Réalisé Conditionnement des protéines dans la membrane externe de vésicules Escherichia coli: Conception, production et purification

L’objectif global de cette procédure est de purifier et de caractériser des vésicules de membrane externe bactériennes remplies d’enzymes pour les utiliser comme réactifs catalytiques in vitro. Cette technique d’isolement enzymatique permet de récolter des OMV bactériens dans des milieux de culture, puis de les utiliser pour effectuer la catalyse acellulaire d’un composé organophosphoré. L’emballage dirigé dans les OMV bactériens améliore considérablement la stabilité des enzymes dans une gamme de conditions de réaction et de stockage, contrairement aux techniques traditionnelles qui entraînent souvent une perte progressive et continue de l’activité enzymatique.

Les implications de cette technique s’étendent à l’emballage de protéines pertinentes dans de multiples domaines, tels que le développement de thérapies, la remédiation ou le développement de systèmes catalytiques acellulaires. Bien que ce protocole détaille la purification des OMV d’E. coli, les techniques avec modification de la stratégie d’emballage pourraient facilement être utilisées pour la purification des OMV à partir d’une variété de cultures de cellules microbiennes. Après avoir généré des vésicules de membrane externe ou OMV dans les bactéries selon le protocole de texte, centrifugez le milieu de culture bactérienne intact à 7 000 fois G et quatre degrés Celsius pendant 15 minutes.

Retirez et conservez le surnageant, en prenant soin de ne pas déranger la pastille cellulaire. Ensuite, faites passer le surnageant à un deuxième tour pour vous assurer que toutes les bactéries sont éliminées du milieu. Pour éliminer les agrégats de protéines et le gros matériel cellulaire du milieu de culture enregistré, aspirez la solution dans une seringue stérile de 10 à 50 millilitres.

Fixez un filtre de 0,45 micron pour attirer l’extrémité de la seringue. Ensuite, appuyez sur le piston et récupérez le flux dans un nouveau tube. Vous pouvez également filtrer sous vide le milieu de culture en le transférant dans un appareil de filtration stérile.

Fixez l’appareil à une pompe à vide ou à un aspirateur d’évier pour générer une aspiration. Transférez le média filtré dans un nouveau récipient. Pour isoler les OMV, transférez le milieu de culture filtré dans des tubes d’ultracentrifugation.

Faites tourner le fluide à environ 150 000 fois G et quatre degrés Celsius pendant trois heures à l’aide d’un rotor correspondant aux tubes utilisés. Immédiatement après l’ultracentrifugation pour éviter la perte de masse des granulés, décantez le milieu de culture appauvri en OMV de la pastille OMV légèrement brune qui peut être visible ou non à l’œil nu. La pastille OMV formée après l’ultracentrifugation ne peut être que faiblement collée à la vésicule de centrifugation.

Des précautions doivent être prises lors de la décantation pour s’assurer que le granulé n’est pas délogé et perdu. Conservez le surnageant pour une diffusion dynamique ultérieure de la lumière afin de vérifier que les particules OMV étaient complètement épuisées du milieu. Ajoutez 0,5 à un millilitre de PBS filtré stérile, de PH 7,4 ou d’un autre tampon filtré déterminé par les besoins ou les conditions expérimentales, à la pastille et laissez-la incuber à température ambiante pendant 30 minutes.

Ensuite, pipetez soigneusement la solution OMV purifiée en mélangeant doucement pour vous assurer que la pastille entière a été solubilisée. Pour déterminer la distribution de la taille de l’OMV, ouvrez le logiciel de suivi des nanoparticules DLS de l’instrument utilisé. Allumez le microscope et nettoyez toutes les surfaces du microscope et de l’unité de suivi des nanoparticules.

À l’aide d’une seringue stérile d’un millilitre, ajoutez environ 0,5 millilitre d’échantillon OMV directement dans la fenêtre de visualisation du dispositif de suivi des particules par le raccord inférieur, en prenant soin de couvrir toute la fenêtre de visualisation sans injecter de bulles d’air dans le système. Placez l’unité de suivi des nanoparticules sur la platine du microscope et allumez le laser. Cliquez ensuite sur Capturer dans le logiciel.

Ajustez la mise au point et la platine du microscope pour visualiser les particules sur l’écran d’aperçu présent dans la fenêtre du logiciel. Ajustez l’obturateur et le gain de l’appareil photo jusqu’à ce que les particules lumineuses soient clairement visualisées sur un fond sombre. Ajustez la durée de capture à 60 secondes, puis cliquez sur Enregistrer.

Lorsque vous y êtes invité, entrez la température de l’appareil échantillon, étiquetez l’échantillon et enregistrez les données vidéo à la fin de chaque exécution dans un dossier désigné par l’utilisateur. Gardez tous les paramètres d’analyse en mode de détection automatique et cliquez sur Séquence de processus. Enregistrez la distribution granulométrique et la concentration des particules sous forme de particules par millilitre, telles que déterminées par le logiciel.

Pour déterminer la teneur en protéines OMV, utilisez SDS-PAGE et Western Blots pour évaluer la production d’enzymes de pureté OMV et l’efficacité de réticulation SpyCatcher ou SC vers SpyTag ou ST. Il est impératif de confirmer l’expression des enzymes cibles et de la protéine d’ancrage. L’expression des protéines recombinantes peut souvent être infructueuse pour diverses raisons, et la production réussie de protéines doit être confirmée avant la caractérisation de l’OMV.

Pour effectuer un dosage de l’activité de la phosphotriestérase ou de la PTE, ajoutez cinq microlitres d’une dilution de un à 1 000 de paraoxon dans un tampon CHES à cinq microlitres d’OMV purifiés dans 90 microlitres de CHES. Prenez des lectures d’absorbance à 405 nanomètres et 348 nanomètres toutes les 20 secondes pendant environ deux heures de temps de réaction total pour surveiller la progression du produit de dégradation chromogène du paraoxon p-nitrophénol. Enfin, effectuez l’analyse des données selon le protocole texte.

Voici des exemples de la morphologie des OMV purifiés d’E. coli via le MEB. La taille des OMV varie de 50 à 250 nanomètres, déterminée à l’aide d’instruments de suivi des particules. Ce graphique montre la concentration absolue d’OMV.

Lorsque l’OMP-A-ST terminal N a été co-transformé avec le PTE-SC en présence d’arabinose et d’IPTG, une augmentation significative de la production d’OMV a été observée par rapport aux échantillons témoins. Le SDS-PAGE et les Western Blots présentés ici caractérisent davantage la teneur en protéines OMV et l’expression de la protéine recombinante pour OMP-A-ST, OMP-A natif, PTE-sc et OMP-A-ST-PTE-SC. Dans cette figure, les niveaux globaux d’expression du PTE et l’efficacité de l’emballage de l’OMV dans les pastilles de cellules, le surnageant UC et les pastilles d’OMV UC purifiées ont été déterminés par des mesures initiales de vitesse en utilisant le paraoxon comme substrat chromogène.

Ici, Triton X-100 a été utilisé pour vérifier la translocation du paraoxon à travers des bicouches OMV intactes. Il y avait peu de différence d’activité avec ou sans détergent, ce qui indique que le paraoxon passe librement à travers les pores endogènes sur l’OMV. Enfin, comme on le voit dans cette expérience, les données cinétiques du PTE-SC sont ajustées à une équation cinétique enzymatique standard de Michaelis-Menten pour N terminal OMP-A-ST co-transformé avec le PTE-SC en présence d’un arabinose et l’IPTG et le PTE-SC en présence de l’activation de l’arabinose.

Une fois que toutes les constructions génétiques ont été faites et confirmées, l’emballage enzymatique et la purification de l’OMV peuvent être accomplis sur une période de deux jours. Un troisième jour est nécessaire pour confirmer et caractériser les OMV chaque fois qu’une nouvelle construction est développée. Lors de cette procédure, il est important de ne pas oublier de vérifier les cotes de sécurité de tous les matériaux et équipements de centrifugation.

De plus, il est important de vérifier le succès de chaque étape avant de passer à la suivante. Les étapes de caractérisation décrites ici peuvent être complétées par d’autres pour confirmer l’emballage enzymatique et la morphologie de l’OMV. La concentration en protéines, la teneur en lipides, la concentration en LPS et de nombreuses autres propriétés peuvent varier en fonction des charges utiles et des conditions d’adduction et peuvent influencer les applications en aval.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de purifier et de caractériser les OMV remplis d’enzymes, ainsi que d’effectuer des tests préliminaires pour évaluer l’activité de la cargaison d’enzymes. N’oubliez pas que travailler avec des bactéries et des réactifs chimiques peut être extrêmement dangereux et que des précautions telles qu’une technique aseptique appropriée et un équipement de protection individuelle doivent toujours être utilisées lors de l’exécution de cette procédure.