Name: Réalisé Conditionnement des protéines dans la membrane externe de vésicules Escherichia coli: Conception, production et purification (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-16T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 21 s
Description: Découvrez le conditionnement d'enzymes dans des vésicules de membrane externe d'Escherichia coli pour améliorer leur stabilité. Cette méthode permet la catalyse cellulaire sans cellules et des applications thérapeutiques.

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Cette recherche a été financée par l’Office of Naval Research grâce aux fonds de base fournis au Naval Research Laboratory.

1. Préparation de Plasmides <ol><li> Préparer un plasmide (par exemple, pET22) contenant la protéine d&#39;ancrage (OmpA) fusionné à un domaine de liaison biorthogonal (dénommé dans le présent protocole d&#39; ancrage-ST), marqueur d&#39;épitope (comme 6xHis, myc ou FLAG balises pour la purification et l&#39; identification), tag périplasmique de localisation, la résistance aux antibiotiques, et l&#39; origine de réplication appropriée en fonction de la souche bactérienne sélectionnée 7. <ol><li> Extraire l&#39;ADN plasmidique à partir de cultures d&#39;une nuit en utilisant un kit d&#39;isolement d&#39;ADN disponible dans le commerce en suivant le protocole du fabricant. </li></ol></li><li> Préparer un plasmide (par exemple, pACYC184) contenant l&#39;enzyme / protéine (PTE) à emballer dans le OMV fusionné au domaine de liaison bioorthogonal complémentaire à celle de la protéine d&#39;ancrage (dénommé dans le présent protocole comme enzyme-SC), épitope tag, balise de localisation périplasmique, la résistance aux antibiotiques qui est différente de la protéine d&#39;ancrage plasmide approprié et origdans la réplication sur la base de la souche bactérienne sélectionnée 7. <ol><li> Extraire l&#39; ADN plasmidique à partir de cultures d&#39;une nuit en utilisant un kit d&#39;isolement d&#39;ADN disponible dans le commerce en suivant le protocole du fabricant 7. </li></ol></li></ol> 2. Génération d&#39;un OMV Packaging E. coli Culture <ol><li> Le plasmide Isolation <ol><li> On purifie les plasmides codant pour l&#39;enzyme SC construction et d&#39; ancrage ST construit à partir de lignées cellulaires d&#39;entretien séparés en utilisant un kit d&#39;isolement de plasmide commercial selon le protocole du fabricant 7. Déterminer la concentration d&#39;ADN et de pureté en mesurant l&#39;absorbance à 260 nm et 280 nm. </li></ol></li><li> Co-transformation <ol><li> Sélectionner une souche de E. coli qui est disponible dans le commerce pour faciliter l&#39; expression de la protéine. REMARQUE: BL21 (DE3), les cellules ont été utilisées ici. Lysogène T7 est nécessaire pour l&#39;expression de la construction d&#39;ancre ST, qui repose sur le promoteur T7 et l&#39;ARN polymerase T7 pour protexpression ein. L&#39; utilisation d&#39;autres souches bactériennes requiert soit la présence du gène de la T7 lysogène ou l&#39;utilisation d&#39;un plasmide autre que pET22 7. </li><li> Diluer l&#39;ADN plasmidique purifié à des concentrations molaires équivalentes puis les transformer en cellules bactériennes compétentes, via une transformation de choc thermique ou l&#39;électroporation suivant le protocole du fabricant pour les cellules compétentes choisies. </li><li> Plate transformé cellules sur Luria-Bertani (LB) des plaques d&#39;agar avec de l&#39;ampicilline (pET22) et chloramphénicol (pACYC184) contenant un antibiotique; deux présents à des concentrations finales de 25 ug / ml. </li><li> Placer le récipient de culture à 37 ° C pendant une nuit pour isoler uniquement les clones contenant les deux plasmides. NOTE: Les colonies qui survivent à la sélection des antibiotiques seront utilisés pour toutes les futures préparations OMV. Des antibiotiques (ampicilline et de chloramphénicol) seront ajoutées à toutes les cultures liquides pour maintenir une pression sélective et de garantir la présence des deux plasmides. </li></ol></li></ol> 3. OMV production <ol><li> Expansion des colonies <ol><li> Inoculer 5 ml de milieu de culture (habituellement Terrific Broth (TB) ou LB) contenant des antibiotiques aux concentrations mentionnées ci-dessus (étape 2.2.3) avec une colonie unique à partir des plaques de sélection décrites au point 2.2.4. </li><li> Effectuer une dilution 1: 100 pli de la culture de départ pendant la nuit dans des flacons de culture à chicanes. REMARQUE: Utiliser un volume de médias entre 250-500 ml. </li><li> Maintenir la culture à 37 ° C sous agitation à 250 tours par minute pour faire en sorte que l&#39;aération suffisante de la culture est atteinte. </li></ol></li><li> Induction de chaque plasmide <ol><li> Permettre à la culture de bactéries de croître jusqu&#39;à une DO 600 de 0,6 à 0,8, environ 3 heures après l&#39; inoculation de la croissance du flacon de croissance primaire. </li><li> Pour améliorer le rendement final des PTE-SC vésicules chargées, centrifuger l&#39;ensemble de la culture à 7000 xg pendant 15 min. Remettre en suspension le culot cellulaire dans préchauffée, milieu de culture frais. NOTE: Cette optional étape permet de supprimer tout OMV vide qui sont présents dans les milieux de culture avant PTE-SC induction. </li><li> Faire une solution stock de 20% de L-arabinose dans l&#39;eau et le filtre stérile en utilisant un filtre de 0,22 um. solution de L-arabinose conserver à 4 ° C pendant 2-4 semaines. </li><li> Ajouter la solution de L-arabinose dans le flacon de culture à une concentration finale de 0,2% pour initier la production SDT-SC. NOTE: Cela permet de précharger l&#39;espace périplasmique avec PTE-SC avant de promouvoir l&#39;augmentation vesiculation par induction du mutant OmpA-ST. </li><li> Préparer une solution à 1 M isopropyl β-D-thiogalactopyranoside 1 (IPTG) dans de l&#39;eau stérile et de filtrage utilisant un filtre de 0,22 um. NOTE: IPTG doit être utilisé immédiatement une fois hydraté. Des portions aliquotes de l&#39;IPTG peuvent être stockés congelés pendant 3-6 mois et peuvent être décongelées immédiatement avant l&#39;utilisation. </li><li> Ajouter de l&#39;IPTG après une période d&#39;incubation de 3 heures supplémentaires à une concentration finale de 0,5 mM pour amorcer la production de l&#39;OmpA-ST. </li><li> Laisser le culture à croître pendant un 8-14 heures supplémentaires à 37 ° C tout en agitant. </li></ol></li></ol> 4. OMV Purification <ol><li> L&#39;élimination des bactéries intactes <ol><li> Centrifuger le milieu de culture bactérienne pendant 15 minutes à 7000 g à 4 ° C pour sédimenter les bactéries intactes. </li><li> Décanter, et enregistrer, les médias du haut du poste de centrifugation culot cellulaire en faisant attention à ne pas perturber le culot cellulaire. </li><li> Répétez les étapes 4.1.1 et 4.1.2 pour un cycle de centrifugation supplémentaire pour assurer que toutes les bactéries intactes sont retirés de milieux de culture en étant sûr de transvaser et enregistrer les médias. </li></ol></li><li> Enlèvement d&#39;agrégats de protéines <ol><li> purifier davantage les milieux de culture bactérienne en utilisant un filtre de 0,45 um à membrane pour éliminer les bactéries résiduelles et le grand matériel cellulaire indésirable. REMARQUE: Utiliser un matériau de membrane biologiquement compatible pour recouvrements plus élevés et plus faible adsorption des protéines telles que l&#39;acétate de cellulose (CA) ou polyfluorure de vinylidène (PVDF). volumes de filtre Seringue de moins de 100 ml et les volumes de filtre à vide de plus de 100 ml. <ol><li> Pour filtre seringue, dessiner un milieu de culture stérile dans 10-50 ml seringue. Fixer le filtre à 0,45 pm extrémité Luer de la seringue. Enfoncer plongeur et de recueillir accréditives dans un nouveau navire. </li><li> Pour aspirer le filtre, le transfert du milieu de culture à un appareil de filtration stérile. Fixer l&#39;unité la pompe à vide ou couler aspirateur pour générer aspiration. Transfert milieu filtré à nouveau navire. </li></ol></li></ol></li><li> L&#39;isolement des OMV par ultracentrifugation <ol><li> Ajouter les milieux de culture filtré dans des tubes de centrifugation en faisant attention à l&#39;équilibre des tubes opposés dans la centrifugeuse. </li><li> Bouletage à ~ 150 000 xg pendant 3 heures à 4 ° C dans une ultracentrifugeuse à l&#39;aide du rotor correspondant correspondant à l&#39;instrument et les tubes étant utilisés. </li><li> Décanter le milieu de culture appauvri OMV du culot OMV, en faisant attention de ne pas perturber le culot OMV, immédiatement à la fin of centrifugation en permettant le culot OMV de rester dans les médias adoucira le culot en réduisant la récupération OMV. NOTE: Ce culot sera légèrement brun et en fonction du montant de départ de la culture bactérienne peut ou peut ne pas être visible à l&#39;oeil nu. Aspirer les médias directement à partir de la partie supérieure du tube de centrifugation est également une option en gardant à l&#39;esprit que les médias plus retirés du OMV granulés plus pur l&#39;échantillon final OMV sera. </li><li> Enregistrez le surnageant centrifugé pour un test ultérieur dynamique diffusion de la lumière (DLS) pour vérifier que les particules OMV ont été complètement déchargées par les médias. </li><li> Ajouter 0,5 à 1 ml de solution saline tamponnée phosphate filtré (PBS) à pH 7,4 ou 100 mM de N -cyclohexyl-2-aminoéthanesulfonique acide (CHES) , du tampon stérile à pH 8,0 , au culot OMV qui lui permet de les incuber pendant 30 min à température ambiante. Assurez-vous que la pastille ne se dessèche pas. NOTE: Extremes dans la force de solution ionique, le pH et la température peut entraîner une diminution de la solubilité OMV et promouvoir totalisationtion. </li><li> Déposer avec soin la solution purifiée OMV du tube de centrifugeuse, en mélangeant doucement pour assurer la totalité du culot a été solubilisé. </li></ol></li></ol> 5. OMV Caractérisation <ol><li> Utilisez un logiciel DLS ou de suivi des nanoparticules disponibles dans le commerce en suivant les protocoles du fabricant fourni propres à chaque instrument pour déterminer la distribution de taille OMV et la concentration des particules. NOTE: Ici, la distribution de taille OMV et la concentration a été déterminée en utilisant NanoSight LM10 Tracking Nanoparticules et NTA 2.3 Logiciel d&#39;analyse. <ol><li> Ouvrez le logiciel. </li><li> Allumez microscope et nettoyer toutes les surfaces de l&#39;unité de microscope et le suivi des nanoparticules. </li><li> Ajouter ~ 0,5 ml d&#39;échantillon OMV directement à la fenêtre de visualisation du dispositif de suivi des particules à travers le raccord Luer avec un 1 ml seringue stérile en étant sûr de couvrir la totalité de la fenêtre de visualisation sans injecter les bulles d&#39;air dans le système. </li><li> Lieu til nanoparticule unité de suivi sur la scène du microscope et allumer le laser. </li><li> Cliquez sur &quot;Capture&quot; dans le logiciel. </li><li> Réglez la mise au point du microscope et en scène pour visualiser les particules sur l&#39;écran de prévisualisation présente dans la fenêtre du logiciel. </li><li> Réglez le &quot;obturateur de caméra» et «Gain de caméra&quot; jusqu&#39;à ce que les particules lumineuses sont clairement visualisées sur un fond sombre. </li><li> Régler la durée de capture à 60 sec. </li><li> Cliquez sur &quot;Enregistrer&quot;. </li><li> Lorsque vous êtes invité, entrée la température / de l&#39;appareil de l&#39;échantillon, l&#39;étiquette de l&#39;échantillon, et enregistrer les données vidéo à la fin de l&#39;exécuter dans chaque dossier utilisateur désigné. </li><li> Conservez tous les paramètres d&#39;analyse (seuil de détection, Blur, Min Longueur du rail, taille des particules Min attendu) sur la détection automatique en mode et cliquez sur &quot;Séquence de processus.&quot; NOTE: Consultez le manuel pour savoir comment chaque paramètre peut être réglé indépendamment pour fins résultats d&#39;analyse de hauteur. </li><li> Répartition de la taille des particules de la fiche et de particules / ml Concentration tel que déterminé par le logiciel. NOTE: Une OMV gamme de taille hydrodynamique typique se situe entre 30-200 nm avec une concentration de particules / ml de ~ 10 x 10 8. </li></ol></li><li> Teneur en protéines de détermination OMV <ol><li> Utilisez SDS-PAGE standard et des protocoles de transfert de Western pour évaluer OMV pureté, la production d&#39;enzymes, et la réticulation efficacité SC-ST 7. NOTE: Réticulation l&#39; efficacité ne sera pas 100% 7. </li></ol></li></ol> 6. Vérification de l&#39;enzyme Conditionnement <ol><li> PTE Essai d&#39;activité <ol><li> Effectuer toutes les dosages enzymatiques dans un tampon approprié, tel que CHES 100 mM (pH 8) à 25 ° C, soit dans une cuvette ou dans une plaque multiplexé bien 96/384. </li><li> Ajouter 5 ul d&#39;un mélange 1: 1000 dilution de paraoxone dans un tampon CHES 90 ul de CHES et 5 ul d&#39;OMV purifié (~ 36 fois concentré par rapport à la concentration d&#39;OMV présent dans les milieux de culture). Attention: Paraoxon est un pesticide toxiqueet doit être manipulé par le fabricant et les directives institutionnelles. </li><li> Prenez les lectures d&#39;absorbance à intervalles réguliers (tous les 20 sec pour ~ 2 heures de temps de réaction total) à 405 nm (ε = 18,1 mM -1 cm -1) et à 348 nm (isosbestique point de ε = 5,4 mM -1 cm -1) à surveiller la progression de la réaction du produit de décomposition du paraoxone chromogénique, p - nitrophénol. REMARQUE: A des valeurs de pH supérieures à 8 la forme déprotonée dominante de p - nitrophénol est présent permettant un suivi précis à 405 nm. Dans toutes les autres solutions de pH ou moins complexe , il est nécessaire d&#39;utiliser le point de 348 nm isosbestique que des formes multiples de p - nitrophénol seront présents. </li><li> Calculer les vitesses de réaction initiales en déterminant la pente de la partie linéaire des courbes de progression de l&#39;étape 6.1.3 pour comparer la quantité relative de SDT dans chaque échantillon, l&#39;efficacité d&#39;emballage, et la production de SDT totale. </li><li> Effectuer enzymatique normeprotocoles d&#39;essai pour déterminer K M, V max et k cat pour le OMV encapsulés PTE. Remarque: Une analyse de Lineweaver-Burk peut être utilisé pour déterminer ces paramètres cinétiques où l&#39;ordonnée à l&#39; origine = 1 / Vmax et de la pente max = 20 K M / V. </li></ol></li><li> Transmembranaire Substrat / Diffusion du produit. <ol><li> Effectuer la même analyse de dosage cinétique comme décrit dans l&#39;étape 6.1 en utilisant des concentrations croissantes de Triton X-100 dans un tampon CHES de 0-3% en volume. REMARQUE: L&#39;addition de Triton X-100 aux fonctions solubilisées OMV pour perturber la double couche lipidique qui permet au contenu du OMV à être librement accessibles à la solution réactionnelle. </li><li> Calculer et comparer les vitesses initiales à chaque niveau de Triton X-100 pour vérifier le passage transmembranaire du substrat / produit indiqué par un changement minimal de l&#39;activité enzymatique (les vitesses initiales) par rapport à l&#39;activité enzymatique in l&#39;absence de Triton X-100. Si une augmentation substantielle de l&#39;activité enzymatique est observée en présence de Triton X-100, il est probable que le substrat ne diffuse pas librement dans l&#39;OMV. </li><li> l&#39;activité de l&#39;enzyme libre dosage (comme décrit ci-dessus dans la section 6.1) en présence de Triton X-100 pour vérifier que l&#39;activité enzymatique est pas inhibée par l&#39;agent tensio-actif lui-même. REMARQUE: si l&#39;activité est fortement influencée par le Triton X-100, d&#39;autres additifs, tels que les saponines ou différents polysorbate / tween tensio-actifs peuvent être plus appropriés pour rompre la membrane OMV. </li></ol></li></ol> 7. OMV Storage <ol><li> Gel <ol><li> aliquotes place ~ 100 ul de purifié OMV directement dans l&#39;azote liquide pour enclencher geler les aliquotes étant sûr de ne pas submerger complètement les flacons ou contacter l&#39;un de l&#39;azote liquide avec l&#39;échantillon lui-même. NOTE: Purifié OMV peut être congelé instantanément directement dans le tampon qui a été choisi pour solubiliser le culot OMV pendant la purificatprocessus ion sans cryoprotecteurs supplémentaires nécessaires 7. </li><li> Rangez les snap congelés aliquotes à -80 ° C. </li><li> Décongeler aliquotes congelées de l&#39;étape 7.1.1 en les plaçant à la température ambiante en étant sûr de ne pas chauffer les échantillons. </li><li> Avant de préparer tous les échantillons pour le stockage de cette manière, réaliser le dosage de l&#39;enzyme décrite dans l&#39;étape 6.1 on compare les vitesses initiales avant et après congélation pour vérifier qu&#39;il n&#39;y a pas de perte significative de l&#39;activité enzymatique après congélation-décongélation. NOTE: Magasin purifié OMV à 4 ° C si une réduction de l&#39;activité enzymatique est observée en raison de la congélation. </li></ol></li><li> lyophilisation <ol><li> Lyophiliser les snap congelés aliquotes OMV purifiées en utilisant des équipements disponibles dans le commerce de lyophilisation 21. </li><li> Magasin aliquotes lyophilisée à température ambiante pendant des semaines ou à -80 ° C pendant plusieurs mois. </li><li> Ajouter le même volume d&#39;eau purifiée à l&#39;OMV lyophilisé comme avant la lyophilisation et laisser reposer à température ambiante pendant 30 min pour réhydrater til échantillonner. Mélanger doucement quand étant nécessaire sûr de ne pas vortex ou Soniquer l&#39;OMV. </li><li> Ajouter la poudre lyophilisée OMV directement au point-of-care pour les applications où avant dilution / solubilisation est pas nécessaire. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Avila-Calderon, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+bacterial+membrane+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Roles of bacterial membrane vesicles.</a> Arch. Microbiol. 197, 1-10 (2015).</li>
<li>Kulp, A., Kuehn, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+functions+and+biogenesis+of+secreted+bacterial+outer+membrane+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Biological functions and biogenesis of secreted bacterial outer membrane vesicles.</a> Annu. Rev. Microbiol. 64, 163-184 (2010).</li>
<li>Beveridge, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structures+of+Gram+negative+cell+walls+and+their+derived+membrane+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Structures of Gram negative cell walls and their derived membrane vesicles.</a> J. Bacteriol. 181, 4725-4733 (1999).</li>
<li>Kulkarni, H. M., Jagannadham, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biogenesis+and+multifaceted+roles+of+outer+membrane+vesicles+from+Gram-negative+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Biogenesis and multifaceted roles of outer membrane vesicles from Gram-negative bacteria.</a> Microbiology. 160, 2109-2121 (2014).</li>
<li>Ellis, T. N., Kuehn, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virulence+and+immunomodulatory+roles+of+bacterial+outer+membrane+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol.+Mol.+Biol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Virulence and immunomodulatory roles of bacterial outer membrane vesicles.</a> Microbiol. Mol. Biol. Rev. 74, 81-94 (2010).</li>
<li>Berleman, J., Auer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+bacterial+outer+membrane+vesicles+for+intra-+and+interspecies+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The role of bacterial outer membrane vesicles for intra- and interspecies delivery.</a> Environ. Microbiol. 15, 347-354 (2013).</li>
<li>Alves, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+nanobioreactors-directing+enzyme+packaging+into+bacterial+outer+membrane+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Appl.+Mater.+Interfaces%22%5BJournal%5D)">Bacterial nanobioreactors-directing enzyme packaging into bacterial outer membrane vesicles.</a> ACS Appl. Mater. Interfaces. 7, 24963-24972 (2015).</li>
<li>Kim, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+bacterial+outer+membrane+vesicles+with+enhanced+functionality%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Engineered bacterial outer membrane vesicles with enhanced functionality.</a> J. Mol. Biol. 380, 51-66 (2008).</li>
<li>Haurat, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+sorting+of+cargo+proteins+into+bacterial+membrane+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Selective sorting of cargo proteins into bacterial membrane vesicles.</a> J. Biol. Chem. 286, 1269-1276 (2011).</li>
<li>Kesty, N. C., Kuehn, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incorporation+of+heterologous+outer+membrane+and+periplasmic+proteins+into+Escherichia+coli+outer+membrane+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Incorporation of heterologous outer membrane and periplasmic proteins into Escherichia coli outer membrane vesicles.</a> J. Biol. Chem. 279, 2069-2076 (2003).</li>
<li>Zakeri, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptide+tag+forming+a+rapid+covalent+bond+to+a+protein%2C+through+engineering+a+bacterial+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Peptide tag forming a rapid covalent bond to a protein, through engineering a bacterial adhesion.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, e690-e697 (2012).</li>
<li>Li, L., Fierer, J. O., Rapoport, T. A., Howarth, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+analysis+and+optimization+of+the+covalent+association+between+SpyCatcher+and+a+peptide+tag%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Structural analysis and optimization of the covalent association between SpyCatcher and a peptide tag.</a> J. Mol. Biol. 426, 309-317 (2014).</li>
<li>Dumas, D. P., Durst, H. D., Landis, W. G., Raushel, F. M., Wild, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inactivation+of+organophosphorus+nerve+agents+by+the+phophotriesterase+from+Pseudomonas-Diminuta%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Biochem.+Biophys%22%5BJournal%5D)">Inactivation of organophosphorus nerve agents by the phophotriesterase from Pseudomonas-Diminuta.</a> Arch. Biochem. Biophys. 277, 155-159 (1990).</li>
<li>Bigley, A. N., Raushel, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Catalytic+mechanisms+for+phosphotriesterases%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biochim.+Biophys.+Acta%2C+Proteins+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Catalytic mechanisms for phosphotriesterases.</a> Biochimica et Biochim. Biophys. Acta, Proteins Proteomics. 1834, 443-453 (2013).</li>
<li>Minton, N. A., Murray, V. S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+organo-phosphate+poisoning%5BTitle%5D)+AND+%22Med.+Toxicol.+Adverse+Drug+Exper%22%5BJournal%5D)">A review of organo-phosphate poisoning.</a> Med. Toxicol. Adverse Drug Exper. 3, 350-375 (1988).</li>
<li>Bigley, A. N., Xu, C., Henderson, T. J., Harvey, S. P., Raushel, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+neutralization+of+the+chemical+warfare+agent+VX%3A+Evolution+of+phosphotriesterase+for+phosphorothiolate+hydrolysis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Enzymatic neutralization of the chemical warfare agent VX: Evolution of phosphotriesterase for phosphorothiolate hydrolysis.</a> J. Am. Chem. Soc. 135, 10426-10432 (2013).</li>
<li>Chatterjee, S. N., Chaudhuri, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gram-negative+bacteria%3A+the+cell+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Outer+Membrane+Vesicles+of+Bacteria.+SpringerBriefs+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Gram-negative bacteria: the cell membranes.</a> Outer Membrane Vesicles of Bacteria. SpringerBriefs in Microbiology. , 15-34 (2012).</li>
<li>Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+function+of+OmpA+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">The function of OmpA in Escherichia coli.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 292, 396-401 (2002).</li>
<li>Danoff, E. J., Fleming, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+soluble%2C+periplasmic+domain+of+OmpA+folds+as+an+independent+unit+and+displays+chaperone+activity+by+reducing+the+self-association+propensity+of+the+unfolded+OmpA+transmembrane+beta-barrel%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+Chem%22%5BJournal%5D)">The soluble, periplasmic domain of OmpA folds as an independent unit and displays chaperone activity by reducing the self-association propensity of the unfolded OmpA transmembrane beta-barrel.</a> Biophys. Chem. 159, 194-204 (2011).</li>
<li>Alves, N. J., Kline, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+study+on+the+inhibition+of+plasmin+and+delta-plasmin+via+benzamidine+derivatives%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Comparative study on the inhibition of plasmin and delta-plasmin via benzamidine derivatives.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 457, 358-362 (2015).</li>
<li>Wang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lyophilization+and+development+of+solid+protein+pharmaceuticals%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Pharm%22%5BJournal%5D)">Lyophilization and development of solid protein pharmaceuticals.</a> Int. J. Pharm. 203, 1-60 (2000).</li>
<li>Goormaghtigh, E., Scarborough, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Density-based+separation+of+liposomes+by+glycerol+gradient+centrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Density-based separation of liposomes by glycerol gradient centrifugation.</a> Anal. Biochem. 159, 122-131 (1986).</li>
<li>Alves, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functionalized+liposome+purification+via+Liposome+Extruder+Purification+%28LEP%29%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">Functionalized liposome purification via Liposome Extruder Purification (LEP).</a> Analyst. 138, 4746-4751 (2013).</li>
<li>Mayer, L. D., StOnge, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+free+and+liposome-associated+doxorubicin+and+vincristine+levels+in+plasma+under+equilibrium+conditions+employing+ultrafiltration+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Determination of free and liposome-associated doxorubicin and vincristine levels in plasma under equilibrium conditions employing ultrafiltration techniques.</a> Anal. Biochem. 232, 149-157 (1995).</li>
<li>Blakeley, B. D., Chapman, A. M., McNaughton, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Split-superpositive+GFP+reassembly+is+a+fast%2C+efficient%2C+and+robust+method+for+detecting+protein-protein+interactions+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+BioSyst%22%5BJournal%5D)">Split-superpositive GFP reassembly is a fast, efficient, and robust method for detecting protein-protein interactions in vivo.</a> Mol. BioSyst. 8 (2036), (2012).</li>
<li>De Crescenzo, G., Litowski, J. R., Hodges, R. S., O'Connor-McCourt, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+monitoring+of+the+interacation+of+two-stranded+de+novo+designed+coiled-coils%3A+effect+of+chain+length+on+the+kinetic+and+thermodynamic+constants+of+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Real-time monitoring of the interacation of two-stranded de novo designed coiled-coils: effect of chain length on the kinetic and thermodynamic constants of binding.</a> Biochemistry. 42, 1754-1763 (2003).</li>
<li>Charalambous, A., Antoniades, I., Christodoulou, N., Skourides, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Split-Intein+for+simultaneous+site-specific+conjugation+of+quantum+dots+to+multiple+protein+targets+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Nanobiotechnol%22%5BJournal%5D)">Split-Intein for simultaneous site-specific conjugation of quantum dots to multiple protein targets in vivo.</a> J. Nanobiotechnol. 9, 1-14 (2011).</li>
<li>Lee, E. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+proteomic+profiling+of+native+outer+membrane+vesicles+derived+fromEscherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Global proteomic profiling of native outer membrane vesicles derived fromEscherichia coli.</a> Proteomics. 7, 3143-3153 (2007).</li>
<li>Alves, N. J., Turner, K. B., Medintz, I. L., Walper, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protecting+enzymatic+function+through+directed+packaging+into+bacterial+outer+membrane+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Protecting enzymatic function through directed packaging into bacterial outer membrane vesicles.</a> Sci. Rep. 6, 24866(2016).</li>
<li>Alves, N. J., Turner, K. B., Medintz, I. L., Walper, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+therapeutic+delivery+capabilities+and+challenges+utilizing+enzyme%2Fprotein+packaged+bacterial+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Ther.+Delivery%22%5BJournal%5D)">Emerging therapeutic delivery capabilities and challenges utilizing enzyme/protein packaged bacterial vesicles.</a> Ther. Delivery. 6, 873-887 (2015).</li>
</ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à dévoiler.

Ces fonctions de protocole pour démontrer un représentant dirigé technique d&#39;emballage dans lequel une enzyme d&#39;intérêt est produite et conditionnée par OMV dans E. coli. Comme avec beaucoup de techniques complexes, il existe de multiples domaines dans lesquels le protocole peut être modifié pour tenir compte pour une utilisation dans différentes applications uniques, dont certaines sont détaillées ci-dessous. Bien que le mécanisme d&#39;OMV emballage et de l&#39;enzyme encapsulation peut être adaptée a...

Nous présentons ici une méthode pour la conception, la production et la purification des bactéries vésicules de membrane externe de l&#39;enzyme chargée (OMV). OMV sont petites, principalement unilamellaires, protéoliposomes qui varient en taille de 30 à 200 nm de 1,2. Toutes les bactéries Gram-négatives et Gram-positives qui ont été étudiés à ce jour ont démontré la libération des deux OMV ou vésicules extracellulaires (EV) à partir de leur surface 3,4. Le mécanisme précis par lequel OMV sont produites doivent encore être complètement élucidé en raison des populations bactériennes diverses qui les ainsi que les fonctions variables qu&#39;ils servent sécrètent. OMV a été démontré que pour transporter un large éventail de marchandises à partir de petites molécules, des peptides et des protéines au matériel génétique servant une variété de signalisation complexe, translocation du gène, et les fonctions de virulence 5,6. Les mécanismes exacts de OMV biogenèse ne sont pas bien caractérisées, et semblent différer entre les espèces bactériennes. Malgré thide fait, nous avons mis au point un procédé pour améliorer l&#39;efficacité de l&#39;emballage d&#39;une protéine recombinante dans OMV en créant une liaison entre une protéine synthétique d&#39;intérêt et d&#39;une protéine endogène très abondant à la membrane externe bactérienne et OMV ultérieure. En l&#39;absence d&#39;une liaison synthétique, ou une affinité incorporée artificiellement entre la protéine exprimée de manière recombinante et OMV l&#39;efficacité de l&#39; emballage est très faible observée 7. Ce résultat est à prévoir que l&#39;incorporation des protéines au sein de l&#39;OMV soit se produit par hasard encapsulation par hasard au moment précis de la formation OMV à la surface bactérienne ou par emballage dirigé par des mécanismes qui ne sont pas bien comprises. Un certain succès a été observé dans l&#39;emballage de protéines simplement par-dessus l&#39;expression dans l&#39;espace périplasmique qui repose sur l&#39;encapsulation de hasard, mais l&#39;emballage efficace est hautement la protéine dépendante avec des protéines d&#39;emballage à haute efficacité par rapport à d&#39;autres eà ne pas emballer du tout 8-10. En utilisant des techniques de biologie synthétique communs , nous avons cherché à concevoir Escherichia coli (E. coli) pour produire simultanément, ensemble et sécrètent une enzyme active d&#39;intérêt dans OMV qui contourne les limites des connaissances actuelles sur la façon dont OMV sont formés et comment la cargaison est sélectionnée par les bactéries pour emballage. Aux fins de cette application, un système de la protéine bioconjugaison scission a été choisi comme le lien synthétique de choix pour faciliter l&#39;emballage directionnel dans le OMV. Comme le nom l&#39;indique, un système de bioconjugaison protéine intermédiaire est constituée de deux domaines de sous-unités complémentaires qui interagissent les unes avec les autres. Les domaines protéiques split sélectionnés aux fins de ce protocole sont désignées sous le nom de SpyCatcher (SC) et SpyTag (ST) domaine et sont dérivées de la pyogenes fibronectine-binding protein Streptococcus (FBAB) 11. Ce système de protéines de division est inhabituel en ce worsque les deux sous-unités sont dans la proximité d&#39;une liaison isopeptidique forme spontanément entre les extrémités proximale aspartique résidus d&#39;acides aminés acides et la lysine en créant une liaison covalente. Formation d&#39; une liaison isopeptidique ne nécessite pas l&#39;addition de protéines chaperons, des enzymes catalytiques, ou des cofacteurs et peut facilement se produire à la température ambiante (RT) et sur une large gamme de conditions physiologiquement pertinentes 12. Comme une preuve de concept, phosphotriestérase (PTE) (EC 3.1.8.1) de Brevundimonas diminuta a été sélectionné pour être emballé dans E. coli dérivé OMV 13. PTE contient un site actif Zn / Zn binucléaire et a la capacité de décomposer les organophosphates par une réaction d&#39;hydrolyse convertissant aryldialkylphosphates en dialkylphosphates et alcools aryliques 14. L&#39;exposition aux organophosphorés altère le bon fonctionnement des neurotransmetteurs en inhibant l&#39;hydrolyse de l&#39;acétylcholine par l&#39;acétylcholinestérase au neuromusculaires jonctions makincomposés g organophosphorés dérivés extrêmement dangereuses 15. L&#39; exposition prolongée ou significative aux organophosphorés entraîne fréquemment des convulsions incontrôlables et provoque généralement la mort par asphyxie. Bien que PTE présente l&#39;activité catalytique la plus élevée vers paraoxone, un insecticide très puissant, il est également capable d&#39;hydrolyser un large éventail d&#39;autres pesticides et V / G de type agents neurotoxiques chimiques 16. Pour faciliter l&#39;emballage d&#39;OMV, un plasmide bactérien a été conçu qui code pour un produit de construction génique qui contient un promoteur inductible, une séquence de localisation périplasmique et un site de clonage multiple courte en amont de la séquence du gène SC. Insertion du gène de SDT entre le leader et la séquence SC a permis la création d&#39;un commutateur génétique qui cible la protéine de fusion SDT-SC vers l&#39;espace périplasmique pour le conditionnement d&#39;OMV. Alors que les efforts décrits ici portent sur SDT, le gène de l&#39;enzyme est interchangeable et peut être facilement remplacée par une autre séquence de gène de facemballage ilitate d&#39;une autre enzyme ou d&#39;une protéine. La deuxième partie de la liaison synthétique, une protéine de la membrane externe abondant (OmpA) est choisi pour présenter la séquence peptidique ST. Bien que le choix de la protéine d&#39;ancrage peut varier, il est essentiel que la protéine possède un domaine permissif qui se présente dans l&#39;espace périplasmique, tolère la construction de fusion sans induire une cytotoxicité, est connu pour être présent dans OMV et ne regroupe pas quand il est recombinaison produite. OmpA est une protéine de 37,2 kDa transmembranaire porine qui est connu pour être fortement exprimé dans la membrane externe des bactéries et après 17 OMV. Elle est impliquée dans le transport de petites molécules, &lt;2 nm de diamètre, à travers la membrane bactérienne 18. Natif OmpA possède deux domaines structurellement uniques, un motif de fût transmembranaire bêta et une partie C-terminale periplasmically soluble connu pour interagir avec le peptidoglycane 19. Dans le mutant OmpA-ST fusion designed ici la partie C-terminale de l&#39;OmpA a été supprimé et le ST a été fusionné à l&#39;extrémité N- face periplasmically ou C-terminales. Suppression de la partie périplasmique de OmpA diminue le nombre d&#39;interactions entre la membrane externe et le peptidoglycane entraînant la déstabilisation de la membrane conduisant à l&#39; hyper-vesiculation 7. Gnomique OmpA a été maintenue en plus du exprimé de manière recombinante OmpA-ST construction brute pour atténuer la déstabilisation de la membrane.

<table><tbody><tr><td>IPTG</td><td>N’importe lequel</td><td></td><td>Préparez toujours frais ou aliquote et congelez.</td></tr><tr><td>L-arabinose</td><td>N’importe lequel</td><td></td><td>Peut être préparé à l’avance et stocké à 4 &deg ;C.</td></tr><tr><td>Ampicilline</td><td>N’importe quel</td><td></td><td>Ajouter immédiatement avant l’utilisation après que le milieu ait suffisamment refroidi après avoir été autoclave. &nbsp ;</td></tr><tr><td>Chloramphénicol&nbsp ;</td><td>Tout</td><td></td><td>ajout immédiatement avant l’utilisation après que le support ait suffisamment refroidi après avoir été autoclave.&nbsp ; &nbsp ;</td></tr><tr><td>TB/LB Milieux de culture</td><td>Tout</td><td></td><td>autre milieu de croissance fonctionnera probablement de la même manière.</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>N’importe lequel</td><td></td><td>des nombreux tensioactifs potentiellement appropriés. &nbsp ;</td></tr><tr><td>Fioles de culture à chicanes</td><td>N’importe quel Les</td><td></td><td>déflecteurs favorisent des niveaux d’aération plus élevés. &nbsp ;</td></tr><tr><td>CHES</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP318-100</td><td>Tampon optimal utilisé pour la dégradation du paraoxon (pH > 8).</td></tr><tr><td>Paraoxon</td><td>Chem Service</td><td>N-12816</td><td>Substance très toxique à manipuler avec précaution et à éliminer correctement. &nbsp ;</td></tr><tr><td>Filtre à seringue 0,45 & micro ; m</td><td>Thermo Scientific</td><td>60183-221 (30 mm)</td><td>Le diamètre du filtre dépend du volume de l’échantillon. Une membrane à faible liaison protéique est essentielle.</td></tr><tr><td>Incubateur à agitateur</td><td>New Brunswick</td><td>Excella E24</td><td>Une température et un mélange précis sont essentiels pour une croissance bactérienne reproductible.</td></tr><tr><td>Centrifugeuse de culture Sorvall</td><td>Thermo Scientific</td><td>RC 5B PLUS</td><td>Centrifugeuse de culture de grand volume (500 ml) capable de 7 000 x g.</td></tr><tr><td>Ultracentrifugeuse Sorvall&nbsp ;</td><td>Thermo Scientific</td><td>WX Ultra 90</td><td>Capable d’utiliser des forces centrifuges &ge ; 150 000 x g.</td></tr><tr><td>Rotor d’ultracentrifugeuse</td><td>Thermo Scientific</td><td>AH-629</td><td>Assurez-vous que le rotor et les tubes appropriés sont utilisés et que tout est correctement équilibré.</td></tr><tr><td>Tubes ultracentrifuges ultra-transparents (25 x 89 mm)</td><td>Beckman Coulter</td><td>344058</td><td>Assurez-vous qu’il n’y a pas de fractures de stress avant l’utilisation et que les tubes sont parfaitement équilibrés.</td></tr><tr><td>Spectrophotomètre&nbsp ;</td><td>Tecan</td><td>Infinite M1000</td><td>Nécessaire pour les dosages cinétiques enzymatiques.</td></tr><tr><td>DLS/suivi des particules</td><td>NanoSight&nbsp ;</td><td>LM10</td><td>Nécessaire pour la distribution de la taille de l’OMV et la détermination de la concentration. &nbsp ;</td></tr><tr><td>BL21(DE3)</td><td>NEB</td><td></td><td>Souche d’expression bactérienne appropriée.</td></tr><tr><td>pET22</td><td>EMD Millipore</td><td>69744-3</td><td>D’autres plasmides peuvent être utilisés à la place de ceux-ci.&nbsp ; &nbsp ;</td></tr><tr><td>pACYC184</td><td>NEB</td><td></td><td>D’autres plasmides peuvent être utilisés à la place de ceux-ci.&nbsp ; &nbsp ;</td></tr><tr><td>Kit d’extraction de gel</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td>Exemple de kit.</td></tr></tbody></table>

réalisé conditionnement des protéines dans la membrane externe de vésicules<em&gt; escherichia coli</em&gt;: conception, production et purification

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

Un intérêt croissant pour l&#39;application des techniques de biologie synthétique pour programmer des vésicules de la membrane externe (OMV) conduisent à des applications très intéressantes et uniques pour OMV où nanoparticules traditionnelles se révèlent trop difficiles à synthétiser. A ce jour, toutes les bactéries à Gram négatif ont été montrés pour produire OMV démontrant l&#39;emballage d&#39;une variété de marchandises qui comprend des petites molécules, des peptides, des protéines et du matériel génétique. Sur la base de leur cargaison diverse, OMV sont impliqués dans de nombreux processus biologiques allant de la communication cellulaire pour le transfert de gènes et la fourniture de facteurs de virulence en fonction de laquelle les bactéries produisent le OMV. ont seulement récemment OMV bactérienne devenue accessible pour une utilisation dans un large éventail d&#39;applications à travers le développement des techniques de contrôle et de conditionnement direct de protéines recombinantes dans OMV. Ce protocole décrit un procédé pour la production, la purification et l&#39;utilisation de l&#39;enzyme conditionnée OMV permettant une meilleure overaproduction ll d&#39;enzyme recombinante, une augmentation de vésiculation, et amélioré la stabilité de l&#39;enzyme. l&#39;utilisation réussie de ce protocole va entraîner la création d&#39;une souche bactérienne qui produit simultanément une protéine recombinante et la dirige pour l&#39;encapsulation d&#39;OMV en créant une liaison entre la protéine synthétique et d&#39;une protéine recombinante d&#39;ancrage de la membrane externe. Ce protocole détaille également les méthodes pour isoler OMV à partir de cultures bactériennes ainsi que des techniques de manipulation appropriées et des choses à considérer lors de l&#39;adaptation de ce protocole d&#39;utilisation pour d&#39;autres applications uniques telles que: la livraison de médicaments pharmaceutiques, les diagnostics médicaux, et à l&#39;assainissement de l&#39;environnement.

L&#39;expression simultanée de deux protéines recombinantes, comme cela est nécessaire pour la stratégie d&#39;emballage OMV détaillée dans ce protocole, peut être accompli par un certain nombre de différentes avenues. Ici, un système à deux vecteur a été utilisé avec des origines de replication compatibles et cassettes de gènes inductibles séparés. Pour l&#39;expression de la SDT-SC construire un squelette de plasmide commercial (pACY184) a été modifié pour inclure une cassette de gène ...

Un protocole pour la production, la purification et l’utilisation de vésicules de membrane externe emballées d’enzymes (OMV) offrant une stabilité enzymatique améliorée pour une mise en œuvre dans diverses applications est présenté.

Réalisé Conditionnement des protéines dans la membrane externe de vésicules<em&gt; Escherichia coli</em&gt;: Conception, production et purification

An increasing interest in applying synthetic biology techniques to program outer membrane vesicles (OMV) are leading to some very interesting and unique ...

Le but global de cette procédure est de purifier et de caractériser des vésicules de la membrane externe bactérienne remplies d'enzymes, destinées à être utilisées comme réactifs catalytiques in vitro. Cette technique d'isolement enzymatique permet de récupérer les VMO bactériennes à partir de milieux de culture, puis de les utiliser pour réaliser une catalyse sans cellules d'un composé organophosphoré. L'encapsidation ciblée au sein des VMO bactériennes améliore considérablement la stabilité des enzymes dans diverses conditions de réaction et de stockage, contrairement aux techniques traditionnelles qui entraînent souvent une perte progressive et continue de l'activité enzymatique.Les implications de cette technique s'étendent à l'encapsulation de protéines ayant une pertinence dans plusieurs domaines, tels que le développement de thérapeutiques, la bioremédiation ou la conception de systèmes catalytiques dépourvus de cellules. Bien que ce protocole décrive la purification de vésicules membranaires externes (VME) à partir d'Escherichia coli, les techniques, moyennant des ajustements de la stratégie d'encapsulation, pourraient facilement être appliquées à la purification de VME à partir d'une variété de cultures microbiennes. Après avoir produit des vésicules membranaires externes (VME) chez des bactéries selon le protocole décrit, centrifuger le milieu de culture bactérien intact à 7 000 × g et à quatre degrés Celsius pendant 15 minutes.Retirer et conserver le surnageant, en prenant soin de ne pas perturber le culot cellulaire. Ensuite, effectuer une deuxième centrifugation du surnageant afin de s'assurer que toutes les bactéries ont été éliminées du milieu. Pour éliminer les agrégats protéiques et les éléments cellulaires de grande taille du milieu de culture conservé, prélever la solution à l’aide d’une seringue stérile de 10 à 50 millilitres.Fixez un filtre de 0,45 micron à l'extrémité du piston de la seringue. Ensuite, appuyez sur le piston et recueillez le filtrat dans un nouveau tube. Alternativement, filtrez sous vide le milieu de culture en le transférant vers un appareil de filtration stérile.Fixez l'appareil à une pompe à vide ou à un aspirateur de robinet afin de créer une aspiration. Transférez le milieu filtré dans un nouveau récipient. Pour isoler les VMO, transférez le milieu de culture filtré dans des tubes d'ultracentrifugation.Faire tourner le milieu à environ 150 000 ×g et à quatre degrés Celsius pendant trois heures à l’aide d’un rotor adapté aux tubes utilisés. Immédiatement après l’ultracentrifugation, afin d’éviter la perte de masse du culot, décanté le milieu de culture dépourvu de VMO du culot de VMO, de couleur légèrement brune, qui peut être visible ou non à l’œil nu. Le culot de VMO formé après l’ultracentrifugation peut être seulement faiblement adhérent au tube de centrifugation.Il convient de faire attention lors du décantation afin de s'assurer que le culot n'est pas délogé et perdu. Conserver le surnageant pour une diffusion dynamique de la lumière ultérieure afin de vérifier que les particules de VMO ont été complètement éliminées du milieu. Ajouter 0,5 à un millilitre de PBS stérile filtré, pH 7,4, ou un autre tampon filtré selon les besoins ou conditions expérimentaux, au culot et laisser incuber à température ambiante pendant 30 minutes.Ensuite, pipeter soigneusement la solution d'OMV purifiée en mélangeant délicatement pour s'assurer que tout le culot a été solubilisé. Pour déterminer la distribution de taille des OMV, ouvrir le logiciel de suivi de nano-particules par DLS correspondant à l'appareil utilisé. Allumer le microscope et nettoyer toutes les surfaces du microscope et de l'unité de suivi de nano-particules.À l’aide d’une seringue stérile d’un millilitre, ajouter environ 0,5 millilitre d’échantillon de VMO directement dans la fenêtre d’observation du dispositif de suivi des particules par le raccord inférieur, en prenant soin de couvrir entièrement la fenêtre d’observation sans introduire de bulles d’air dans le système. Placer l’unité de suivi des nanoparticules sur la platine du microscope et allumer le laser. Ensuite, cliquer sur Capturer dans le logiciel.Réglez la mise au point du microscope et du plateau afin de visualiser les particules sur l'écran de prévisualisation présent dans la fenêtre du logiciel. Ajustez l'obturateur de la caméra et le gain de la caméra jusqu'à ce que les particules brillantes soient clairement visibles sur un fond sombre. Réglez la durée d'acquisition à 60 secondes, puis cliquez sur Enregistrer.Lorsque vous y êtes invité, saisissez la température de l'appareil d'échantillonnage, étiquetez l'échantillon et enregistrez les données vidéo à la fin de chaque analyse dans un dossier désigné par l'utilisateur. Conservez tous les paramètres d'analyse en mode détection automatique et cliquez sur Traiter la séquence. Enregistrez la distribution de la taille des particules et leur concentration en particules par millilitre telles que déterminées par le logiciel.Pour déterminer la teneur en protéines des VMO, utiliser la SDS-PAGE et les immunotransferts pour évaluer la pureté des VMO, la production d'enzymes et l'efficacité du réticulation entre SpyCatcher ou SC et SpyTag ou ST. Il est impératif de confirmer l'expression des enzymes cibles et de la protéine d'ancrage. L'expression de protéines recombinantes peut souvent échouer pour diverses raisons, et la production réussie de protéines doit être confirmée avant la caractérisation des VMO.Pour réaliser un dosage de l'activité phosphotriestérase ou PTE, ajouter cinq microlitres d'une dilution au 1/1 000 de parathion dans du tampon CHES à cinq microlitres de VMO purifiées dans 90 microlitres de tampon CHES. Effectuer des mesures d'absorbance à 405 nanomètres et 348 nanomètres toutes les 20 secondes pendant environ deux heures de temps total de réaction afin de suivre l'évolution du produit de dégradation chromogène, le p-nitrophénol. Enfin, effectuer l'analyse des données conformément au protocole décrit dans le texte.Ci-dessous des exemples de la morphologie de VMO purifiées provenant d’E. coli, observée par MEB. Les VMO présentent une taille variant de 50 à 250 nanomètres, mesurée à l’aide d’un instrument de suivi particulaire. Ce graphique indique la concentration absolue des VMO.Lorsque l'OMP-A-ST en N terminal a été co-transformé avec la PTE-SC en présence d'arabinose et d'IPTG, une augmentation significative de la production de VMO a été observée par rapport aux échantillons témoins. Les électrophorèses SDS-PAGE et les immunotransferts présentés ici caractérisent davantage la teneur protéique des VMO ainsi que l'expression des protéines recombinantes OMP-A-ST, OMP-A native, PTE-SC et OMP-A-ST-PTE-SC. Sur cette figure, les niveaux d'expression totaux de la PTE et l'efficacité d'encapsidation dans les pastilles cellulaires, le surnageant UC et les pastilles purifiées de VMO UC ont été déterminés par des mesures de vitesse initiale utilisant le paraoxon comme substrat chromogène.Ici, le Triton X-100 a été utilisé pour vérifier la translocation du paraoxon à travers les bicouches intactes des VMO. Il n'y avait que peu de différence d'activité avec ou sans détergent, indiquant que le paraoxon traverse librement les pores endogènes présents sur la VMO. Enfin, comme observé dans cette expérience, les données cinétiques de la PTE-SC ont été ajustées à l'équation standard de cinétique enzymatique de Michaelis-Menten pour la protéine OMP-A-ST en fusion N-terminale co-transformée avec la PTE-SC en présence d'arabinose et d'IPTG, ainsi que pour la PTE-SC en présence d'activation par l'arabinose.Une fois tous les constructions génétiques réalisées et confirmées, l’encapsidation enzymatique et la purification des VMO peuvent être effectuées en deux jours. Un troisième jour est nécessaire pour confirmer et caractériser les VMO chaque fois qu’un nouveau construit est développé. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se rappeler de vérifier les classifications de sécurité de tous les matériaux et de l’équipement de centrifugation.En outre, il est important de vérifier la réussite de chaque étape avant de passer à la suivante. Les étapes de caractérisation décrites ici peuvent être complétées par d'autres méthodes afin de confirmer l'encapsulation de l'enzyme et la morphologie des VMO. La concentration en protéines, la teneur en lipides, la concentration en LPS, ainsi que de nombreuses autres propriétés, peuvent varier selon les charges utiles et les conditions de liaison, et pourraient influencer les applications ultérieures.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la purification et de la caractérisation des VMO chargées d'enzymes, ainsi que de la réalisation d'essais préliminaires pour évaluer l'activité des enzymes transportées. N'oubliez pas que le travail avec des bactéries et des réactifs chimiques peut être extrêmement dangereux, et que des précautions telles qu'une technique aseptique appropriée et l'utilisation d'équipements de protection individuelle doivent toujours être prises lors de cette procédure.

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De Constructs à cristaux - Vers Structure Détermination de β-cylindre externe protéines membranaires

La proline-proline endopeptidase-1 (PPEP-1) est une métalloprotéase sécrétée et une cible médicamenteuse prometteuse de l’agent pathogène humain Clostridium difficile. Nous décrivons ici toutes les méthodes nécessaires à la production et à la détermination de la structure de cette protéine.

Production, Cristallisation et structure Détermination de<em&gt; C. difficile</em&gt; PPEP-1 via Microseeding et Zinc-SAD

Nous décrivons une méthode pour la caractérisation des transporteurs de membrane proton-conduits dans les préparations de vésicule de membrane produites par l'expression hétérologue dans E. coli et lysis des cellules utilisant une presse Français.

Caractérisation des transporteurs de membrane par l'expression hétérologue dans E. coli et la production de vésicules membranaires

Ce protocole décrit la méthode, les matériaux, l’équipement et les étapes pour la préparation ascendante de l’ARN et des protéines produisant des cellules synthétiques. Le compartiment aqueux intérieur des cellules synthétiques contenait le lysate bactérien S30 encapsulé dans un bilayer lipidique (c.-à-d. liposomes stables), à l’aide d’une méthode de transfert d’émulsion d’émulsion de l’eau dans l’huile.

Préparation des cellules synthétiques produisant des protéines à l’aide d’extraits bactériens exempts de cellules, de liposomes et de transfert d’émulsion

À l’interface des solvants organiques et aqueux, les protéines amphiphiliques sur mesure de type élastine s’assemblent en structures supramoléculaires complexes telles que les vésicules, les fibres et les coacervates déclenchés par des paramètres environnementaux. Les protocoles d’assemblage décrits donnent des compartiments à base de membrane protéique (PMBCs) avec des propriétés de thon, permettant l’encapsulation de diverses cargaisons.

Assemblage dirigé des protéines elastin-like en structures supramoléculaires définies et encapsulation de fret in Vitro

Les bactéries sécrètent des vésicules extracellulaires (VE) de taille nanométrique transportant des molécules biologiques bioactives. La recherche sur les véhicules électriques se concentre sur la compréhension de leur biogenèse, de leur rôle dans les interactions microbes-microbes et hôte-microbe et des maladies, ainsi que de leurs applications thérapeutiques potentielles. Un flux de travail pour l’isolation évolutive des véhicules électriques de diverses bactéries est présenté pour faciliter...

Isolement et purification évolutifs de vésicules extracellulaires à partir d’Escherichia coli et d’autres bactéries

Le présent protocole décrit une méthode détaillée pour la production bactérienne de protéines recombinantes, y compris des protéines typiquement insolubles ou contenant des liaisons disulfures, emballées à l’intérieur de vésicules extracellulaires liées à la membrane. Cela a le potentiel d’être appliqué à des domaines polyvalents de la recherche scientifique, y compris la biotechnologie appliquée et la médecine.

Production et analyse optimisées de vésicules remplies de protéines recombinantes à partir d’E. coli

Découvrez le conditionnement d'enzymes dans des vésicules de membrane externe d'Escherichia coli pour améliorer leur stabilité. Cette méthode permet la catalyse cellulaire sans cellules et des applications thérapeutiques.

Réalisé Conditionnement des protéines dans la membrane externe de vésicules Escherichia coli: Conception, production et purification (Vidéo) | JoVE Journal

Réalisé Conditionnement des protéines dans la membrane externe de vésicules

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