Énumération des cellules souches neurales utilisant clonales Assays

L'objectif général de cette procédure est de déterminer la fréquence des cellules souches neuronales dans une population donnée, en utilisant la formation et la différenciation de neurosphères en conditions clonales. Cette méthode présente des applications essentielles dans le domaine des cellules souches neuronales, telles que l'évaluation de marqueurs candidats de cellules souches neuronales, la purification de cellules souches neuronales et la distinction entre cellules souches neuronales et progéniteurs neuronaux. Les avantages de cette méthode sont qu'elle nécessite 13 jours, ce qui est plus court que les méthodes actuelles de dénombrement de la fréquence des cellules souches neuronales, et qu'elle est réalisée en conditions clonales.

Pour commencer cette procédure, au jour un, préparez le milieu de croissance des CSM en combinant le milieu DMEM F12 avec le B27, l'EGF, le BFGF et la pénicilline-streptomycine. Ensuite, dissociez les neurosphères de souris E14,5 dans un millilitre de milieu de croissance des CSM et un millilitre de soude 0,05 normal pendant sept minutes à température ambiante. Pipetez les cellules vers le haut et vers le bas occasionnellement pour les maintenir en suspension, puis ajoutez un millilitre d'acide chlorhydrique 0,05 normal pour neutraliser l'alcali.

Ensuite, effectuez un dénombrement cellulaire à l’aide de la coloration au bleu de trypan et d’un hémocytomètre. Ensuite, semez des cellules de neurosphère de souris E14.5 individuelles à une densité de 50 cellules par millilitre ou moins, dans 100 microlitres de milieu de croissance pour cellules souches neuronales (NSC), dans une plaque de 96 puits. Incubez les cellules à 37 degrés Celsius, 5 % CO2 pendant une semaine afin de générer des neurosphères clonales.

Pour cultiver des neurosphères destinées au milieu conditionné, dissocier les neurosphères de souris E14,5 le troisième jour et ensemencer les cellules uniques à une densité de 20 000 cellules par millilitre dans 10 millilitres de milieu de croissance pour cellules souches neurales (NSC) dans une boîte de culture de 10 centimètres. Incuber ensuite les cellules à 37 degrés Celsius, 5 % CO2 pendant cinq jours afin de générer des neurosphères en culture massive. Le huitième jour, préparer la solution d’enrobage en mélangeant 700 microlitres de poly-L-lysine à 0,01 %, 70 microlitres de laminine, ajouter un milligramme par millilitre et 6 230 microlitres de PBS.

Ensuite, recouvrir un plat de culture de 10 centimètres avec sept millilitres de solution de poly-L-lysine laminine pendant deux heures à 37 °C. À l’aide d’une pipette serologique de 10 millilitres, transférer toutes les neurosphères en culture massive dans un tube conique de centrifugeuse de 15 millimètres. Centrifuger les neurosphères à 171 ×g pendant une minute à température ambiante, puis éliminer complètement le surnageant.

Ensuite, préparez le milieu de différenciation des cellules souches neurales en combinant le milieu DMEM F12 avec du B27 et du FBS. Ajoutez 10 millilitres de milieu de différenciation des cellules souches neurales aux neurosphères et pipetez plusieurs fois vers le haut et vers le bas afin de resuspendre les neurosphères. Puis aspirez le poly-L-lysine laminine du plat de culture de 10 centimètres et rincez une fois avec 10 millilitres de PBS.

Transférez toutes les neurosphères dans la boîte de culture de 10 centimètres revêtue de poly-L-lysine et de laminine, puis incubez-les toute la nuit à 37 degrés Celsius, 5 % CO2, afin que les neurosphères adhèrent à la boîte. Au huitième jour, comptez au microscope le nombre de neurosphères formées dans chaque puits, puis recouvrez chaque puits d'une lamelle-chambre à 50 puits avec 10 microlitres de solution de revêtement de poly-L-lysine et de laminine pendant deux heures à 37 degrés Celsius. Ensuite, préparez trois tubes coniques de centrifugeuse de 50 millilitres contenant chacun 30 millilitres de PBS.

À l’aide de pinces stériles, retirer la lamelle à 50 puits revêtue, plonger la lamelle à puits dans le premier tube de PBS, puis dans le second, et enfin dans le troisième tube de PBS afin de rincer la solution de revêtement. Ensuite, aspirer tout liquide résiduel présent dans les puits de la lamelle à puits. Transférer délicatement tout le milieu et les neurosphères de chaque puits de la plaque de 96 puits vers une seule boîte de culture de 10 centimètres.

S'assurer qu'un seul neurosphéroïde est prélevé à chaque fois en réglant la colonne de la pipette à deux microlitres sous le microscope, puis prélever un neurosphéroïde à l'aide d'une micropipette P10 équipée d'une pointe de pipette de 10 microlitres. Les neurosphéroïdes peuvent être prélevés sous le microscope, placés dans une hotte à flux laminaire ou sur un plan de travail. Transférer ensuite le neurosphéroïde au centre d'un puits d'une lame à couvre-objets chambre 50 puits revêtue.

Répétez les procédures jusqu'à ce que chaque puits du chambered cover slip contienne une neurosphère. Ajoutez ensuite 10 microlitres de milieu de différenciation des CNC à chaque puits du chambered cover slip. Placez le chambered cover slip dans une boîte de culture de 10 centimètres.

Jusqu'à deux lamelles à chambre peuvent être placées dans une boîte de 10 centimètres de diamètre. Ajouter du PBS aux bords de la boîte à l'aide d'une pipette afin d'éviter le dessèchement du milieu de différenciation des cellules souches neuronales. Incuber la lamelle à chambre toute la nuit à 37 degrés Celsius, 5 % CO2.

Le neuvième jour, transférez le milieu conditionné des neurosphères cultivées en masse dans un tube conique de centrifugation de 15 millilitres. À l’aide d’une seringue stérile de 20 millilitres, faites passer le milieu conditionné à travers un filtre de 0,2 micromètre afin d’éliminer toutes les cellules ou débris. Ensuite, transférez le milieu filtré de nouveau dans la boîte de culture de 10 centimètres.

Ensuite, à l’aide de pinces stériles, placer délicatement la lamelle à chambre dans le milieu conditionné de manière inversée, de sorte que les neurosphères échantillons soient orientées vers le bas. Incuber la lamelle à chambre pendant trois jours à 37 degrés Celsius, 5 % CO2. Au jour 12, retirer délicatement la lamelle à chambre de la boîte de culture de 10 centimètres à l’aide de pinces stériles.

Immergez délicatement la lame dans du PBS pour éliminer le milieu conditionné. Ensuite, retirez doucement le joint en silicone de la lame, en procédant lentement et prudemment pour éviter de casser la lame. Notez bien le côté sur lequel les neurosphères différenciées sont adhérentes.

Après cela, pipetez un millimètre de paraformaldéhyde à 4 % sur un morceau de film de paraffine découpé à la taille du coverslip. Placez délicatement le coverslip sur le film de paraffine, les neurosphères orientées vers le bas en contact avec le paraformaldéhyde, et fixez les neurosphères pendant 20 minutes à température ambiante. Ici, des neurosphères individuelles ont été sélectionnées et différenciées dans un coverslip à chambre 50 puits pendant trois jours.

Il s'agit d'une image représentative d'une neurosphère tripotente colorée avec du DAPI et immunomarquée pour GFAP, TUJ1 et O4. Cette image montre la superposition de DAPI, GFAP, TUJ1 et O4. Ce protocole est utilisé pour évaluer la capacité de LeX, un marqueur connu des CSM, à enrichir en CSM. Ce graphique montre le pourcentage de neurosphères unipotentes, bipotentes et tripotentes produites par des cellules positives pour LeX et des cellules négatives pour LeX. Les cellules positives pour LeX produisent significativement plus de neurosphères tripotentes que les cellules négatives pour LeX.

Ce tableau montre que la fréquence des cellules souches neurales (NSC) des cellules positives et négatives pour LeX a été calculée comme le produit du NFU et du pourcentage de neurosphères tripotentes. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment les neurosphères peuvent être cultivées et différenciées dans des conditions clonales afin de déterminer la fréquence des cellules souches neurales. Lors de la réalisation de cette méthode, il est important d'utiliser des milieux de croissance et de différenciation fraîchement préparés ainsi qu'une solution de revêtement fraîchement préparée pour garantir des conditions optimales de croissance et de différenciation des neurosphères.

Une fois maîtrisée, cette méthode peut être réalisée en 13 jours, un délai plus court par rapport aux méthodes actuelles d'analyse de la fréquence des cellules souches neuronales. Cette méthode pourrait être utilisée conjointement avec les méthodes existantes, telles que le test de formation de colonies neuronales, afin d'enrichir les cellules souches les plus récentes et d'identifier un marqueur définitif des cellules souches neuronales.