Anticorps marquage avec des colorants fluorescents en utilisant une protéine magnétique A et protéine G Perles

L'objectif général de cette méthode est de marquer des anticorps avec des colorants fluorescents à partir d'échantillons purifiés ou directement à partir de milieu cellulaire en utilisant des billes magnétiques de protéine A ou G. Cette méthode peut être utilisée pour optimiser la chimie de marquage, même avec de faibles quantités d'anticorps présents dans le milieu cellulaire, ce qui permet une meilleure utilisation en aval des anticorps.

Les principaux avantages de cette technique sont que les anticorps ne nécessitent pas de purification, que l'on peut utiliser la chimie amine ou thiol, et que la méthode peut être automatisée ou réalisée manuellement. Commencez par re-suspendre uniformément les billes par agitation douce. Ensuite, ajoutez 50 microlitres de billes dans un tube microcentrifuge de 1,5 millilitre.

Ensuite, placez le tube dans un support magnétique. Après 10 secondes, remplacez soigneusement le tampon de conservation par 250 microlitres de tampon de liaison des anticorps et mélangez bien les billes. Après encore 10 secondes, remplacez soigneusement le tampon de liaison par un millilitre de l'anticorps d'intérêt.

Et mélanger l'échantillon pendant 60 minutes à température ambiante. À la fin de l'incubation, replacer les tubes sur l'aimant et retirer le surnageant une fois que les billes se sont déplacées sur les parois des tubes. Ensuite, rincer le mélange de billes et d'anticorps par deux lavages de 10 secondes chacun avec 250 microlitres de tampon de lavage pour la liaison des anticorps par lavage.

Pour marquer les anticorps à l'aide de la chimie amines, après le deuxième lavage, remplacez le tampon de lavage par 100 microlitres de tampon de conjugaison amine et ajoutez 2,5 microlitres de colorant réactif aux amines fraîchement préparé par 100 microgrammes d'anticorps. Vortexez l'échantillon pendant 60 minutes à température ambiante afin de maintenir les billes en suspension durant l'étiquetage. Puis, replacez le tube sur l'aimant pendant 10 secondes et retirez le surnageant.

Lavez les billes deux fois avec le tampon de lavage pour liaison des anticorps, comme vient de l'être démontré. Ensuite, remplacez le tampon de lavage par 50 microlitres de tampon d'élution et mélangez les billes pendant cinq minutes. Replacez le tube sur l'aimant pendant 10 secondes et transférez l'anticorps élué dans un nouveau tube de microcentrifugation contenant cinq microlitres de tampon de neutralisation.

Éluez l'anticorps une fois de plus, comme vient de l'être démontré, en récupérant les échantillons élutés. Ensuite, mesurez l'absorbance du conjugué anticorps-colorant à 280 nanomètres et à la longueur d'onde maximale (lambda max) du colorant. Pour marquer les anticorps par chimie thiols, après le deuxième lavage, remplacez le tampon de lavage par 250 microlitres de tampon de conjugaison thiols et mélangez les billes par pipetage doux.

Après 10 secondes, lavez les billes deux fois avec le tampon de lavage pour la liaison des anticorps. Ensuite, remplacez le tampon de lavage par 100 microlitres de tampon de conjugaison thiol et ajoutez du DTT pour obtenir une concentration finale de 2,5 millimolaire. Mélangez les billes pendant encore 60 minutes.

Ensuite, remettre les billes sur l'aimant pendant 10 secondes et éliminer le tampon. Ajouter ensuite 250 microlitres de tampon de conjugaison au thiol aux billes en mélangeant doucement. Après 10 secondes, laver les billes deux fois avec le tampon de lavage de liaison des anticorps, en remplaçant le deuxième lavage par 100 microlitres de tampon de conjugaison au thiol frais.

À présent, ajoutez 2,5 µL de colorant réactif aux thiols, préparé fraîchement, par 100 µg d'anticorps et mélangez les billes pendant 60 minutes à température ambiante. À la fin de l'incubation, replacez le tube sur l'aimant pendant 10 secondes. Puis remplacez le surnageant par 250 µL de tampon frais de conjugaison des thiols en effectuant un mélange doux.

Après 10 secondes, lavez les billes deux fois. Ensuite, remplacez le tampon de lavage par 50 microlitres de tampon d'élution et éluerez deux fois l'anticorps conjugué, comme vient de l'être démontré. Puis, mesurez l'absorbance du conjugué anticorps-colorant à 280 nanomètres et à la longueur d'onde maximale (lambda max) du colorant.

L'affinité élevée entre les anticorps et la protéine G, l'affinité solide de l'aimant pour les billes, ainsi que l'optimisation de la méthode avant la purification sur billes conduisent conjointement à une perte négligeable d'anticorps au cours de la réaction de marquage, comme en témoigne la récupération efficace de trois isotopes d'anticorps murins différents après un double marquage fluorescent comparée à une purification simple. Cette récupération est également visible sur des gels de Coomassie, où les faibles propriétés de liaison non spécifique des billes magnétiques de protéine G entraînent la présence de chaînes lourdes et légères hautement purifiées et doublement marquées au niveau fluorescent. Le marquage sur billes à l’aide de billes magnétiques de protéine A est également compatible avec plusieurs colorants fluorescents, conduisant à une forte récupération et à de bons rapports colorant-anticorps.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en deux à trois heures, si elle est effectuée correctement. Elle permet de manipuler plusieurs échantillons manuellement ou à l’aide d’une plateforme automatisée pour améliorer le débit. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de toujours maintenir les billes magnétiques en suspension.

Choisissez le volume approprié de billes magnétiques pour l'échantillon. Et optimisez la quantité de colorant fluorescent pour l'anticorps d'intérêt. Après cette procédure, les anticorps marqués doivent être testés afin d'évaluer leur fonctionnalité à l'aide de tests biologiques pertinents, tels que le ELISA, les cytométries en flux ou les tests cellulaires.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'étiqueter des anticorps purifiés et non purifiés avec des marqueurs fluorescents ou d'autres petites molécules, comme la biotine ou des médicaments cytotoxiques, en utilisant des billes magnétiques de protéine A ou G.