligrammes de chlorhydrate de propargylamine.Ensuite, dissoudre 42,8 milligrammes de HOBt dans 14 millilitres d'une solution d'acétonitrile et d'eau distillée en rapport un pour un en chauffant à 50 degrés Celsius. Ajouter toute la solution de HOBt à la solution de PAA à température ambiante. Puis, ajouter 53,6 milligrammes de EDC une fois le mélange réactionnel atteint. Utilisez de l'HCl à une molarité de 1 M pour ajuster le pH à 5,5 et laissez agiter le système réactionnel toute la nuit à température ambiante. Ensuite, dissolvez 11,2 grammes de chlorure de sodium dans deux litres d'eau distillée. Puis ajoutez 200 microlitres d'HCl à 37 % en masse.Dialysez la solution en utilisant une membrane ayant un seuil de coupure en poids moléculaire de 3,5 kilodaltons. Effectuez la dialyse pendant trois jours. Changez la solution de dialyse quotidiennement avec deux litres d'eau distillée fraîchement préparée contenant 200 microlitres de HCl à 37 % en poids.Conserver la solution finale à moins 80 degrés Celsius. Caractériser le polymère fonctionnalisé par spectroscopie de résonance magnétique nucléaire du proton, en dissolvant l'échantillon dans du D2O. Pour synthétiser le polymère PAA-RGD, dissoudre 78 milligrammes de PAA modifié par l'alkyne dans 10 millilitres d'eau distillée.Ensuite, dissoudre 25 milligrammes du dérivé RGD-azoture dans cinq millilitres de tétrahydrofurane. Ajouter toute la solution de RGD à la solution polymérique. Puis ajouter 2,2 milligrammes d'iodure de cuivre.Et 2,2 mg d'ascorbate de sodium. R&eacute;fluer le m&eacute;lange obtenu toute la nuit &agrave; 60 &deg;C sous agitation. Refroidir le m&eacute;lange &agrave; 25 &deg;C.Pour effectuer la dialyse de la solution, dissoudre 11,2 grammes de chlorure de sodium dans deux litres d'eau distillée et ajouter 200 microlitres d'acide HCl à 37 % en poids. Réaliser la dialyse pendant trois jours. Changer la solution de dialyse quotidiennement par deux litres d'eau distillée fraîchement préparée contenant 200 microlitres d'acide HCl à 37 % en poids.Ensuite, placer la solution finale à moins 80 degrés Celsius. Caractériser et conserver le polymère PAA-RGD obtenu comme cela a été fait pour ses constituants. Mélanger 40 milligrammes de carbomer et 10 milligrammes de PAA fonctionnalisé dans neuf millilitres de solution saline tamponnée au phosphate à température ambiante jusqu'à dissolution complète.Ajouter 400 milligrammes de PEG à la solution et continuer à agiter pendant 45 minutes. Arrêter l'agitation et laisser le système se stabiliser pendant 30 minutes. Ensuite, utiliser de l'hydroxyde de sodium à une molarité de 1 pour ajuster le pH à 7,4.À cinq millilitres du mélange obtenu, ajouter 25 milligrammes de poudre d'agarose. Exposer le système à un rayonnement micro-ondes à 500 watts pendant 30 secondes à une minute jusqu'à ébullition. Chauffer ensuite électromagnétiquement la solution à 80 degrés Celsius.Laisser le mélange exposé à température ambiante jusqu'à ce que sa température diminue à 50 degrés Celsius. Ajouter ensuite cinq millilitres de PBS pour obtenir une solution à un rapport volumétrique de un pour un. Préparer une plaque de 12 puits contenant des cylindres en acier d'un diamètre de 1,1 centimètre.Prélevez des aliquotes de 500 microlitres à partir de la solution et placez-les dans chaque cylindre en acier. Laissez le plateau au repos pendant 45 minutes jusqu'à ce que la gélification complète du système soit atteinte. Retirez les cylindres à l'aide de pinces en acier inoxydable pour obtenir les hydrogels.Voir le protocole écrit pour la caractérisation des propriétés physico-chimiques des hydrogels fonctionnalisés RGD. Le Carbomer 974P, le PAA-RGD et le PEG, ainsi que l'agarose, participent à une polycondensation aléatoire statistique après irradiation aux micro-ondes. Les groupes hydroxyles présents dans le PEG et l'agarose réagissent avec les groupes carboxyles présents dans le Carbomer 947P et le PAA-RGD pour former des hydrogels ACPEG-RGD.En tenant compte des propriétés rhéologiques, le module de conservation s'est révélé environ un ordre de grandeur supérieur au module de perte, indiquant un matériau élastique plutôt que visqueux. De plus, il est clairement visible que le comportement de l'hydrogel est dominé, à faible déformation, par le module élastique. La microscopie électronique à balayage montre la morphologie d'un échantillon d'hydrogel fonctionnalisé avec RGD et d'un hydrogel sans fonctionnalisation.Les deux hydrogels ont révélé qu'ils possèdent une structure fortement enchevêtrée de pores interconnectés, certains pores plus grands contenant des pores plus petits ainsi que des réseaux fibreux sur les parois des pores. Ces propriétés similaires indiquent que la présence de RGD n'altère pas le réseau polymère. Après ce développement, cette technique a ouvert la voie à des recherches dans le domaine du génie tissulaire afin d'explorer la stabilité de ces systèmes de culture cellulaire dans plusieurs autres maladies.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment fonctionnaliser les hydrogels. Améliorer leur capacité à maintenir des cellules souches viables.

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Découvrez la synthèse d'hydrogels fonctionnalisés RGD par cycloaddition CuAAC et polycondensation assistée par micro-ondes. Cette méthode améliore la viabilité cellulaire pour l'ingénierie tissulaire et la médecine régénérative.

La Synthèse des RGD-fonctionnalisé hydrogels comme un outil pour les applications thérapeutiques

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