Name: Préparation et livraison de microcristaux de protéines dans la phase lipidique cubique pour Serial femtoseconde Cristallographie (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-20T08:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 9 s
Description: Apprenez la préparation de microcristaux de protéines membranaires en phase lipidique cubique pour la cristallographie sérielle. Cette méthode réduit la consommation d'échantillon et minimise les dommages par radiation lors de l'analyse structurale.

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Ce travail a été soutenu par les National Institutes of Health accorde R01 GM108635 et U54 GM094618, Mayo Clinic-ASU Seed Collaborative Award Grant et NSF STC prix 1231306. Nous remercions A. Walker pour l&#39;assistance à la préparation du manuscrit.

1. Solutions de filtrage et Lipids Remarque: Tous les réactifs et les outils utilisés dans ce protocole doivent être aussi propre que possible afin d&#39;éviter l&#39;introduction de contaminants particulaires dans les échantillons, qui peuvent obstruer l&#39;injecteur de LCP. <ol><li> Filtrez toutes les solutions de précipitants et de lipides fondus à travers des filtres de spin-down 5 um. seringues Laver soigneusement et appliquer l&#39;air comprimé pour sécher. En option, utiliser un portable en salle blanche hotte pour empêcher le piégeage des particules de poussière ou de fibres au cours des procédures de préparation des échantillons. </li></ol> 2. Reconstitution de MP dans LCP Remarque: Le choix de la meilleure lipidique LCP hôte pour la cristallisation dépend de la cible MP, et est généralement identifié au cours de lipides hôte des essais de dépistage de cristallisation 14. Monoacylglycerols (MAGs) représentent la classe la plus courante de lipides utilisés pour LCP cristallisation 15. Les protocoles sont basés sur l&#39;utilisation de 9,9 MAG (monooléine) commeaccueillir des lipides, puisque c&#39;est le lipide le plus de succès dans méso cristallisation à ce jour 16. 9.9 MAG peut être remplacé par d&#39;autres lipides LCP hôtes ou des mélanges de lipides après prise en compte des différences dans leur comportement de phase. Par exemple, dans le cas des RCPG, la monooléine est généralement dopé avec du cholestérol pour la stabilisation du récepteur. Ici, utilisez 9: 1 (p / p) 9.9 MAG: mélange de cholestérol comme le lipide hôte. <ol><li> Composition cible MP, qui est purifiée dans une solution micellaire détergent, avec le lipide LCP hôte appropriée en utilisant deux seringues (# 1 et # 2) et un agent de couplage, 13 tel que décrit précédemment. </li><li> En bref, la seringue de charge # 1 avec le lipide fondu et la seringue n ° 2 avec la solution MP. Utiliser un rapport entre le lipide et une solution de MP aqueuse qui correspond au niveau qui est juste en dessous de la capacité d&#39;hydratation maximale du lipide hôte LCP correspondant, par exemple 3: 2 v / v lipide solution / MP 9,9 MAG, 1: 1 v / v solution / MP lipidique pour la plupart des autres mags chaîne plus courte (7,9 MAG, 9.7 MAG, etc.). </li><li> Relier les seringues par l&#39;intermédiaire d&#39;un coupleur de seringue et commencer à mélanger les substances en appuyant sur les poussoirs pour déplacer le mélange va-et-vient entre les seringues, jusqu&#39;à ce que l&#39;échantillon est homogène et transparent. Préparer environ 50 pi de l&#39;échantillon de LCP pour la collecte d&#39;un ensemble complet de données par LCP-SFX. Le volume de l&#39;échantillon final sera généralement augmenter d&#39;environ un facteur de deux (à ~ 100 pi) après la consolidation de l&#39;échantillon et le titrage des lipides (section 5). </li></ol> 3. Mise en place Cristallisation dans Seringues <ol><li> Après un LCP transparent et homogène est formé, déplacer l&#39;ensemble de l&#39;échantillon dans la seringue n ° 2. Détacher seringue n ° 1, tout en maintenant le coupleur relié à la seringue n ° 2. </li><li> Branchez une aiguille amovible (de 26s de jauge) à un autre 100 pi seringue propre (seringue n ° 3) et aspirés environ 70 pi de la solution de précipitant dedans. La composition de la solution de précipitant qui déclenche formation de microcristaux à haute densité est unique pour chaque cible MP et doit être déterminé avant de procéder à ces protocoles. Ici, en utilisant une composition de solution de précipitation optimale qui donne des douches de microcristaux du récepteur A 2A (thiocyanate de sodium 40 mM, 100 mM , citrate de sodium , pH 5, 26 à 28% de PEG400). </li><li> Débranchez l&#39;aiguille de la seringue # 3 tout en gardant la virole en téflon dans la seringue. </li><li> Connecter les seringues # 2 et # 3 à travers le coupleur, en vous assurant que viroles téflon sont bien en place dans les deux seringues. Vissez soigneusement le coupleur étroitement en position. </li><li> Orientez les seringues couplées verticalement avec la seringue n ° 2 sur le fond et injecter le LCP échantillon de protéines chargées de la seringue n ° 2 dans la seringue # 3 lentement et régulièrement jusqu&#39;à ce que la chaîne de LCP touche le piston de la seringue 3 #. Le volume injecté LCP équivaudra à environ 1/10 du volume initial dans précipitants seringue n ° 3 (~ 7 ul). Vérifier le volume par l&#39;échelle de lecture sur les deux Syringes (les deux plongeurs doivent se déplacer d&#39;environ 7 pi). </li><li> seringue Déconnecter # 2. Le coupleur maintenant est seulement connecté à la seringue n ° 3 qui contient l&#39;échantillon immergé dans la solution de précipitant. </li><li> Utiliser Parafilm pour sceller complètement la seringue n ° 3, y compris l&#39;interface de piston de seringue, l&#39;extrémité d&#39;ouverture de l&#39;accouplement et l&#39;écrou d&#39;aiguille. étanchéité incomplète lors de cette étape peut entraîner des conditions précipitants pour changer et l&#39;échantillon à déshydrater. </li><li> Répétez les étapes 3,3-3,7 pour mettre en place la cristallisation dans 6 seringues supplémentaires (# 4- # 9) en utilisant un total de ~ 50 pi de l&#39;échantillon de LCP (~ 7 pi de LCP par chaque seringue). </li><li> Magasin scellé seringues dans un sac refermable en plastique avec un ou deux tissus de nettoyage sans fibres pré-imprégnés de l&#39;eau pour se protéger contre la déshydratation échantillon. Sceller le sac et stocker les seringues dans un incubateur à 20 ° pendant la croissance du cristal. </li></ol> 4. Détection de cristal <ol><li> Retirer les seringues de l&#39;incubateur à l&#39;image de la LCP échantillons directement à l&#39;intérieur des seringues (# 3- # 9) toutes les 12-24 heures sous un stéréomicroscope avec de la lumière polarisée croisée. Identifier les cristaux sous forme de particules brillantes serrées ou, dans le cas d&#39;une plus petite taille de cristal comme une lumière uniforme du filament LCP. </li><li> Remettre les seringues scellées dans le sac, et stocker à 20 ° C pour une utilisation future. </li></ol> 5. Consolidation de l&#39;échantillon et Titration avec 7,9 MAG Remarque: L&#39;étape lipidique de titrage décrit ici sert à deux fins: a) pour absorber la solution de précipitation en excès et b) pour empêcher le gel des lipides lors de l&#39;injection dans le faisceau de XFEL. Lorsqu&#39;un échantillon de LCP composé de 9,9 MAG est injecté dans une chambre à vide pour la collecte des données, l&#39;évaporation intensive peut refroidir l&#39;échantillon jusqu&#39;à des températures inférieures à la température de transition de phase d&#39;équilibre (~ 18 ° C), la conversion de parties de l&#39;échantillon en une phase cristalline lamellaire (Lc). Ces patchs de la phase Lc, lorsqu&#39;il est frappé par le faisceau, produisent intense poudre Diffrl&#39; action des anneaux qui peuvent endommager un détecteur sensible à 6, tels que le détecteur de matrice de pixels Cornell SLAC (CSPAD). Titrage de l&#39;échantillon de 9,9 MAG avec un lipide à chaîne courte (MAG 9,7 ou 7,9 MAG) permet de résoudre ce problème, car ces mélanges ont des températures de transition de phase inférieure. Ici, nous décrivons le titrage d&#39;un LCP composé de 9,9 MAG avec un MAG 7.9. Lorsque mags chaîne plus courte (9,7 MAG, 7,9 MAG, etc.) sont utilisés pour la cristallisation ou lorsque les données série de cristallographie sont recueillies à la pression ambiante du titrage à l&#39; étape 5.11 est toujours nécessaire, mais elle peut être effectuée en utilisant le lipide LCP hôte d&#39; origine utilisé pour cristallisation. <ol><li> Environ 1 h avant le début de la collecte de données, supprimer des seringues avec des échantillons de 20 ° C incubateur. </li><li> Sélectionnez 2-4 seringues pour la consolidation de l&#39;échantillon basé sur une apparence cristalline similaire et la similitude des conditions de cristallisation. </li><li> Retirez délicatement le Parafilm d&#39;étanchéité des seringues sélectionnés. </li><li> Retirerle coupleur de la seringue et fixer une aiguille amovible propre (de 26s de jauge) à la première seringue sélectionnée. Doucement et lentement pousser le piston vers l&#39;avant de presser le précipitant à travers l&#39;aiguille dans un tube à centrifuger. Il faut être prudent à cette étape, car l&#39;application d&#39;une forte pression sur le piston dans cette étape peut éjecter une partie du cristal LCP chargé avec la solution de précipitation, conduisant à une perte partielle ou complète de l&#39;échantillon. </li><li> Arrêtez le plongeur lorsque la plupart des précipitants a été retiré et le LCP a accumulé à l&#39;entrée de l&#39;aiguille. </li><li> Répétez l&#39;étape 5,4-5,5 avec les autres seringues sélectionnées. </li><li> Pour consolider les échantillons LCP résultants, relier deux seringues ensemble à travers un coupleur propre. </li><li> Appuyer sur le piston sur une seringue pour transférer l&#39;ensemble de l&#39;échantillon de l&#39;un des seringues à l&#39;autre. </li><li> Déconnecter la seringue vide. </li><li> Répétez les étapes 5,7-5,9 pour consolider l&#39;ensemble du matériau de LCP chargé de cristal de deux à quatre préseringues Sélectionnée: dans une seringue. Retirez autant de précipitation que possible. </li><li> Ajouter ~ 5 pi de 7,9 MAG ou la plus courte chaîne lipidique d&#39;origine MAG hôte d&#39;une seringue vide. Branchez cette seringue à la seringue avec l&#39;échantillon consolidé par un coupleur de seringue et mélanger alternativement déprimant pistons de seringue. Répétez jusqu&#39;à ce que toute solution résiduelle est absorbée et un LCP homogène et transparente est formée. La quantité finale de LCP après titrage peut varier de 20 à 35 ul en fonction du volume de l&#39;excès d&#39;agent de précipitation et de sa composition. </li><li> Déplacer l&#39;ensemble de l&#39;échantillon de LCP mélangé dans une seringue et déconnecter la seringue vide. </li></ol> 6. Caractérisation des microcristaux <ol><li> Fixer une aiguille LCP-injecteur chargement (style de point 3, jauge 22, un pouce de longueur) à la seringue avec l&#39;échantillon consolidé. </li><li> éjecter soigneusement ~ 1 pl de l&#39;échantillon de LCP sur une lame de verre et couvrir avec une lamelle de verre. Appuyez doucement sur lalamelle à prendre en sandwich l&#39;échantillon. </li><li> Prenez des images de l&#39;échantillon de LCP sous un microscope stéréo au grossissement le plus élevé possible (typiquement 100X) en utilisant un éclairage sur fond clair et polariseurs croisés. Si possible, prendre des images supplémentaires à l&#39; aide d&#39; un microscope UV-fluorescence et un SONICC (Second Ordre Nonlinear Imagerie des cristaux chiraux) 17 imageur pour confirmer l&#39;existence de microcristaux de protéines dans l&#39;échantillon. </li><li> Estimer la taille des cristaux et de la densité 10. La densité cristalline idéale pour une expérience de la collecte de données dépend de la taille des cristaux, le diamètre du faisceau de rayons X et le diamètre du courant de LCP, et devrait se traduire par un taux de succès de cristaux d&#39;environ 10 à 40%. </li></ol> 7. Réglage de Crystal Densité Remarque: Si la densité cristalline trouvée dans l&#39;étape 6.4 est trop élevé, ce qui entraîne un grand pourcentage de multiples coups de cristal, les cristaux doivent être dilués suivant les étapes décrites ci-dessous pour optimiser laéchantillon pour la collecte de données. Si la densité cristalline est trop faible pour la collecte de données efficace dans tous les échantillons préparés, les conditions de croissance des cristaux doivent être ré-optimisé, car il n&#39;y a pas de méthode fiable pour la concentration de MP cristaux dans LCP. <ol><li> Préparer la quantité nécessaire de LCP propre à être utilisé pour la dilution en mimant la composition de LCP (même des lipides et précipitation) de l&#39;échantillon initial avec des cristaux qui doit être dilué. </li><li> Déplacer tout LCP pur dans une seringue. Détachez seringue vide, mais laisser le coupleur connecté. </li><li> Retirez l&#39;aiguille de la seringue qui contient l&#39;échantillon de LCP avec microcristaux. Connecter l&#39;échantillon seringue à la seringue contenant LCP propre à travers le coupleur. </li><li> Mélanger le contenu des seringues en le poussant en arrière et en avant à travers le coupleur jusqu&#39;à ce qu&#39;une homogénéité soit obtenue. </li><li> Répétez la section 6 de réévaluer la densité de microcristaux dans l&#39;échantillon ajusté. </li></ol> 8. LCP Injector Loading unnd LCP-SFX Data Collection <ol><li> Déconnecter le coupleur de la seringue avec l&#39;échantillon et fixer une aiguille 1 &quot;chargement à la seringue. </li><li> Transférer 20-40 ul de l&#39;échantillon dans le réservoir d&#39;un injecteur LCP. </li><li> Insérez l&#39;injecteur de LCP dans la chambre d&#39;échantillon 18, commencer l&#39;injecteur, régler le débit et la collecte de données LCP-SFX. </li></ol> 9. Incorporation de Soluble Cristaux de protéines dans LCP Remarque: L&#39;utilisation des milieux très visqueux, comme LCP, pour la livraison de cristaux de protéines solubles permet de diminuer considérablement la consommation de protéines dans une expérience de cristallographie série. Dans ces étapes, nous décrivons comment incorporer des cristaux de protéines solubles dans les LCP. Les cristaux peuvent être obtenus par toute technique, consolidée ensemble sous la forme d&#39;une suspension de cristaux et on le filtre si nécessaire. <ol><li> Ajuster la densité cristalline en suspension pour assurer des taux d&#39;environ 10-40% de cristal de succès. </li><li> Tis la compatibilité de la solution avec précipitants LCP utilisant 7,9 MAG, MAG 9.7 ou d&#39;un mélange 1: 1 de 7,9 et 9,9 MAG MAG comme lipide hôte. </li><li> Mélanger ~ 25 ul de la suspension de cristaux avec ~ 25 ul du lipide hôte à l&#39;aide d&#39;un mélangeur à seringue jusqu&#39;à ce qu&#39;une LCP homogènes. </li><li> Évaluer la taille des cristaux et de la densité, comme décrit dans la section 6. Chargez l&#39;échantillon dans l&#39;injecteur de LCP et recueillir des données comme décrit dans la section 8. </li></ol>

<ol><li>Cherezov, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+crystal+structure+of+an+engineered+human+beta2-adrenergic+G+protein-coupled+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">High-resolution crystal structure of an engineered human beta2-adrenergic G protein-coupled receptor.</a> Science. 318 (5854), 1258-1265 (2007).</li>
<li>Cherezov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipidic+cubic+phase+technologies+for+membrane+protein+structural+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Struc+Biol%22%5BJournal%5D)">Lipidic cubic phase technologies for membrane protein structural studies.</a> Curr Opin Struc Biol. 21 (4), 559-566 (2011).</li>
<li>Chapman, H. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Femtosecond+X-ray+protein+nanocrystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Femtosecond X-ray protein nanocrystallography.</a> Nature. 470 (7332), 73-77 (2011).</li>
<li>Neutze, R., Wouts, R., van der Spoel, D., Weckert, E., Hajdu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+for+biomolecular+imaging+with+femtosecond+X-ray+pulses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Potential for biomolecular imaging with femtosecond X-ray pulses.</a> Nature. 406 (6797), 752-757 (2000).</li>
<li>DePonte, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gas+dynamic+virtual+nozzle+for+generation+of+microscopic+droplet+streams%5BTitle%5D)+AND+%22J+Phys+D+Appl+Phys%22%5BJournal%5D)">Gas dynamic virtual nozzle for generation of microscopic droplet streams.</a> J Phys D Appl Phys. 41 (19), 195505(2008).</li>
<li>Weierstall, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipidic+cubic+phase+injector+facilitates+membrane+protein+serial+femtosecond+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Lipidic cubic phase injector facilitates membrane protein serial femtosecond crystallography.</a> Nat Commun. 5, 3309(2014).</li>
<li>Fenalti, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+bifunctional+peptide+recognition+at+human+%CE%B4-opioid+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Strcut+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Structural basis for bifunctional peptide recognition at human δ-opioid receptor.</a> Nat Strcut Mol Biol. 22 (3), 265-268 (2015).</li>
<li>Liu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+femtosecond+crystallography+of+G+protein-coupled+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Serial femtosecond crystallography of G protein-coupled receptors.</a> Science. 342 (6165), 1521-1524 (2013).</li>
<li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+Angiotensin+Receptor+Revealed+by+Serial+Femtosecond+Crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Structure of the Angiotensin Receptor Revealed by Serial Femtosecond Crystallography.</a> Cell. 161 (4), 833-844 (2015).</li>
<li>Liu, W., Ishchenko, A., Cherezov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+microcrystals+in+lipidic+cubic+phase+for+serial+femtosecond+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Preparation of microcrystals in lipidic cubic phase for serial femtosecond crystallography.</a> Nat Protoc. 9 (9), 2123-2134 (2014).</li>
<li>Liu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+allosteric+regulation+of+GPCRs+by+sodium+ions%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structural basis for allosteric regulation of GPCRs by sodium ions.</a> Science. 337 (6091), 232-236 (2012).</li>
<li>Caffrey, M., Cherezov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystallizing+membrane+proteins+using+lipidic+mesophases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Crystallizing membrane proteins using lipidic mesophases.</a> Nat Protoc. 4 (5), 706-731 (2009).</li>
<li>Liu, W., Cherezov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystallization+of+membrane+proteins+in+lipidic+mesophases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Crystallization of membrane proteins in lipidic mesophases.</a> J Vis Exp. (49), (2011).</li>
<li>Li, D., Shah, S. T. A., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+Lipid+and+Temperature+as+Important+Screening+Variables+for+Crystallizing+Integral+Membrane+Proteins+in+Lipidic+Mesophases.+Trials+with+Diacylglycerol+Kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Cryst+Growth+Des%22%5BJournal%5D)">Host Lipid and Temperature as Important Screening Variables for Crystallizing Integral Membrane Proteins in Lipidic Mesophases. Trials with Diacylglycerol Kinase.</a> Cryst Growth Des. 13 (7), 2846-2857 (2013).</li>
<li>Caffrey, M., Lyons, J., Smyth, T., Hart, D. J. Monoacylglycerols: The Workhorse Lipids for Crystallizing Membrane Proteins in Mesophases. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCaffrey%2C+M+%22Current+Topics+in+Membranes%22">Current Topics in Membranes</a>. 63, Elsevier. (2009).</li>
<li>Kulkarni, C. V., Wachter, W., Iglesias-Salto, G., Engelskirchen, S., Ahualli, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoolein%3A+a+magic+lipid%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Phys+Chem+Chem+Phys%22%5BJournal%5D)">Monoolein: a magic lipid?</a> Phys Chem Chem Phys. 13 (8), 3004-3021 (2011).</li>
<li>Kissick, D. J., Gualtieri, E. J., Simpson, G. J., Cherezov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonlinear+optical+imaging+of+integral+membrane+protein+crystals+in+lipidic+mesophases%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Nonlinear optical imaging of integral membrane protein crystals in lipidic mesophases.</a> Anal Chem. 82 (2), 491-497 (2010).</li>
<li>James, D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJames%2C+D+%22Injection+Methods+and+Instrumentation+for+Serial+X-ray+Free+Electron+Laser+Experiments%22">Injection Methods and Instrumentation for Serial X-ray Free Electron Laser Experiments</a>. , Arizona State University. 1-126 (2015).</li>
<li>Kang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+rhodopsin+bound+to+arrestin+by+femtosecond+X-ray+laser%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of rhodopsin bound to arrestin by femtosecond X-ray laser.</a> Nature. 523 (7562), 561-567 (2015).</li>
<li>Rasmussen, S. G. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+the+%CE%B22+adrenergic+receptor-Gs+protein+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of the β2 adrenergic receptor-Gs protein complex.</a> Nature. 477 (7366), 549-555 (2011).</li>
<li>Fromme, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+femtosecond+crystallography+of+soluble+proteins+in+lipidic+cubic+phase%5BTitle%5D)+AND+%22IUCrJ%22%5BJournal%5D)">Serial femtosecond crystallography of soluble proteins in lipidic cubic phase.</a> IUCrJ. 2 (Pt 5), 545-551 (2015).</li>
<li>Sugahara, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Grease+matrix+as+a+versatile+carrier+of+proteins+for+serial+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Meth%22%5BJournal%5D)">Grease matrix as a versatile carrier of proteins for serial crystallography.</a> Nat Meth. 12 (1), 61-63 (2014).</li>
<li>Conrad, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+inert+crystal+delivery+medium+for+serial+femtosecond+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22IUCrJ%22%5BJournal%5D)">A novel inert crystal delivery medium for serial femtosecond crystallography.</a> IUCrJ. 2 (Pt 4), 421-430 (2015).</li>
<li>Botha, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Room-temperature+serial+crystallography+at+synchrotron+X-ray+sources+using+slowly+flowing+free-standing+high-viscosity+microstreams%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+Sct+D%22%5BJournal%5D)">Room-temperature serial crystallography at synchrotron X-ray sources using slowly flowing free-standing high-viscosity microstreams.</a> Acta Crystallogr Sct D. 71 (Pt 2), 387-397 (2015).</li>
<li>Nogly, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipidic+cubic+phase+serial+millisecond+crystallography+using+synchrotron+radiation%5BTitle%5D)+AND+%22IUCrJ%22%5BJournal%5D)">Lipidic cubic phase serial millisecond crystallography using synchrotron radiation.</a> IUCrJ. 2, 168-176 (2015).</li>
<li>Tenboer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-resolved+serial+crystallography+captures+high-resolution+intermediates+of+photoactive+yellow+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Time-resolved serial crystallography captures high-resolution intermediates of photoactive yellow protein.</a> Science. 346 (6214), 1242-1246 (2014).</li>
<li>Kupitz, C., Basu, S., Grotjohann, I., Fromme, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+time-resolved+crystallography+of+photosystem+II+using+a+femtosecond+X-ray+laser%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Serial time-resolved crystallography of photosystem II using a femtosecond X-ray laser.</a> Nature. 513, 261-265 (2014).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Les protocoles décrits ici fournissent un aperçu général de la procédure de préparation des échantillons pour une expérience type LCP-SFX avec un injecteur de LCP. Sur la base de notre expérience, le montant total de l&#39;échantillon final LCP microcristaux-charge requis pour recueillir un ensemble de données complet est typiquement 50-100 pi (tableau 1; 25-50 pi d&#39;échantillon initial de LCP protéines en charge), en fonction de la taille des microcristaux , de la qualité et de la densité. Puisque chaque pi seringue en verre 100 étanche aux gaz peut accueillir environ 7 pi de LCP sous la forme d&#39;une chaîne entièrement déployée pour assurer la bonne et même la diffusion de la solution de précipitation dans le LCP, au moins quatre à sept échantillons dans les seringues doivent être préparés pour chaque expérience LCP-SFX. Comme l&#39;échantillon est extrudé à travers une étroite 20-50 um de diamètre capillaire, il est essentiel d&#39;éviter toute matière particulaire étrangère dans l&#39;échantillon. Poussières et fibres qui pourraient être parfois introduites dans le LCPsolutions d&#39;échantillon ou précipitants peuvent obstruer le capillaire d&#39;injection et d&#39;augmenter le temps d&#39;arrêt au cours de l&#39;expérience. Par conséquent, il est important de filtrer les lipides et toutes les solutions à travers un filtre à pores de 5 um avant la préparation des échantillons. En option, une salle blanche ou une chambre propre hotte portable peut être utilisé pour la préparation des échantillons. Ces protocoles sont basés sur l&#39;utilisation de 9,9 MAG (monooléine) comme lipide hôte pour MP cristallisation. Cependant, ils ne sont pas limités à 9,9 MAG et peuvent être facilement adaptés à d&#39;autres lipides LCP hôtes ou des mélanges de lipides après prise en compte des différences dans le comportement de phase lipidique. La plupart des structures des députés cristallisées en LCP ont été obtenus en utilisant l&#39; un des magazines, avec 9,9 MAG étant le représentant le plus réussi à ce jour 15. Le principal inconvénient de l&#39;utilisation de 9,9 MAG SFX est sa transition vers la phase lamellaire cristal lors du refroidissement en dessous de 18 ° C, ce qui se produit souvent lors de l&#39;acquisition des données est effectuée sous vide. Le titratiavec 7.9 MAG décrit à la section 5 de ce protocole fournit une bonne solution à ce problème. Dans notre expérience, les cristaux résistent un tel titrage sans aucun effet indésirable. Si, par contre, l&#39;addition de 7,9 MAG ou d&#39;une autre MAG à chaîne courte est pas souhaitable, le titrage peut être effectué avec 9,9 MAG. Dans ce cas, le gaz qui stabilise l&#39;écoulement de LCP lors de l&#39;injection dans le vide doit être commuté de l&#39;hélium à l&#39;azote, ce qui peut empêcher la formation d&#39;une phase lipidique cristalline dans la plupart des échantillons, au détriment d&#39;avoir un flux d&#39;échantillon moins stable. La consistance de gel de LCP a un grand avantage pour une utilisation en tant que milieu de support de cristal, car il permet de régler le débit de cristal dans une large gamme, adaptée à la collecte de données de cristallographie série à des sources de XFEL et synchrotrons modernes. Adaptation du débit de cristal avec les impulsions de XFEL résultats de taux de répétition dans la réduction spectaculaire de la consommation de cristal par des ordres de grandeur car rapport à l&#39;injection de liquide. LCP est un milieu de support convenable pour l&#39; administration non seulement des cristaux cultivés en MP, mais aussi pour les cristaux de protéines solubles 21. Plusieurs milieux de support de cristal visqueux alternatifs ont été introduits récemment 22 - 24, étendant l&#39;arsenal d&#39;outils et de réactifs pour la réalisation d&#39; expériences série de cristallographie. En outre, la cristallographie série avec LCP comme moyen de livraison de cristal a été démontrée à des sources de synchrotron classiques, au moins pour les cristaux bien-diffractant 24,25. Les mises à jour des sources de rayonnement synchrotron qui stimulent l&#39;intensité des rayons X par les ordres de grandeur, ainsi que des améliorations dans les technologies de détection, feront la cristallographie série une méthode encore plus accessible et attrayant pour la détermination de la structure. LCP-SFX a démontré sa puissance pour MP détermination de la structure. Pour les systèmes biologiques complexes (tels que les RCPG ou complexes macromoléculaires) où large, cristaux Diffraction qualité sont difficiles à cultiver, LCP-SFX peut fournir un attrayant, sinon la seule option viable pour résoudre une structure de résolution atomique. Avec tous ses avantages, à savoir, en utilisant LCP comme matrice pour MP cristallisation et la livraison de cristal, une faible consommation de protéines, l&#39; absence de dégâts d&#39;irradiation, la collecte de données de la température ambiante, les possibilités d&#39;études résolues en temps 26,27 et aucune exigence de cristal de récolte, LCP- SFX devrait jouer un rôle important dans l&#39;avenir de la biologie structurale.

cristallographie aux rayons X est la technique la plus réussie à ce jour pour résoudre des structures atomiques de résolution des protéines membranaires (PM). Cristallisation de mésophases lipidiques, aussi connu comme phase cubique lipidique (LCP), ou en méso cristallisation, représente l&#39; un des principaux développements en MP cristallographie qui a permis à la détermination de la structure à haute résolution des objectifs ambitieux tels que G récepteurs couplés aux protéines (RCPG ) 1. Les récents progrès dans les outils et les technologies LCP ont fait de cette technique disponible pour une grande communauté de biologistes structurels à travers le monde 2. Cependant, dans de nombreux cas , les cristaux MP qui se forment dans LCP sont trop petits pour être utilisés même à la plus avancée beamlines microfocus synchrotron, où les échantillons souffrent de dégâts d&#39;irradiation sévère et la détérioration avant un signal suffisant à haute résolution peut être obtenue 3. Une nouvelle approche de la collecte de données cristallographiquea permis à la mise en service du laser à électrons libres du premier rayon X (XFEL). La méthode est basée sur le principe de &quot;diffraction avant la destruction&quot;, d&#39; abord introduit théoriquement 4, puis confirmée expérimentalement sur ​​des échantillons biologiques au Coherent Source de lumière Linac (LCLS) 3, le pionnier mondial dans le XFEL dur. Un XFEL génère haute luminosité impulsions de rayons X dans les quelques dizaines de durée femtoseconde qui diffractent d&#39;un cristal vierge avant que les atomes de protéines peuvent se déplacer en réponse aux dégâts d&#39;irradiation. Dans les premières expériences, des microcristaux ont été alimentés en continu jusqu&#39;à l&#39;intersection avec le faisceau de XFEL dans un courant aqueux produit par un injecteur 5 liquide. Ce dispositif expérimental est connu comme la cristallographie femtoseconde série (SFX). Le principal inconvénient de l&#39;utilisation des injecteurs de liquide pour SFX est leur débit élevé, ce qui nécessite par conséquent des dizaines à des centaines de milligrammes de protéine purifiée pour la collecte d&#39;un ensemble complet de données. Par employing un injecteur spécial qui peut gérer les échantillons de LCP gel-like (injecteur de microextrusion LCP) 6, nous avons livré avec succès microcristaux de plusieurs GPCR humains différents cultivés dans une matrice de LCP et obtenu leurs structures à haute résolution 6-9, avec une protéine significativement réduite la consommation à moins de 0,3 mg par ensemble de données. L&#39;injecteur se compose d&#39;un réservoir qui peut contenir jusqu&#39;à 20, 40 ou 100 ul de cristal chargé LCP et un capillaire étroit (10-50 um de diamètre) à travers lequel l&#39;échantillon est extrudé par l&#39;application d&#39;une pression élevée (jusqu&#39;à 10 000 livres par pouce carré) à partir d&#39;un piston hydraulique à un étage de pression amplifiée, entraîné par un liquide à partir d&#39;une HPLC (Chromatographie en phase liquide à haute performance), la pompe. Le courant de LCP sortant de la buse capillaire est stabilisée par un écoulement parallèle de gaz non réactif (typiquement de l&#39;hélium ou l&#39;azote). Ici, nous fournissons des démonstrations visuelles des étapes nécessaires pour préparer et caractériser des échantillonspour une expérience LCP-SFX. Des détails supplémentaires peuvent être trouvés dans les protocoles publiés 10. A titre d&#39;exemple, nous allons utiliser l&#39; adénosine A récepteur 2A 11 et de préparer des cristaux de cette protéine dans LCP pour la collecte de données X-ray en utilisant l&#39; approche SFX. Bien que nos protocoles sont compatibles avec tout injecteur capable de flux LCP pour la collecte de données par cristallographie série à des sources XFEL et synchrotron, à des fins d&#39;illustration, nous allons utiliser l&#39;injecteur de LCP décrit dans Réf. 6. Conditions de précipitants optimisées qui produisent des microcristaux à haute densité LCP doivent être identifiés par criblage à haut débit de cristallisation 12,13 avant de passer à ce protocole. Un diagramme typique de ce protocole est représenté sur la figure 1.

<table><tbody><tr><td>monooléine lipidique de l’hôte LCP (9,9 MAG)</td><td>Nu Chek Prep</td><td>M239</td><td>Lipide hôte de la protéine à cristalliser</td></tr><tr><td>monooléine lipidique de l’hôte LCP (9,9 MAG)</td><td>Sigma</td><td>M7765&nbsp ;</td><td>Lipide hôte pour la protéine à cristalliser</td></tr><tr><td>Lipide de l’hôte LCP monopalmitoléine (9,7 MAG)</td><td>Nu Chek Prep</td><td>M219</td><td>Lipide d’accueil de la protéine à cristalliser Lipide</td>de</tr><tr><td>l’hôte LCP 7,9 MAG</td><td>Avanti Polar Lipids 850534 Lipide</td><td></td><td>d’accueil pour la tiration afin d’éviter la formation de phase cristalline lamellaire (Lc) lors de l’injection de l’échantillon</td></tr><tr><td>Solution protéique purifiée concentrée à 20-50 mg/ml</td><td></td><td></td><td>Protéine cible</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Fisher Scientific</td><td>C606-1</td><td>Utilisé pour dissoudre les lipides</td></tr><tr><td>Méthanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>179337-500ML</td><td>Utilisé pour laver les seringues</td></tr><tr><td>Eleven 100 &#956 ; l Seringues étanches au gaz Hamilton sans aiguilles</td><td>Hamilton</td><td>7656-01</td><td>Pour la préparation LCP</td></tr><tr><td>Huit coupleurs de seringues</td><td>Formulatrix</td><td>SKU 209526</td><td>Pour la préparation LCP</td></tr><tr><td>Aiguille de chargement d’injecteur LCP</td><td>Hamilton</td><td>7804-01 style de point 3, longueur 1 pouce</td><td>Pour la distribution LCP et le chargement de l’injecteur</td></tr><tr><td>Aiguille amovible</td><td>Hamilton</td><td>7768-01</td><td>Pour éliminer la solution précipitante</td></tr><tr><td>Parafilm M</td><td>Parafilm</td><td>PM992</td><td>Utilisé pour l’étanchéité des seringues</td></tr><tr><td>Chiffons de nettoyage des lentilles anti-peluches</td><td>Fisher</td><td>NC9592151</td><td></td></tr><tr><td>Tubes filtrants centrifuges, Ultrafree-MC, 0,5 ml, Durapore 5 & micro ; m</td><td>Millipore</td><td>UFC3 0SV 00</td><td>Utilisé pour le filtrage des solutions de précipitation et des lipides</td></tr><tr><td>Lames de microscope, 1 pouce x 3 pouce&nbsp ;</td><td>GoldSeal</td><td>3010</td><td></td></tr><tr><td>Deux flacons de toilette avec embouts fins. L’un rempli de milli-Q ou d’eau distillée, l’autre de méthanol</td><td>VWR</td><td>89094-640</td><td>Ceux-ci sont utilisés pour nettoyer les seringues, les aiguilles et le coupleur. Le méthanol est utilisé en premier, puis l’eau.</td></tr><tr><td>Gants</td><td>Microflex</td><td>XC-310-L</td><td>Pour le brushing des seringues, des aiguilles, des viroles et des coupleurs Lunettes</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>de sécurité</td></tr><tr><td>Bidons d’air sous pression</td><td>Office Depot (Dust-Off)</td><td>527494</td><td>Pour le nettoyage des seringues</td></tr><tr><td>Chauffe-moteur sec avec régulateur de température numérique</td><td>Fisher</td><td>11-720-10BQ&nbsp ;</td><td>Utilisé pour la décongélation des lipides</td></tr><tr><td>Centrifugeuse de paillasse</td><td>Fisher</td><td>05-413-340</td><td>Solutions de rotation Salle</td></tr><tr><td>blanche Mini - 12 pouces Hotte à pression positive portable avec filtre HEPA</td><td>Sentry Air Systems, Inc.</td><td>SS-112-PCR</td><td>Nettoyage de la préparation des échantillons</td></tr><tr><td>Microscope à zoom stéréo équipé d’un polariseur linéaire et d’un analyseur rotatif</td><td>Nikon</td><td>SMZ1500</td> Microscope UV de <td>contrôle de la densité des cristaux</td></tr><tr><td></td><td>JAN Scientific</td><td>UVEX-P</td><td>En option, à des fins d’imagerie</td></tr><tr><td>à cristaux Imageur SHG</td><td>Formulatrix</td><td>SONICC</td><td>En option, à des fins d’imagerie à cristaux</td></tr></tbody></table>

préparation et livraison de microcristaux de protéines dans la phase lipidique cubique pour serial femtoseconde cristallographie

Preparation and Delivery of Protein Microcrystals in Lipidic Cubic Phase for Serial Femtosecond Crystallography

Les protéines membranaires (MP) sont des composants essentiels des membranes cellulaires et des cibles de médicaments primaires. la conception rationnelle de médicaments repose sur des informations structurelles précises, généralement obtenue par cristallographie; mais les députés sont difficiles à cristalliser. Les progrès récents dans la MP détermination de la structure a grandement bénéficié du développement de lipidiques phase cubique (LCP) de cristallisation, qui donnent généralement bien diffractant, mais souvent de petits cristaux qui souffrent de dégâts d&#39;irradiation lors de la collecte de données cristallographique traditionnelle sources synchrotron. Le développement du laser à électrons libres de nouvelle génération X-ray (XFEL) sources qui produisent des impulsions femtoseconde extrêmement lumineux a permis chambre de collecte de données de température de microcristaux sans ou dégâts d&#39;irradiation négligeable. Nos récents efforts en combinant la technologie LCP avec série cristallographie femtoseconde (LCP-SFX) ont abouti à des structures à haute résolution de plusieurs G récepteurs couplés aux protéines humaines, wUEL représenter une cible notoirement difficile pour la détermination de la structure. Dans la technique LCP-SFX, LCP est recruté en tant que matrice pour la croissance et la livraison de MP microcristaux à l&#39;intersection du flux d&#39;injection avec un faisceau d&#39;XFEL pour la collecte de données cristallographique. Il a été démontré que LCP-SFX peut sensiblement améliorer la résolution de diffraction lorsque seuls sous-10 um cristaux sont disponibles, ou lorsque l&#39;utilisation de petits cristaux à la température ambiante peut surmonter les divers problèmes associés à des cristaux plus grands cryocooled, comme l&#39;accumulation de défauts, haute mosaïcité et artefacts cryorefroidissement. les progrès futurs dans les sources de rayons X et les technologies de détection devraient cristallographie série très attrayant et pratique pour la mise en œuvre non seulement au XFEL, mais aussi à beamlines synchrotron plus accessibles. Nous présentons ici des protocoles visuels détaillés pour la préparation, la caractérisation et la livraison de microcristaux en LCP pour des expériences de cristallographie série.Ces protocoles comprennent des procédés pour la réalisation d&#39;expériences de cristallisation dans des seringues, la détection et la caractérisation des échantillons cristallins, en optimisant la densité de cristal, le chargement de microcristaux LCP chargé dans le dispositif d&#39;injection et délivrant l&#39;échantillon dans le faisceau pour la collecte des données.

Ci - dessous , nous décrivons des résultats représentatifs obtenus avec des échantillons préparés en suivant les protocoles ci - dessus, qui nous a permis de recueillir des données SFX et de résoudre des structures à haute résolution de cinq GPCR humains: le récepteur sérotoninergique 5-HT 2B en complexe avec un ergotamine agoniste 8 (PDB ID 4NC3 ), le récepteur lissée (SMO) dans le complexe avec un cyclopamine antagoniste 6 (PDB ID 4O9R), le récepteur δ-opioïde dans le complexe avec un bi-fonctionnel ligand peptidique DIPP-NH2 7 (PDB ID 4RWD), récepteur de l&#39; angiotensine dans le complexe avec un bloqueur ZD7155 9 (PDB ID 4YAY), et un complexe entre rhodopsine et arrestine 19 (PDB ID 4ZWJ); et deux essais de protéines solubles: lysozyme (PDB ID 4ZIX) et phycocyanine (PDB ID 4ZIZ). 5-HT 2B médie diverses fonctions centrales et périphériques physiologiques de la sérotonine , un neurotransmetteur. ce récepteura été utilisé pour établir et valider la méthode LCP-SFX, en comparant la structure de la température ambiante obtenue à LCLS avec la structure cryocooled résolu par microcristallographie traditionnelle au Advanced Photon Source (APS). Un total de ~ 100 ul échantillon de LCP avec microcristaux de protéines (taille moyenne d&#39; environ 5 um) a été préparé et utilisé pour la collecte de données SFX, et la structure LCP-SFX de 5HT 2B a été résolu avec succès à 2,8 Å (Figure 2) 8. Détails supplémentaires utiles sur la préparation de l&#39; échantillon et la collecte de données sont fournies dans le tableau 1. récepteur Smoothened (SMO) est un membre de la classe F GPCR et la cible moléculaire de la cyclopamine tératogène, avec des fonctions bien démontré dans le développement embryonnaire et la croissance tumorale. Dans un premier temps, des cristaux relativement gros de SMO / Cyclopamine avec une taille moyenne de 120 x 10 x 5 pm ont été obtenues et utilisées pour des données collectisur à une source de rayonnement synchrotron par cristallographie à base de goniomètre classique. Cependant, ces gros cristaux ont produit pauvre diffraction à une source de faisceaux (10 um de diamètre) micro-foyer souffrant de mosaïcité grande (supérieure à 2-3 degrés), probablement en raison de l&#39;accumulation de défauts de croissance cristalline, ou des effets liés à la cryorefroidissement. LCP-SFX, cependant, nous a permis de recueillir des données de diffraction de qualité à LCLS de 5 cristaux um de taille à la température ambiante. La structure a été résolue par remplacement moléculaire à anisotrope 3.4, 3.2 et la résolution 4.0 Å selon les trois axes principaux, identifiant clairement la localisation de cyclopamine dans la poche de liaison 6 (Figure 3). opiacés alcaloïdes, comme la morphine, en ciblant le récepteur de μ-opioïdes (μ-OR) sont largement utilisés pour la gestion de la douleur sévère. Cependant, leur utilisation extensive conduit à la tolérance acquise et la toxicomanie. Co-administration de morphiniquesavec récepteur δ-opioïde (δ-OR) antagonistes a été montré pour empêcher les effets secondaires mentionnés ci-dessus, favorisant ainsi la recherche de composés avec une fonction mixte δ-OR-antagoniste et μ-OR-agoniste. Nous avons obtenu les données de diffraction initiales sur δ-OR dans un complexe avec un bi-fonctionnelle tétra-peptide DIPP-NH2 en utilisant des cristaux cryocooled que diffractés à 3,3 Å à une source de rayons X synchrotron employant la stratégie classique de collecte de données sur la base goniomètre. Ces données ont révélé une densité d&#39;électrons partiellement ambiguës pour le ligand peptidique. Par la suite, les données XFEL de diffraction à la température ambiante ont été obtenues et la structure a été déterminée à 2,7 Å de résolution montrant une densité claire pour le ligand et le récepteur 7. Cette structure a été l&#39;occasion pour d&#39;autres fonctions de récepteur opioïde la compréhension et la sélectivité et a fourni des indications précieuses pour le développement de nouveaux analgésiques. 1 R) est un GPCR servant de principal régulateur de la pression artérielle. Nous cristallisé à 1 R dans le complexe avec un antagoniste ZD7155 en LCP. Cristaux optimisés atteint une taille maximale de 40 x 4 x 4 pm 3 avec la meilleure diffraction atteignant seulement ~ 4 Å à une source de rayonnement synchrotron. En changeant les conditions de cristallisation, nous avons obtenu une pluie de petits cristaux (10 × 2 × 2 pm 3), qui ont été utilisées pour obtenir la structure de la température ambiante à 2,9 Å de résolution en utilisant le rayonnement XFEL. Un total de 2,764,739 images de détection ont été recueillies pour faire un ensemble complet de données d&#39;environ 65 pi de cristal chargé LCP correspondant à environ 0,29 mg de protéine 9. Sur le nombre total de trames, 457.275 ont été identifiés comme coups de cristal, ce qui correspond à un taux de succès de 17%, dont 73,130 cadres (16% des hits) ont été indexés et intégrés avec succès. gRFP signal à travers deux principales voies médiées par soit des protéines G ou arrestins. La structure de la β 2 adrénergiques lié aux protéines d&#39;un G hétérotrimériques a été résolu il y a quelques années 20, alors que la structure d&#39;un GPCR dans un complexe avec arrestine était resté insaisissable. Nous avons obtenu des petits cristaux d&#39;une protéine de fusion rhodopsine-arrestine en LCP qui a atteint 25 à 30 pm dans la dimension la plus longue, mais malgré d&#39;importantes optimisation, diffractée seulement ~ 7 Å de résolution au niveau des sources de rayonnement synchrotron. En utilisant la méthode LCP-SFX, dans les 12 heures XFEL temps de faisceau, nous avons recueilli 22,262 coups de cristal, sur lesquelles 18.874 modèles ont été indexés et intégrés avec succès à anisotrope limites de résolution de 3,8 Å / 3,8 Å / 3,3 Å 19. Rhodopsin-arrestine est un complexe protéique très difficile qui a résisté à la détermination de la structure en utilisant des approches traditionnelles. La détermination de succès de cette structure a démontré l&#39;énorme potentiel dela méthode LCP-SFX pour aborder les problèmes difficiles et a fourni une occasion unique d&#39;examiner le mécanisme de signalisation arrestine-biaisée en RCPG. Enfin, en plus de la membrane cristaux de protéines produites dans la phase lipidique, notre préparation de l&#39;échantillon et le mode de livraison a été adapté avec succès à des cristaux de protéines solubles, où LCP est utilisé comme milieu de support pour la fourniture de cristaux, ce qui nous permet de diminuer considérablement la consommation de protéines requis pour la détermination de la structure. Deux structures de protéines modèles, le lysozyme et la phycocyanine, ont été résolus à 1,89 Å et 1,75 Å de résolution , respectivement , par ce procédé, en utilisant moins de 0,1 mg de chaque protéine 21. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td> Serotonin récepteur 2B </td><td> récepteur smoothened </td><td><strong&gt; Δ-opioïde récepteur </td><td> Agtr1 </td><td> Rhodopsin-Arrestin </td><td> lysozyme </td><td> phycocyanine </td></tr><tr><td> PDB ID </td><td> 4NC3 </td><td> 4O9R </td><td> 4RWD </td><td> 4YAY </td><td> 4ZWJ </td><td> 4ZIX </td><td> 4ZIZ </td></tr><tr><td> échantillon utilisé Total *, pl </td><td> 100 </td><td> 83 </td><td> 50 </td><td> 65 </td><td> 75 </td><td> dix </td><td> dix </td></tr><tr><td> La protéine totale utilisée, ug </td><td> 300 </td><td> 500 </td><td> 300 </td><td> 290 </td><td> 340 </td><td> 100 </td><td> 100 </td></tr><tr><td> La taille moyenne des cristaux, um </td><td> 5 × 5 × 5 </td><td> &lt;5 </td><td> 5 × 2 × 2 </td><td> 10 × 2 × 2 </td><td> 5-10 </td><td> 5 × 2 × 2 </td><td> 10 x 10 x 5 </td></tr><tr><td> Taux de succès, % </td><td>3.6 </td><td> 7.8 </td><td> 5.9 </td><td> 17 </td><td> 0,45 </td><td> 40 </td><td> 6.5 </td></tr><tr><td> Le temps total de collecte de données, hr </td><td> dix </td><td> 8 </td><td> 4.6 </td><td> 6.4 </td><td> 12 </td><td> 0,75 </td><td> 0,67 </td></tr><tr><td> Nombre de modèles indexés </td><td> 32819 </td><td> 61964 </td><td> 36083 </td><td> 73130 </td><td> 18874 </td><td> 54544 </td><td> 6629 </td></tr><tr><td> groupe spatial </td><td> C 2 2 2 1 </td><td> P 2 1 </td><td> C 2 </td><td> C 2 </td><td> P 2 1 2 1 2 1 </td><td> P 4 3 2 1 2 </td><td> 3 H 2 </td></tr><tr><td> Résolution, Å </td><td> 2.8 </td><td> 3,2 / 3,4 / 4,0 </td><td> 2.7 </td><td> 2.9 </td><td> 3,3 / 3,8 / 3,8 </td><td> 1,89 </td><td> 1.75 </td></tr></tbody></table> Tableau 1. Résumé des statistiques de préparation des échantillons et de collecte de données pour les structures représentatives résolu en utilisant la méthode LCP-SFX. La quantité d&#39;échantillon nécessaire pour une expérience LCP-SFX dépend de la qualité du cristal de diffraction, la densité cristalline, le diamètre de la buse d&#39;injection, ainsi que la fréquence de répétition de la taille du faisceau FEL, l&#39;intensité et le pouls. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/54463/54463fig1.jpg" /> Figure 1. Organigramme d&#39;un mode opératoire typique de préparation d&#39;échantillons pour la préparation de l&#39; échantillon LCP-SFX. Commence par LCP cristallisation de la protéine cible dans des seringues en verre étanche au gaz. Après on obtient des cristaux, le LCP de cristal chargé est consolidée dans une seringue et titrée avec des lipides supplémentaires, à Absorb la solution de précipitation en excès. Les cristaux sont ensuite caractérisés par diverses méthodes avant la collecte des données de microscopie XFEL. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54463/54463fig1large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/54463/54463fig2.jpg" /> Figure 2. Un résultat représentatif, la structure de la 5-HT 2B dans un complexe avec l&#39; ergotamine. (a) microcristaux 5-HT 2B / ergotamine imagées en utilisant un mode de microscope à champ lumineux 8. Ce chiffre a été réutilisé de la référence 8 avec la permission du droit d&#39;auteur de la science. (B) microcristaux de 5-HT 2B / ergotamine imagée en utilisant un mode de microscope à polarisation croisée 8. Ce chiffre a été réutilisé de la référence 8 avec le droit d&#39;auteurl&#39; autorisation de la science. (c) Une représentation de bande dessinée de 2B / structure ergotamine 5-HT obtenue par l&#39;approche LCP-SFX. Lipids qui ont été construits dans le modèle sont présentés dans la représentation de bâton. Le ergotamine ligand est représenté dans la représentation des sphères. Les lignes pleines indiquent les limites approximatives membranaires. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54463/54463fig2large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/54463/54463fig3.jpg" /> Figure 3. Un résultat représentatif, la structure du SMO en complexe avec cyclopamine. Panneau gauche, microcristaux de SMO / cyclopamine imagée en utilisant un mode de microscope à polarisation croisée 6. Ce chiffre a été réutilisé de référence 6 avec la permission du droit d&#39;auteur de Nature Communications. Panneau de droite, un representati de bande dessinéesur de la structure SMO / de cyclopamine obtenu par l&#39;approche LCP-SFX. cyclopamine Ligand est représenté dans la représentation des sphères. Les lignes pleines indiquent les limites approximatives membranaires. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54463/54463fig3large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>

Nous décrivons des procédures pour la préparation et l’administration de microcristaux de protéines membranaires en phase cubique lipidique pour la cristallographie en série à l’aide de lasers à rayons X à électrons libres et de sources synchrotron. Ces protocoles peuvent également être appliqués pour l’incorporation et l’administration de microcristaux de protéines solubles, ce qui permet de réduire considérablement la consommation d’échantillons par rapport à l’injection de liquide.

Préparation et livraison de microcristaux de protéines dans la phase lipidique cubique pour Serial femtoseconde Cristallographie

Membrane proteins (MPs) are essential components of cellular membranes and primary drug targets. Rational drug design relies on precise structural ...

L'objectif général de cette procédure est de préparer des échantillons de cristaux de protéines membranaires en phase cubique lipidique pour la collecte de données de cristallographie sérielle auprès de sources de synchrotron et de lasers à électrons libres sans rayons X. Cette méthode devrait aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie structurale des protéines membranaires, telles que le transport et la transduction de signal à travers la membrane. Le principal avantage de cette technique est qu'elle permet la détermination de la structure de protéines membranaires dans leur environnement lipidique natif, à température ambiante, avec une consommation minimale d'échantillon et des dommages induits par le rayonnement négligeables.Les personnes novices dans cette méthode éprouveront des difficultés, car la phase cubique lipidique est un matériau visqueux de consistance gélatineuse, difficile à manipuler sans outils spéciaux et une expérience préalable. Commencez cette procédure par la réconstitution des protéines membranaires dans la phase cubique lipidique, ou LCP, à l’aide des seringues numéro un et numéro deux, comme décrit dans le protocole textuel. Une fois une LCP transparente et homogène formée, transférez l’échantillon entier dans la seringue numéro deux.Détacher la seringue numéro un tout en maintenant le raccord fixé à la seringue numéro deux. Relier une aiguille amovible à une autre seringue propre de 100 microlitres, appelée seringue numéro trois. Aspirer environ 70 microlitres de la solution précipitante dans celle-ci.Déconnectez l'aiguille de la seringue numéro trois tout en gardant la sphérulite en téflon à l'intérieur de la seringue. Reliez les seringues numéro deux et numéro trois à l'aide du raccord, en veillant à ce que les sphérulites en téflon soient correctement positionnées dans les deux seringues. Vissez soigneusement le raccord fermement en place.Placer les seringues couplées verticalement, avec la Seringue Numéro Deux en bas, et injecter lentement et régulièrement l'échantillon de LCP chargé en protéine depuis la Seringue Numéro Deux dans la Seringue Numéro Trois, jusqu'à ce que le filament de LCP touche le piston de la Seringue Numéro Trois. Le volume de LCP injecté représentera environ un dixième du volume initial de précipitant contenu dans la Seringue Numéro Trois. Vérifier le volume à l'aide des graduations sur les deux seringues.Ensuite, déconnectez la seringue numéro deux. Le raccord est désormais uniquement relié à la seringue numéro trois, qui contient l'échantillon immergé dans la solution précipitante. Utilisez du Parafilm pour sceller complètement la seringue numéro trois, y compris l'interface entre le piston et la seringue, l'extrémité ouverte du raccord et l'écrou de l'aiguille.Un scellement incomplet lors de cette étape peut entraîner une modification des conditions de précipitation et une déshydratation de l'échantillon. Répétez les étapes d'injection de l'échantillon de LCP chargé en protéine afin de mettre en place la cristallisation dans six seringues supplémentaires, en utilisant au total environ 50 microlitres de l'échantillon de LCP. Conservez les seringues scellées dans un sac en plastique refermable contenant un ou deux chiffons de nettoyage sans fibres préalablement imbibés d'eau afin de protéger contre la déshydratation de l'échantillon.Fermez le sac et conservez les seringues dans un incubateur à 20 degrés Celsius pendant la croissance des cristaux. Pour la détection des cristaux, retirez les seringues de l'incubateur et observez directement les échantillons de LCP à l'intérieur des seringues toutes les 12 à 24 heures au microscope stéréo avec lumière polarisée croisée. Identifiez les cristaux comme des particules brillantes étroitement compactées ou, dans le cas de cristaux plus petits, comme une lueur uniforme provenant du filament de LCP.Remettez les seringues scellées dans le sac et stockez-les à 20 degrés Celsius pour une utilisation ultérieure. L'étape de titrage des lipides est nécessaire pour absorber l'excès de solution précipitante et empêcher la congélation des lipides lors de l'injection dans le faisceau de laser à électrons libres sans rayons X. Environ une heure avant le début de la collecte des données, retirez les seringues contenant les échantillons de l'incubateur à 20 degrés Celsius.Sélectionnez deux à quatre seringues pour la consolidation des échantillons en fonction d’un aspect cristallin similaire et de la ressemblance des conditions de cristallisation. Retirez soigneusement le film Parafilm des seringues sélectionnées. Retirez le raccord de seringue et fixez une aiguille amovible propre à la première seringue sélectionnée.Poussez doucement et lentement le piston vers l'avant pour expulser le précipitant à travers l'aiguille dans un tube de microcentrifugeuse. Soyez prudent à cette étape, car l'application d'une pression élevée sur le piston peut éjecter une partie du LCP chargé de cristaux en même temps que la solution de précipitant, entraînant une perte partielle ou totale de l'échantillon. Arrêtez le piston lorsque la majeure partie du précipitant a été éliminée et que le LCP s'est accumulé à l'entrée de l'aiguille.Effectuer ce processus pour les autres seringues sélectionnées. Pour regrouper les échantillons LCP obtenus, relier deux seringues entre elles à l’aide d’un raccord propre. Appuyer sur le piston d’une seringue pour transférer intégralement l’échantillon d’une seringue à l’autre.Déconnectez la seringue vide. Répétez cette étape afin de regrouper tout le matériau LCP chargé de cristaux dans une seule seringue. Éliminez autant que possible le précipitant.Ajoutez environ cinq microlitres de 7,9 MAG ou du lipide hôte MAG à chaîne plus courte d'origine dans une seringue vide. Connectez cette seringue à celle contenant l'échantillon consolidé à l'aide d'un raccord de seringue, puis mélangez en appuyant alternativement sur les pistons des seringues. Répétez l'opération jusqu'à ce que toute la solution résiduelle soit absorbée et qu'un LCP homogène et transparent soit formé.Transférez l'ensemble de l'échantillon LCP mixé dans une seringue, puis déconnectez la seringue vide. Fixez une aiguille de chargement pour injecteur LCP à la seringue contenant l'échantillon consolidé. Éjectez soigneusement environ un microlitre de l'échantillon LCP sur une lame de verre, puis recouvrez-le d'une lamelle en verre.Appuyez doucement sur la lame couvre-objet pour comprimer l'échantillon. Prenez des images de l'échantillon de LCP au microscope stéréo avec le grossissement le plus élevé possible, en utilisant un éclairage en champ clair et des polariseurs croisés. Si possible, prenez des images supplémentaires à l’aide d’un microscope à fluorescence UV et d’un dispositif d’imagerie pour confirmer la présence de microcristaux de protéine dans l’échantillon.Estimez la taille et la densité des cristaux. La densité idéale des cristaux pour une expérience de collecte de données dépendra de la taille des cristaux, du diamètre du faisceau de rayons X, et du diamètre du flux de LCP, et devrait conduire à un taux de détection des cristaux d’environ 10 à 40 %. Enfin, chargez l'injecteur LCP et effectuez la cristallographie sérielle en femtoseconde avec LCP, ou la collecte de données LCP SFX, comme décrit dans le protocole textuel. Sont montrés ici des microcristaux du récepteur de la sérotonine en complexe avec l'ergotamine, imagés en mode microscope à champ clair, ainsi qu’en mode microscope à lumière polarisée croisée.La structure du complexe entre le récepteur de la sérotonine et l'ergotamine a été obtenue par l'approche LCP SFX. On observe ici des microcristaux du récepteur smoothant en complexe avec la cyclopamine, imagés en utilisant un mode de microscope en lumière croisée. La structure du complexe entre le récepteur et la cyclopamine a été obtenue par l'approche LCP SFX.Une fois maîtrisée, cette procédure peut être réalisée en moins de deux heures si elle est effectuée correctement. Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur la structure de cibles protéiques membranaires, avec de légères modifications, elle peut également être appliquée à d'autres protéines. Les implications de cette technique s'étendent vers la découverte de médicaments, car des structures à haute résolution fournissent d'excellents modèles pour les interactions standard entre protéines lignanes et aident à concevoir des médicaments plus efficaces.

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Préparation et livraison de microcristaux de protéines dans la phase lipidique cubique pour Serial femtoseconde Cristallographie (Vidéo) | JoVE Journal

Préparation et livraison de microcristaux de protéines dans la phase lipidique cubique pour Serial femtoseconde Cristallographie

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