Name: Anticorps marquage avec des colorants fluorescents en utilisant une protéine magnétique A et protéine G Perles (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 48 s
Description: Découvrez le marquage d'anticorps avec des colorants fluorescents sur billes magnétiques protéine A ou G directement depuis le milieu cellulaire. Cette méthode optimise la chimie de marquage sans purification préalable.

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1. Anticorps de capture sur High Capacity Protein magnétique A ou la protéine G Magnetic Beads <ol><li> Uniformément re-suspension des billes magnétiques par agitation douce. Gardez l&#39;uniforme de suspension lorsque aliquotage perles. </li><li> Ajouter 50 pi de perles suspension à un tube de 1,5 ml. Placez dans le support magnétique pendant 10 sec. Retirez délicatement le tampon de stockage. </li><li> Ajouter 250 pi de tampon de liaison d&#39;anticorps. </li><li> Mélanger et placer dans le support magnétique pendant 10 sec. Retirez délicatement le tampon de liaison. </li><li> Ajouter 1,0 ml de l&#39;échantillon contenant 50 à 100 ug d&#39;anticorps aux billes. Les échantillons peuvent être purifiés des anticorps ou des anticorps dans le milieu cellulaire. </li><li> Mélanger l&#39;échantillon pendant 60 min à température ambiante en utilisant un mélangeur à vortex ou mélangeur à tambour-end. </li><li> Placer le tube dans le support magnétique pendant 10 secondes et retirer le surnageant. </li><li> Ajouter 250 pi de tampon de liaison / lavage anticorps et mélanger. Placez dans le support magnétique pendant 10 secondes et éliminer le tampon de liaison / lavage. Répétez cette sTep pour un total de deux lavages. </li><li> Passez à la section 2 pour les anticorps de l&#39;étiquette en utilisant la chimie amine ou à l&#39;article 3 aux anticorps de l&#39;étiquette en utilisant la chimie de thiol. </li></ol> 2. Anticorps Étiquetage utilisant Amine Chemistry <ol><li> Anticorps conjugué <ol><li> Ajouter 100 pi de tampon de conjugaison aminé aux billes. </li><li> Dissoudre les colorants fluorescents réagissant avec les amines (AlexaFluor 532-SE) à 10 mg / ml par addition de 100 ul de diméthylsulfoxyde (DMSO) à 1,0 mg de colorant. Mélanger par tourbillonnement. Faire de cette solution juste avant l&#39;utilisation. </li><li> Ajouter 2,5 ul de colorant avec une amine pour 100 pg d&#39;anticorps. Note: En général, un excès molaire 5-20 de colorant réactif est recommandé. Cependant, la quantité de colorant réactif ajouté à la réaction doit être optimisé de manière empirique en fonction de colorant désiré ratio d&#39;anticorps et d&#39;anticorps propriétés intrinsèques. </li><li> Mélanger l&#39;échantillon pendant 60 min à température ambiante en utilisant un mélangeur à vortex ou mélangeur à tambour-end. Assurez-vous que les perles restent en suspension. </li><li> Placer le tube dans le support magnétique pendant 10 secondes et retirer le surnageant. </li><li> Ajouter 250 pi de tampon de liaison / lavage anticorps et mélanger. Placez dans le support magnétique pendant 10 sec. Retirer et jeter le tampon de liaison / lavage. Répétez cette étape pour un total de deux lavages. </li></ol></li><li> antibody Recovery <ol><li> Ajouter 50 pi de tampon d&#39;élution aux billes. </li><li> Mélanger pendant 5 min à température ambiante en utilisant un mélangeur à vortex ou mélangeur à tambour-end. Assurez-vous que les perles restent en suspension. </li><li> Placer le tube dans le support magnétique pendant 10 sec. Retirer l&#39;échantillon et le transfert élué dans un nouveau tube de micro-centrifugeuse contenant 5 pi de tampon de neutralisation. </li><li> Répétez le processus une fois de plus et mettre en commun les échantillons élues. </li><li> Quantifier la concentration d&#39;anticorps et de colorant à anticorps rapport tel que décrit dans la section 4. </li></ol></li></ol> 3. Anticorps Étiquetage utilisant thiol Chemistry <ol><li> Réduction des anticorps <ol><li> Ajouter 250 pide tampon de conjugaison thiol et mix. Placer le tube dans le support magnétique pendant 10 s. Retirer et jeter le tampon. Répéter deux fois cette étape. </li><li> Ajouter 100 pi de tampon de conjugaison thiol. </li><li> Ajouter du dithiothréitol (DTT) jusqu&#39;à une concentration finale de 2,5 mM. </li><li> Mélanger l&#39;échantillon pendant 60 min à température ambiante en utilisant un mélangeur à vortex ou mélangeur à tambour-end. Assurez-vous que les perles restent en suspension. </li><li> Placer le tube dans le support magnétique pendant 10 secondes et éliminer le tampon. </li><li> Ajouter 250 pi de tampon de conjugaison thiol et mélanger. Placer le tube dans le support magnétique pendant 10 s. Retirer et jeter le tampon. Répétez cette étape pour un total de deux lavages. </li><li> Ajouter 100 pi de tampon de conjugaison thiol. </li></ol></li><li> Anticorps conjugué <ol><li> Dissoudre le colorant réactif thiol à 10 mg / ml par addition de 100 ul de DMSO à 1,0 mg de colorant. Mélanger par tourbillonnement. Faire de cette solution juste avant l&#39;utilisation. </li><li> Ajouter 2,5 pi de colorant thiol réactif pour 100 ug d&#39;anticorps. Note: En général, un excès molaire 5-20 de colorant réactif est recommandé. Cependant, la quantité de colorant réactif ajouté à la réaction doit être optimisé de manière empirique en fonction de colorant désiré ratio d&#39;anticorps et d&#39;anticorps propriétés intrinsèques. </li><li> Mélanger l&#39;échantillon pendant 60 min à température ambiante en utilisant un mélangeur à vortex ou mélangeur à tambour-end. Assurez-vous que les perles restent en suspension. </li><li> Placer le tube dans le support magnétique pendant 10 secondes et retirer le surnageant. </li><li> Ajouter 250 pi de tampon de conjugaison thiol et mélanger. Placez dans le support magnétique pendant 10 secondes et retirer le tampon. Répétez cette étape pour un total de deux lavages. </li></ol></li><li> Eluer Anticorps <ol><li> Ajouter 50 pi de tampon d&#39;élution aux billes. </li><li> Mélanger pendant 5 min à température ambiante en utilisant un mélangeur à vortex ou mélangeur à tambour-end. Assurez-vous que les perles restent en suspension. </li><li> Placer le tube dans le support magnétique pendant 10 sec. Retirer l&#39;échantillon et le transfert élué dans un nouveau tube de micro-centrifugeuse contenant 5 pi de neutun tampon de ralization. </li><li> Répétez le processus une fois de plus et mettre en commun les échantillons élues. </li><li> Quantifier la concentration d&#39;anticorps et de colorant à anticorps rapport tel que décrit dans la section 4. </li></ol></li></ol> Ratio 4. Calculer Dye-to-Antibody <ol><li> Mesurer l&#39;absorbance du conjugué anticorps-colorant à 280 nm (A280) et à l&#39;Xmax pour le colorant (Amax). </li><li> Calculer la concentration d&#39;anticorps: Anticorps Concentration (mg / ml) = A280 - (A × max CF) / 1,4 où CF = facteur de correction du colorant (fourni par le fabricant). </li><li> Calculer le rapport colorant à l&#39;anticorps: Colorant à l&#39; anticorps Ratio (DAR) = (A max × 150 000) / Ab concentration (mg / ml) x ε colorant où ε colorant = coefficient d&#39;extinction du colorant à son maximum d&#39;absorption et le poids moléculaire de l&#39; anticorps = 150 000 Da. </li></ol>

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<li>Acchione, M., Kwon, H., Jochheim, C. M., Atkins, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+linker+and+conjugation+chemistry+on+antigen+binding%2C+Fc+receptor+binding+and+thermal+stability+of+model+antibody-drug+conjugates%5BTitle%5D)+AND+%22MAbs%22%5BJournal%5D)">Impact of linker and conjugation chemistry on antigen binding, Fc receptor binding and thermal stability of model antibody-drug conjugates.</a> MAbs. 4 (3), 362-372 (2012).</li>
</ol>

Les auteurs sont des employés de Promega Corporation.

Le but de cette étude était de développer un procédé pour marquer des anticorps présents dans le milieu cellulaire à des concentrations faibles, avec une variété de petites molécules. Un tel procédé permettra à un grand nombre d&#39;anticorps, au cours des premiers stades de la découverte d&#39;anticorps, à marquer avec de petites molécules et tamisé en utilisant un essai biologique approprié. Un tel essai est l&#39;anticorps intériorisation dosage médiée par le récepteur lorsque l&#39;internalisation entre les anticorp...

Des anticorps marqués avec de petites molécules sont peut - être les réactifs les plus couramment utilisés en biologie 1,2. Des anticorps marqués avec des colorants fluorescents et la biotine sont largement utilisés dans l&#39; imagerie, les dosages immunologiques, cytométrie en flux, des transferts Western, immunoprécipitation et parmi d&#39; autres applications 3-6. Anticorps radiomarqués 3,7- trouvent une utilisation extensive dans l&#39; imagerie et la thérapie, des anticorps marqués avec des médicaments cytotoxiques (ADC) sont offrant de nouvelles options pour le traitement des cancers, et deux ADCs ont déjà été approuvés pour une utilisation thérapeutique 8. En dépit de leur large utilisation, les méthodes d&#39;anticorps étiquetage sont restés étonnamment inchangé et généralement impliquer de multiples réactions et de dessalage étapes 9-12. Méthodes de résolution fonctionnent très bien dans les cas où seuls quelques anticorps doivent être étiquetés et sont disponibles sous une forme hautement purifiée à forte concentration et en quantité suffisante. Cependant, pour les applications plus récentes comme ADCs, il y a unbesoin d&#39;étiqueter des anticorps au stade précoce d&#39;hybridome de sorte qu&#39;ils peuvent être criblés pour des propriétés biologiques pertinents, par exemple, médiée par un récepteur d&#39; anticorps intériorisation 13-16. Au stade de l&#39;hybridome, des volumes d&#39;échantillons sont limités, les anticorps sont exprimés à de faibles concentrations et un certain nombre d&#39;échantillons sont grandes, donc des méthodes d&#39;étiquetage basées sur des solutions ne sont pas adaptés. Pour simplifier et améliorer le débit des méthodes de marquage des anticorps traditionnels, quelques approches alternatives ont été proposées 17,18. Une approche consiste à utiliser la protéine amagnétique A billes d&#39;affinité emballés dans de petites colonnes pour capturer des anticorps suivie par la réaction de marquage et l&#39;élution de la protéine marquée et purifiée. Cette méthode peut être utilisée pour marquer les anticorps directement à partir de milieux cellulaires, cependant, l&#39;utilisation de colonnes peut être laborieuse. Un procédé basé sur des billes magnétiques a été récemment rapporté 19 qui élimine l&#39;utilisation de colonnes et de débit mais à cause amélioreà l&#39;anticorps capacité limitée des billes de liaison, seulement nanogramme à des quantités faibles de microgramme des anticorps pourrait être étiqueté. Nous avons récemment développé et utilisé une grande capacité magnétique protéine A et protéine G perles (&gt; 20 mg d&#39;IgG / ml de perles sédentaires humain) pour étiqueter des anticorps présents dans les milieux de cellules avec de petites molécules 20. La capacité élevée des bourrelets permet de dizaines à des centaines de microgrammes d&#39;anticorps à marquer facilement et rapidement la réponse magnétique des billes simplifie la manipulation et le traitement d&#39;un grand nombre d&#39;échantillons en parallèle. En utilisant des colorants fluorescents comme substituts pour les petites molécules, nous montrons que la méthode est compatible avec amine et thiol étiquetage chimie et offre des recouvrements élevés d&#39;anticorps marqués et très purs. Ce protocole et la vidéo qui l&#39;accompagne décrivent l&#39;étiquetage sur cordon de anticorps de souris présents dans les médias de cellules en utilisant la protéine magnétique A et protéine G perles. Le protocole estdivisé en quatre sections: Section 1 décrit la capture d&#39;anticorps sur le cordon à partir d&#39;échantillons biologiques. Après la capture, le marquage des anticorps avec un colorant fluorescent à l&#39;aide de la chimie amine ou en utilisant la chimie thiol est décrite dans les sections 2 et l&#39;article 3, respectivement. Enfin, la section 4 décrit la méthode pour le calcul de la concentration d&#39;anticorps et le colorant au rapport de l&#39;anticorps.

<table><tbody><tr><td>Magne Protein A Perles</td><td>Promega Corporation</td><td>&nbsp ; G8781</td><td></td></tr><tr><td>Particules de protéine G de magne</td><td>Promega Corporation&nbsp ;</td><td>&nbsp ; G7471</td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor 532-SE (Ester de Succinimidyle)</td><td>Life Technologies</td><td>A20001</td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor 532-ME (Malemide)</td><td>Life Technologies</td><td>A10255</td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor 647-ME (Maleimide)</td><td>Life Technologies</td><td>A20347</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescein-ME (Maleimide)</td><td>Life Technologies</td><td>F-150</td><td></td></tr><tr><td>Magnetic Stand</td><td>Promega</td><td>Réf. Z5332</td><td></td></tr></tbody></table>

anticorps marquage avec des colorants fluorescents en utilisant une protéine magnétique a et protéine g perles

Antibody Labeling with Fluorescent Dyes Using Magnetic Protein A and Protein G Beads

Les anticorps marqués avec de petites molécules comme des colorants fluorescents, des médicaments cytotoxiques, et des traceurs radioactifs sont des outils essentiels dans la recherche biomédicale, immunodiagnostic et plus récemment en tant qu&#39;agents thérapeutiques. Les méthodes traditionnelles pour marquer des anticorps avec de petites molécules nécessitent des anticorps purifiés à une concentration relativement élevée, comportent plusieurs étapes de dialyse et ont un débit limité. Toutefois, plusieurs applications, y compris le domaine de conjugués anticorps-médicaments (CAN), bénéficieront de nouvelles méthodes qui permettront l&#39;étiquetage des anticorps directement à partir de milieux cellulaires. De tels procédés peuvent permettre d&#39;anticorps à cribler dans des essais biologiques pertinents, par exemple, l&#39;anticorps intériorisation dosage médiée par le récepteur dans le cas de VPA. Ici, nous décrivons un (méthode à bille) procédé qui permet l&#39;étiquetage de petites quantités d&#39;anticorps directement à partir de milieux cellulaires. Cette approche utilise grande capacité magnétique protéine A et protéine G billes d&#39;affinité pour capturer des anticorpsà partir des milieux cellulaires, suivi par un marquage avec de petites molécules en utilisant la chimie amine ou thiol, et l&#39;élution subséquente des anticorps marqués. Prendre des colorants fluorescents comme substituts pour les petites molécules, nous démontrons l&#39;étiquetage sur cordon de trois anticorps de souris différents directement à partir de milieux cellulaires utilisant à la fois amine et de la chimie de marquage thiol. La forte affinité de liaison des anticorps à la protéine A et la protéine G assure des recouvrements élevés ainsi que de haute pureté des anticorps marqués. En outre, l&#39;utilisation de billes magnétiques permet de multiples échantillons à traiter manuellement, ce qui améliore considérablement l&#39;étiquetage débit.

Un schéma de marquage d&#39; anticorps avec de petites molécules en utilisant une grande capacité magnétique de la protéine A et la protéine G billes est représenté sur la figure 1. Les anticorps capturés sur la protéine magnétique G billes peuvent être marquées avec de petites molécules, par exemple des colorants fluorescents, en utilisant la chimie des amines qui marque des amines primaires de la lysine, des acides aminés ou en utilisant la chimie thiol qui marque les ...

La méthode à bille pour le marquage des anticorps avec de petites molécules permet l&#39;étiquetage d&#39;une petite quantité d&#39;anticorps directement à partir de milieux cellulaires. Cette méthode est compatible avec une amine et de la chimie de thiol, et peut gérer plusieurs échantillons en parallèle, manuellement ou en utilisant des plates-formes automatisées.

Anticorps marquage avec des colorants fluorescents en utilisant une protéine magnétique A et protéine G Perles

Antibodies labeled with small molecules like fluorescent dyes, cytotoxic drugs, and radioactive tracers are essential tools in biomedical research, ...

L'objectif général de cette méthode est de marquer des anticorps avec des colorants fluorescents à partir d'échantillons purifiés ou directement à partir de milieu cellulaire en utilisant des billes magnétiques de protéine A ou G. Cette méthode peut être utilisée pour optimiser la chimie de marquage, même avec de faibles quantités d'anticorps présents dans le milieu cellulaire, ce qui permet une meilleure utilisation en aval des anticorps.Les principaux avantages de cette technique sont que les anticorps ne nécessitent pas de purification, que l'on peut utiliser la chimie amine ou thiol, et que la méthode peut être automatisée ou réalisée manuellement. Commencez par re-suspendre uniformément les billes par agitation douce. Ensuite, ajoutez 50 microlitres de billes dans un tube microcentrifuge de 1,5 millilitre.Ensuite, placez le tube dans un support magnétique. Après 10 secondes, remplacez soigneusement le tampon de conservation par 250 microlitres de tampon de liaison des anticorps et mélangez bien les billes. Après encore 10 secondes, remplacez soigneusement le tampon de liaison par un millilitre de l'anticorps d'intérêt.Et mélanger l'échantillon pendant 60 minutes à température

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La cellule perméables réticulant DSP [dithiobis (succinimidyl propionate)] stabilise les interactions transitoires et...

Isolement du labiles complexes multi-protéiques par des In vivo Contrôlée Cellulaire réticulation et chromatographie d&#39;affinité immuno-magnétiques

Cette vidéo présente une méthode pour détecter les souches cyanobactériennes dans un échantillon environnemental à l’aide d’une puce à microréseaux d’anticorps. Les échantillons porteurs de diverses bactéries interagissent avec les anticorps imprimés, et l’immunomarquage avec des anticorps anti-cyanobactéries marqués au fluorophore révèle la présence de souches cyanobactériennes spécifiques par fluorescence à des endroits distincts.

Technique de détection de souches cyanobactériennes à l’aide d’une puce à microréseau d’anticorps

Cette vidéo démontre la détection bactérienne quantitative multiplexée à l’aide de microsphères de polystyrène magnétique carboxylé teintes en ensembles distincts. La procédure comprend la formation de complexes billes et bactéries, la séparation magnétique et l’analyse en flux, permettant une quantification précise et simultanée de plusieurs bactéries dans le même puits de réaction.

Détection quantitative de bactéries multiplexées à l’aide de microsphères magnétiques marquées à un colorant

Nous décrivons un procédé pour marquer la protéine à la surface des neurones vivants en utilisant un anticorps polyclonal spécifique à des épitopes extracellulaires. Protéine liée par l'anticorps sur la surface de la cellule et ensuite internalisée par endocytose peut être distinguée de la protéine restante sur, ou à un trafic, de la surface au cours de l'incubation.

Étiquetage différentiel de surface cellulaire et intériorisé protéines après Anticorps alimentation de Live de culture neurones

L’imagerie spectroscopique électronique permet d’imager et de distinguer l’acide nucléique de la protéine à une résolution nanométrique. Il peut être combiné avec le système miniSOG, qui est capable de marquer spécifiquement les protéines marquées dans des échantillons de microscopie électronique à transmission. Nous illustrons l’utilisation de ces technologies en utilisant des foyers de réparation de cassures double brin à titre d’exemple.

Visualisation des miniSOG protéines marquées de réparation d&#39;ADN en combinaison avec Electron imagerie spectroscopique (ESI)

Ici, nous présentons un protocole pour introduire des sondes chimiques spécifiques au site dans un fragment d’anticorps en incorporant génétiquement un acide aminé contenant de l’azoture, puis en couplant l’azoture avec une sonde chimique par cycloaddition azide-alcyne promue par souche (SPAAC).

Efficace et Antibody Étiquetage par Strain promu Azide-alcyne cycloaddition spécifique du site

La traduction de la purification d'affinité de ribosome (TRAP) permet l'isolement rapide et efficace de l'ARNm de traduction de type de cellule-spécifique. Ici, nous démontrons une méthode qui combine l'injection hydrodynamique de queue-veine dans un modèle de souris de repeuplement de foie et de TRAP pour examiner le profil d'expression des hépatocytes repoptant.

Profilage de l'expression génique spécifique au type cellulaire dans le foie de souris

Nous introduisons ici une procédure pour mesurer les oligomers protéiques et l’agrégation dans les cellules lysées cellulaires et vivantes à l’aide de la spectroscopie de corrélation de fluorescence.

Détection de l’agrégation protéique à l’aide de la spectroscopie de corrélation de fluorescence

Ce protocole décrit le marquage à anticorps unique (SAL) pour résoudre l’organisation spatiale à l’échelle nanométrique des protéines de la membrane plasmique. En tirant parti des interactions cumulatives anticorps-épitope au niveau de la molécule unique, le SAL membranaire (mSAL) cartographie les distributions locales des épitopes tout en capturant simultanément le comportement de liaison des anticorps dans l’environnement cellulaire natif.

Microscopie de localisation à une seule molécule des protéines membranaires utilisant le marquage à anticorps unique

Nous avons développé un vecteur lentiviral qui possède, en plus de la LTR-Tat réactif, l'élément de réponse Rev-(RRE) qui peuvent réguler l'expression du gène rapporteur de façon à VIH-1 Tat et Rev-dépendante. Le vecteur permet la détection spécifique de la réplication du VIH dans les cellules vivantes via l'expression de la GFP.

Marquage spécifique du VIH-1 des cellules positives à l&#39;aide d&#39;un vecteur Rev-dépendante lentiviraux exprimant la protéine fluorescente verte

Découvrez le marquage d'anticorps avec des colorants fluorescents sur billes magnétiques protéine A ou G directement depuis le milieu cellulaire. Cette méthode optimise la chimie de marquage sans purification préalable.

Anticorps marquage avec des colorants fluorescents en utilisant une protéine magnétique A et protéine G Perles

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