Préparation et livraison de microcristaux de protéines dans la phase lipidique cubique pour Serial femtoseconde Cristallographie

L’objectif général de cette procédure est de préparer des échantillons de cristaux de protéines membranaires en phase cubique lipidique pour la collecte de données de cristallographie en série à des sources synchrotron et laser à électrons sans rayons X. Cette méthode devrait aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie structurale des protéines membranaires, telles que le transport et la transduction unique à travers la membrane. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet de déterminer la structure des protéines membranaires dans leur environnement lipidique natif à température ambiante avec une consommation minimale d’échantillons et des dommages causés par les radiations négligeables.

Les personnes qui ne connaissent pas cette méthode auront du mal car la phase cubique lipidique est un matériau visqueux semblable à un gel qui est difficile à manipuler sans outils spéciaux et expérience préalable. Commencez cette procédure par la reconstitution des protéines membranaires en phase cubique lipidique, ou LCP, à l’aide des seringues numéro un et numéro deux, comme décrit dans le protocole textuel. Une fois qu’un LCP transparent et homogène est formé, déplacez l’échantillon entier dans la seringue numéro deux.

Détachez la seringue numéro un tout en gardant le coupleur connecté à la seringue numéro deux. Connectez une aiguille amovible à une autre seringue propre de 100 microlitres, appelée seringue numéro trois. Aspirez-y environ 70 microlitres de la solution précipitante.

Débranchez l’aiguille de la seringue numéro trois tout en gardant la sphérule en téflon à l’intérieur de la seringue. Connectez les seringues numéro deux et numéro trois à travers le coupleur, en vous assurant que les sphérules en téflon sont correctement en place dans les deux seringues. Vissez soigneusement le coupleur en position.

Orientez les seringues couplées verticalement, avec la seringue numéro deux au fond, et injectez lentement et régulièrement l’échantillon LCP chargé en protéines de la seringue numéro deux dans la seringue numéro trois, jusqu’à ce que la chaîne LCP touche le piston de la seringue numéro trois. Le volume LCP injecté représentera environ 1/10e du volume initial du précipitant dans la seringue numéro trois. Vérifiez le volume à l’aide de la lecture de l’échelle sur les deux seringues.

Ensuite, débranchez la seringue numéro deux. Le coupleur n’est maintenant connecté qu’à la seringue numéro trois, qui contient l’échantillon immergé dans la solution de précipitation. Utilisez Parafilm pour sceller complètement la seringue numéro trois, y compris l’interface piston-seringue, l’extrémité d’ouverture du coupleur et l’écrou de l’aiguille.

Une étanchéité incomplète au cours de cette étape peut entraîner une modification des conditions précipitantes et une déshydratation de l’échantillon. Répétez l’injection des étapes de l’échantillon LCP chargé de protéines pour mettre en place la cristallisation dans six seringues supplémentaires, en utilisant un total d’environ 50 microlitres de l’échantillon LCP. Conservez les seringues scellées dans un sac en plastique refermable avec un ou deux chiffons de nettoyage sans fibres pré-imbibés d’eau pour les protéger contre la déshydratation de l’échantillon.

Fermez le sac et rangez les seringues dans un incubateur à 20 degrés Celsius pendant la croissance des cristaux. Pour la détection des cristaux, retirez les seringues de l’incubateur pour émettre les échantillons LCP directement à l’intérieur des seringues toutes les 12 à 24 heures sous un stéréomicroscope à lumière polarisée croisée. Identifiez les cristaux comme des particules brillantes serrées ou, dans le cas de cristaux de plus petite taille, comme une lueur uniforme du filament LCP.

Remettez les seringues scellées dans le sac et conservez-les à 20 degrés Celsius pour une utilisation future. L’étape de titrage des lipides est nécessaire pour absorber l’excès de solution précipitante et pour éviter la congélation des lipides lors de l’injection dans le faisceau laser d’électrons sans rayons X. Environ une heure avant le début de la collecte des données, retirez les seringues contenant les échantillons de l’incubateur à 20 degrés Celsius.

Sélectionnez deux à quatre seringues pour la consolidation de l’échantillon en fonction de l’apparence cristalline similaire et de la similitude des conditions de cristallisation. Retirez avec précaution l’étanchéité Parafilm des seringues sélectionnées. Retirez le coupleur de seringue et fixez l’aiguille amovible propre à la première seringue sélectionnée.

Poussez doucement et lentement le piston vers l’avant pour presser le précipitant à travers l’aiguille dans un tube de microcentrifugation. Faites preuve de prudence à cette étape ; parce que l’application d’une pression élevée sur le piston peut éjecter une partie du LCP chargé de cristaux avec la solution précipitante, entraînant une perte partielle ou complète de l’échantillon. Arrêtez le piston lorsque la majeure partie du précipitant a été retirée et que le LCP s’est accumulé à l’entrée de l’aiguille.

Effectuez ce processus pour les autres seringues sélectionnées. Pour consolider les échantillons LCP résultants, connectez deux seringues ensemble à l’aide d’un coupleur propre. Appuyez sur le piston d’une seringue pour transférer l’échantillon entier d’une seringue à une autre.

Débranchez la seringue vide. Répétez cette étape pour regrouper tout le matériau LCP chargé de cristaux dans une seule seringue. Retirez autant de précipitant que possible.

Ajoutez environ cinq microlitres de 7,9 MAG ou le lipide hôte original à chaîne plus courte MAG dans une seringue vide. Connectez cette seringue à la seringue avec l’échantillon consolidé à l’aide d’un coupleur de seringue et mélangez en appuyant alternativement sur les pistons de la seringue. Répétez le processus jusqu’à ce que toute la solution résiduelle ait été absorbée et qu’un LCP homogène et transparent se forme.

Déplacez l’ensemble de l’échantillon LCP mélangé dans une seringue et débranchez la seringue vide. Fixez une aiguille de chargement d’injecteur LCP à la seringue avec l’échantillon consolidé. Éjectez avec précaution environ un microlitre de l’échantillon LCP sur une lame de verre et couvrez-le d’une lamelle de verre.

Appuyez doucement sur la lamelle pour prendre l’échantillon en sandwich. Prenez des images de l’échantillon LCP sous un stéréomicroscope au grossissement le plus élevé possible, en utilisant un éclairage en champ clair et des polariseurs croisés. Si possible, prenez des images supplémentaires à l’aide d’un microscope à fluorescence UV et d’un imageur pour confirmer l’existence de microcristaux de protéines dans l’échantillon.

Estimer la taille et la densité des cristaux. La densité cristalline idéale pour une expérience de collecte de données dépendra de la taille du cristal, du diamètre du faisceau de rayons X et du diamètre du flux LCP, et devrait aboutir à un taux de réussite des cristaux d’environ 10 à 40 %. Enfin, chargez l’injecteur LCP et effectuez une cristallographie femtoseconde en série LCP ou une collecte de données LCP SFX, comme décrit dans le protocole de texte. On voit ici des microcristaux du récepteur de la sérotonine en complexe avec de l’ergotamine, imagés à l’aide d’un mode de microscope à fond clair et imagés à l’aide d’un mode de microscope à lumière polarisée croisée.

La structure du complexe ergotamine du récepteur de la sérotonine a été obtenue par l’approche LCP SFX. On voit ici des microcristaux du récepteur lisseant en complexe avec la cyclopamine qui ont été imagés à l’aide d’un mode microscope à polarisation croisée. La structure du complexe récepteur cyclopamine a été obtenue par l’approche LCP SFX.

Une fois maîtrisée, cette procédure peut être réalisée en moins de deux heures si elle est effectuée correctement. Bien que cette méthode puisse donner un aperçu de la structure des cibles protéiques membranaires, avec de légères modifications, elle peut également être appliquée à des protéines. L’implication de cette technique s’étend à la découverte de médicaments ; Parce que les structures à haute résolution fournissent d’excellents modèles à partir des interactions standard entre les protéines de lignane et aident à concevoir des médicaments plus efficaces.