Détection de l'activité dépendant du pH de Escherichia coli Chaperone HdeB In vitro et In Vivo

L’objectif global de ces essais in vivo et in vitro est de caractériser l’activité dépendante du pH de l’chaperon HdeB d’Escherichia coli dans des conditions de pH acides. Les chaperons activés par l’acide n’ont qu’un seul travail à faire, ils doivent protéger les protéines contre le déploiement et la dégradation des protéines induits par l’acide. Cette fonction est particulièrement importante pour les bactéries entériques, qui doivent survivre à l’environnement acide de l’estomac si elles veulent coloniser avec succès l’intestin.

Les méthodes que nous présentons ici vous permettent d’identifier et de caractériser les chaperons activés par l’acide, et de définir les conditions de pH qui conduisent à leur activation. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de caractériser les chaperons, tels que HdeB in vitro et in vivo, ce qui vous aide à déchiffrer le mécanisme de son activation. Ces méthodes ont été appliquées avec succès à d’autres chaperons protecteurs acides, tels que le HDA, et peuvent être modifiées pour fonctionner avec d’autres chaperons et/ou des conditions de stress.

L’influence de la HdeB purifiée sur l’agrégation de la malate déshydrogénase mitochondriale porcine à dépliage thermique à différentes valeurs de pH est surveillée. MDH dialysé à quatre degrés Celsius pendant la nuit contre quatre litres de tampon C. Ensuite, concentrez la protéine à environ 100 micromolaires à l’aide d’unités de filtration centrifuges avec une coupure de poids moléculaire de 30 kilodaltons. Pour éliminer les agrégats, centrifugez la protéine pendant 20 minutes à 20 000 fois G à quatre degrés Celsius.

Déterminer la concentration de MDH par absorbance à 280 nanomolaires. Préparez ensuite 50 aliquotes de 50 microlitres de MDH et congelez-les pour le stockage. Placez une cuvette en quartz d’un millilitre dans un spectrophotomètre fluorescent équipé de porte-échantillons et d’agitateurs à température contrôlée.

Réglez la longueur d’onde d’excitation et d’admission à 350 nanomètres. Ajoutez les volumes appropriés de tampon D préchauffé aux valeurs de pH souhaitées dans la cuvette. Le volume total est de 1 000 microlitres.

Réglez la température dans le porte-cuvette à 43 degrés Celsius. Ajouter 12,5 micromolaires de HdeB dans le tampon, suivi de l’ajout de 0,5 micromolaire de MDH. Commencez à surveiller la diffusion de la lumière.

Incuber la réaction pendant 360 secondes pour permettre un dépliage suffisant de la MDH. Augmentez le pH à sept en ajoutant un volume de 0,16 à 0,34 de phosphate dipotassique non tamponné à deux molaires, et continuez à enregistrer la diffusion de la lumière pendant encore 440 secondes. Analysez les données comme décrit dans le protocole texte.

Transformer le plasmide exprimant HdeB ou le contrôle vectoriel MD, PBAD 18, en souche BB7224 Delta RPOH à l’aide de cellules chimiquement compétentes. Cette souche est sensible à la température et doit être cultivée à 30 degrés Celsius. Après 45 secondes de choc thermique à 42 degrés Celsius et avant le placage, incubez les cellules à 30 degrés Celsius et 200 tr/min.

Effectuez des séquences en une seule colonie de clones positifs et incubez pendant une nuit à 30 degrés Celsius. Préparez une culture nocturne dans 50 millilitres de LB avec de l’ampicilline, et cultivez les cellules à 200 tr/min et 30 degrés Celsius. Diluer sur des cultures nocturnes 40 fois en 25 millilitres de LB avec de l’ampicilline.

Cultivez les bactéries en présence de 0,5 % d’arabinose à 30 degrés Celsius et 200 tr/min jusqu’à une densité optique de 600 nanomètres, ou OD 600 égale à 1,0, pour induire l’expression de la protéine HDEB. Pour les expériences de décalage de pH, utilisez LB avec de l’ampicilline et de l’arabinose pour diluer les cellules à une OD 600 de 0,5. Ajustez les valeurs de pH respectives en ajoutant des volumes appropriés d’acide chlorhydrique à cinq molaires.

Après les points de temps indiqués, neutralisez les cultures en ajoutant les volumes appropriés d’hydroxyde de sodium à cinq molaires. Surveiller la croissance des cultures neutralisées et de la culture liquide pendant 12 heures à 30 degrés Celsius à l’aide de mesures de DO. Pour étudier l’optimum de pH de l’activité chaperonne de HdeB in vitro, le MDH natif a été dilué dans un tampon préchauffé du pH indiqué en présence ou en absence de HdeB.

Après 360 secondes d’incubation, l’agrégation de MDH à 43 degrés Celsius a été déclenchée par neutralisation. En présence de HdeB, le signal de diffusion de la lumière est considérablement diminué lors de la neutralisation à partir du pH quatre, ce qui indique que HdeB empêche l’agrégation de MDH. Les mesures d’agrégation sont très sensibles aux changements de température ou de teneur en tampon.

Pour éliminer les résultats faussement positifs, l’influence de la mémoire tampon de stockage chaperon sur l’agrégation des clients a été étudiée. La mémoire tampon de stockage HdeB n’a eu aucun effet sur l’agrégation MDH. Pour étudier les effets de HdeB in vivo, des essais de survie dépendants du pH ont été effectués à l’aide de la souche de délétion RPOH sensible à la température.

Cette souche n’a pas la plupart des chaperons et est donc plus sensible aux températures élevées, au pH bas ou au stress oxydé. La surexpression de HdeB dans des conditions de pH neutre n’a montré aucun effet sur le taux de croissance de la souche, qui s’est développée comparativement bien à la souche témoin qui héberge le vecteur vide, PBAD 18. En revanche, des différences nettes ont été observées dans leur capacité à reprendre la croissance lors de traitements à pH trois ou quatre, la souche HdeB exprimant trop de pH montrant une récupération améliorée de manière reproductible après un traitement à faible pH par rapport à la souche témoin.

Une fois maîtrisée, la purification peut être effectuée en trois jours, l’essai de diffusion in vitro en une journée, et les essais de survie in vivo en deux jours s’il est effectué correctement. Lorsque vous faites ces expériences, assurez-vous d’examiner attentivement votre plan expérimental, à la fois en ce qui concerne le type de protéines clientes, leurs concentrations et les conditions tampons que vous utilisez. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet d’acquérir une compréhension plus fine du mécanisme d’activation du chaperon et de ses effets dans un contexte in vivo.

Et n’oubliez pas que l’étude de l’optimum de pH d’un chaperon protecteur acide peut être assez difficile. En effet, le comportement d’agrégation de la protéine cliente que vous utilisez changera probablement également avec le pH. Par conséquent, assurez-vous de choisir des systèmes tampons qui conviennent à la fois au chaperon et à la protéine cliente.

Suite à cette procédure, d’autres méthodes telles que les tests de spin down par page SCS, peuvent être effectuées dans la suppression auto-quantifiée médiée par chaperon de l’agrégation de clients.