Préparation et livraison de microcristaux de protéines dans la phase lipidique cubique pour Serial femtoseconde Cristallographie

L'objectif général de cette procédure est de préparer des échantillons de cristaux de protéines membranaires en phase cubique lipidique pour la collecte de données de cristallographie sérielle auprès de sources de synchrotron et de lasers à électrons libres sans rayons X. Cette méthode devrait aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie structurale des protéines membranaires, telles que le transport et la transduction de signal à travers la membrane. Le principal avantage de cette technique est qu'elle permet la détermination de la structure de protéines membranaires dans leur environnement lipidique natif, à température ambiante, avec une consommation minimale d'échantillon et des dommages induits par le rayonnement négligeables.

Les personnes novices dans cette méthode éprouveront des difficultés, car la phase cubique lipidique est un matériau visqueux de consistance gélatineuse, difficile à manipuler sans outils spéciaux et une expérience préalable. Commencez cette procédure par la réconstitution des protéines membranaires dans la phase cubique lipidique, ou LCP, à l’aide des seringues numéro un et numéro deux, comme décrit dans le protocole textuel. Une fois une LCP transparente et homogène formée, transférez l’échantillon entier dans la seringue numéro deux.

Détacher la seringue numéro un tout en maintenant le raccord fixé à la seringue numéro deux. Relier une aiguille amovible à une autre seringue propre de 100 microlitres, appelée seringue numéro trois. Aspirer environ 70 microlitres de la solution précipitante dans celle-ci.

Déconnectez l'aiguille de la seringue numéro trois tout en gardant la sphérulite en téflon à l'intérieur de la seringue. Reliez les seringues numéro deux et numéro trois à l'aide du raccord, en veillant à ce que les sphérulites en téflon soient correctement positionnées dans les deux seringues. Vissez soigneusement le raccord fermement en place.

Placer les seringues couplées verticalement, avec la Seringue Numéro Deux en bas, et injecter lentement et régulièrement l'échantillon de LCP chargé en protéine depuis la Seringue Numéro Deux dans la Seringue Numéro Trois, jusqu'à ce que le filament de LCP touche le piston de la Seringue Numéro Trois. Le volume de LCP injecté représentera environ un dixième du volume initial de précipitant contenu dans la Seringue Numéro Trois. Vérifier le volume à l'aide des graduations sur les deux seringues.

Ensuite, déconnectez la seringue numéro deux. Le raccord est désormais uniquement relié à la seringue numéro trois, qui contient l'échantillon immergé dans la solution précipitante. Utilisez du Parafilm pour sceller complètement la seringue numéro trois, y compris l'interface entre le piston et la seringue, l'extrémité ouverte du raccord et l'écrou de l'aiguille.

Un scellement incomplet lors de cette étape peut entraîner une modification des conditions de précipitation et une déshydratation de l'échantillon. Répétez les étapes d'injection de l'échantillon de LCP chargé en protéine afin de mettre en place la cristallisation dans six seringues supplémentaires, en utilisant au total environ 50 microlitres de l'échantillon de LCP. Conservez les seringues scellées dans un sac en plastique refermable contenant un ou deux chiffons de nettoyage sans fibres préalablement imbibés d'eau afin de protéger contre la déshydratation de l'échantillon.

Fermez le sac et conservez les seringues dans un incubateur à 20 degrés Celsius pendant la croissance des cristaux. Pour la détection des cristaux, retirez les seringues de l'incubateur et observez directement les échantillons de LCP à l'intérieur des seringues toutes les 12 à 24 heures au microscope stéréo avec lumière polarisée croisée. Identifiez les cristaux comme des particules brillantes étroitement compactées ou, dans le cas de cristaux plus petits, comme une lueur uniforme provenant du filament de LCP.

Remettez les seringues scellées dans le sac et stockez-les à 20 degrés Celsius pour une utilisation ultérieure. L'étape de titrage des lipides est nécessaire pour absorber l'excès de solution précipitante et empêcher la congélation des lipides lors de l'injection dans le faisceau de laser à électrons libres sans rayons X. Environ une heure avant le début de la collecte des données, retirez les seringues contenant les échantillons de l'incubateur à 20 degrés Celsius.

Sélectionnez deux à quatre seringues pour la consolidation des échantillons en fonction d’un aspect cristallin similaire et de la ressemblance des conditions de cristallisation. Retirez soigneusement le film Parafilm des seringues sélectionnées. Retirez le raccord de seringue et fixez une aiguille amovible propre à la première seringue sélectionnée.

Poussez doucement et lentement le piston vers l'avant pour expulser le précipitant à travers l'aiguille dans un tube de microcentrifugeuse. Soyez prudent à cette étape, car l'application d'une pression élevée sur le piston peut éjecter une partie du LCP chargé de cristaux en même temps que la solution de précipitant, entraînant une perte partielle ou totale de l'échantillon. Arrêtez le piston lorsque la majeure partie du précipitant a été éliminée et que le LCP s'est accumulé à l'entrée de l'aiguille.

Effectuer ce processus pour les autres seringues sélectionnées. Pour regrouper les échantillons LCP obtenus, relier deux seringues entre elles à l’aide d’un raccord propre. Appuyer sur le piston d’une seringue pour transférer intégralement l’échantillon d’une seringue à l’autre.

Déconnectez la seringue vide. Répétez cette étape afin de regrouper tout le matériau LCP chargé de cristaux dans une seule seringue. Éliminez autant que possible le précipitant.

Ajoutez environ cinq microlitres de 7,9 MAG ou du lipide hôte MAG à chaîne plus courte d'origine dans une seringue vide. Connectez cette seringue à celle contenant l'échantillon consolidé à l'aide d'un raccord de seringue, puis mélangez en appuyant alternativement sur les pistons des seringues. Répétez l'opération jusqu'à ce que toute la solution résiduelle soit absorbée et qu'un LCP homogène et transparent soit formé.

Transférez l'ensemble de l'échantillon LCP mixé dans une seringue, puis déconnectez la seringue vide. Fixez une aiguille de chargement pour injecteur LCP à la seringue contenant l'échantillon consolidé. Éjectez soigneusement environ un microlitre de l'échantillon LCP sur une lame de verre, puis recouvrez-le d'une lamelle en verre.

Appuyez doucement sur la lame couvre-objet pour comprimer l'échantillon. Prenez des images de l'échantillon de LCP au microscope stéréo avec le grossissement le plus élevé possible, en utilisant un éclairage en champ clair et des polariseurs croisés. Si possible, prenez des images supplémentaires à l’aide d’un microscope à fluorescence UV et d’un dispositif d’imagerie pour confirmer la présence de microcristaux de protéine dans l’échantillon.

Estimez la taille et la densité des cristaux. La densité idéale des cristaux pour une expérience de collecte de données dépendra de la taille des cristaux, du diamètre du faisceau de rayons X, et du diamètre du flux de LCP, et devrait conduire à un taux de détection des cristaux d’environ 10 à 40 %. Enfin, chargez l'injecteur LCP et effectuez la cristallographie sérielle en femtoseconde avec LCP, ou la collecte de données LCP SFX, comme décrit dans le protocole textuel. Sont montrés ici des microcristaux du récepteur de la sérotonine en complexe avec l'ergotamine, imagés en mode microscope à champ clair, ainsi qu’en mode microscope à lumière polarisée croisée.

La structure du complexe entre le récepteur de la sérotonine et l'ergotamine a été obtenue par l'approche LCP SFX. On observe ici des microcristaux du récepteur smoothant en complexe avec la cyclopamine, imagés en utilisant un mode de microscope en lumière croisée. La structure du complexe entre le récepteur et la cyclopamine a été obtenue par l'approche LCP SFX.

Une fois maîtrisée, cette procédure peut être réalisée en moins de deux heures si elle est effectuée correctement. Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur la structure de cibles protéiques membranaires, avec de légères modifications, elle peut également être appliquée à d'autres protéines. Les implications de cette technique s'étendent vers la découverte de médicaments, car des structures à haute résolution fournissent d'excellents modèles pour les interactions standard entre protéines lignanes et aident à concevoir des médicaments plus efficaces.