Détection colorimétrique de bactéries à l'aide de test Litmus

L'objectif général de cette expérience est de démontrer un test de litmus modifié simple pour la détection bactérienne. Cette méthode décrit comment une enzyme ADN clivant l'ARN activée par E.coli peut être couplée à une plateforme de transduction de signal basée sur l'uréase afin de produire un changement de couleur en réponse à E.coli. Les deux principaux avantages de cette technique sont la simplicité du test et son applicabilité à d'autres enzymes ADN clivant l'ARN sensibles à divers analytes.

La procédure sera démontrée par Seperh Manchehry et Dingran Chang, étudiants diplômés du laboratoire du Dr Yingfu Li à l'Université McMaster. Après avoir préparé les réactifs et les tampons selon le protocole écrit, préparez une solution mère de succinimidyle 4-cyclohexane-1-carboxylate, ou SMCC, en dissolvant un milligramme de SMCC dans 676 microlitres de DMSO. Vortexez et placez sur de la glace jusqu'à utilisation.

Dissoudre un milligramme d'uréase dans un millilitre de PBS 1x et placer également sur de la glace jusqu'à utilisation. Pour synthétiser l'ADN d'uréase, ou UrDNA, ajouter 10 microlitres de LD1 à 100 micromolaire dans un tube microfuge de 2,5 millilitres. Ensuite, ajouter 140 microlitres d'eau doublement distillée et 40 microlitres de PBS 10x, puis vortexer.

Ensuite, ajoutez 80,5 µL de solution mère de SMCC et 159,5 µL de DMSO. Puis, vortexez à nouveau et effectuez une courte centrifugation à l’aide d’une centrifugeuse de banc. Incubez la réaction à 37 °C dans un incubateur ou sur un bloc chauffant pendant 60 minutes.

Après l'incubation, ajouter 200 microlitres de PBS 1x, 60 microlitres d'acétate de sodium à trois molaire et 1,5 millilitre d'éthanol froid à 100 % dans le tube. Mélanger par vortexage et incuber la réaction à moins 20 degrés Celsius pendant 30 minutes. Centrifuger la solution à 20 000 fois g et à quatre degrés Celsius pendant 20 minutes.

Ensuite, retirez le surnageant et séchez le culot sous vide. Au culot séché, ajoutez 400 microlitres de solution mère d'uréase et incubez à température ambiante pendant 5 heures. Transférez 200 microlitres du conjugué brut vers une colonne filtrante centrifuge préalablement lavée, avec un seuil de coupure de 100 000 de poids moléculaire.

Centrifuger la colonne à 14 000 × g pendant cinq minutes. Transférer les 200 microlitres restants du conjugué brut vers la colonne et centrifuger à 14 000 × g pendant cinq minutes. Ensuite, retirer la colonne et la placer à l’envers dans un nouveau tube de collecte microcentrifuge de deux millilitres.

Centrifuger la colonne inversée et le tube à 1 000 × g pendant deux minutes. Après avoir retiré le tube de collecte, ajouter 30 microlitres de PBS 1x sur la colonne centrifuge pour laver la membrane et récupérer davantage de conjugués. Inverser à nouveau la colonne et la remettre dans le tube de collecte.

Centrifuger la colonne à 1 000 × g pendant deux minutes. Retirer et jeter la colonne. Conserver l'ADN urinaire à quatre degrés Celsius jusqu'à son utilisation.

Pour assembler un ADNzyme clivant l'ARN activé par E.coli, ou EC1, et l'UrDNA sur des billes magnétiques, bien mélanger la solution mère de billes magnétiques et transférer 100 microlitres de suspension de billes dans un tube microcentrifuge de 1,5 millilitre. Ensuite, placer le tube sur un support de rack magnétique pour isoler les billes. Éliminer le surnageant par pipetage et ajouter 150 microlitres de tampon de liaison, ou BB, dans le tube.

Retirer le tube du support et taper doucement sur le tube pour redisperser les billes en une solution homogène. Après avoir répété deux fois supplémentaires le lavage avec le BB en maintenant les billes en suspension dans le BB, ajouter 10 microlitres de EC1 à 10 micromolaire. Mélanger délicatement en tapotant le tube.

Incuber la solution avec un léger agitation pendant 30 minutes. Pour éviter l'agrégation des billes, tapoter sur le tube toutes les deux à trois minutes. Ensuite, replacer le tube microcentrifuge sur le support magnétique pour isoler les billes et éliminer le surnageant à l’aide d’une pipette.

Ensuite, utiliser 150 microlitres de BB pour laver les billes trois fois. Une fois le lavage terminé, resuspendre les billes dans un volume total de 150 microlitres de BB. À cette solution, ajouter 15 microlitres d'UrDNA et chauffer l'échantillon à 45 degrés Celsius pendant deux minutes, puis refroidir la solution à température ambiante et incuber pendant deux heures. Placer à nouveau le tube microcentrifuge sur le support magnétique pour isoler les billes et éliminer le surnageant à l’aide d’une pipette.

Ajouter 100 microlitres de tampon de réaction, ou RB, puis retirer le tube du support magnétique et redisperser soigneusement les billes. Après avoir préparé les cellules d’E.coli selon le protocole indiqué, pré-laver un tube microcentrifuge de 1,5 millilitre en ajoutant et en vortexant 100 microlitres de RB. Ensuite, éliminer le tampon. Ajouter 15 microlitres de EC1 assemblé au tube lavé, puis placer le tube sur le support magnétique et aspirer le surnageant.

Retirez le tube du support, ajoutez 100 microlitres de RB et re-suspendez soigneusement les billes magnétiques. Après avoir lavé les billes deux fois supplémentaires avec du RB et éliminé le RB, ajoutez 10 microlitres de l'échantillon d’E.coli au tube et mélangez délicatement le contenu en tapotant le tube. Incubez ensuite la réaction à température ambiante pendant une heure.

Après l'incubation, ajouter 90 microlitres d'eau doublement distillée et placer le tube sur le support magnétique. Après environ trois minutes de séparation magnétique, transférer soigneusement 85 microlitres du surnageant dans un tube microcentrifuge de 0,5 millilitre. Il est très important de pipeter la solution avec précaution sans prélever les billes magnétiques.

Ces billes sont chargées d'uréase et généreront un signal faussement positif. Ajoutez 15 microlitres de rouge de phénol à 0,04 % et 100 microlitres de solution substrat. Ensuite, prenez des photographies à des intervalles de temps spécifiques pour enregistrer le changement de couleur.

La couleur initiale du test au tournesol doit être jaune, reflétant un pH de la solution inférieur à 5,5. Si nécessaire, le pH initial du test au tournesol peut être ajusté à l’aide d’un tampon faible, tel qu’un tampon d’acétate de sodium un millimolaire à pH cinq. Cette figure montre les résultats du test bactérien au tournesol, dans lequel l’ADNzyme clivant l’ARN activé par E.coli EC1 a été utilisé comme ADNzyme et le rouge de phénol comme indicateur de pH.

Comme le montre l'absence de changement de couleur en l'absence d'E.coli, EC1 est hautement spécifique et présente une activité minimale vis-à-vis d'autres bactéries. L'intensité du changement de couleur dépend à la fois du nombre de cellules d'E.coli utilisé lors de l'étape d'activation du DNAzyme et de la durée accordée à l'hydrolyse de l'urée. Un plus grand nombre de cellules d'E.coli entraîne un changement de couleur plus marqué, tandis qu'une durée plus longue d'hydrolyse de l'urée permet la détection d'un nombre moindre de cellules.

Ce graphique montre la variation du pH mesurée à l’aide d’un pH-mètre portatif. La présence de 10⁷ cellules d’E. coli a entraîné une augmentation progressive du pH de trois unités en 10 minutes. En revanche, l’absence d’E. coli n’a pas provoqué de changement de pH détectable dans les mêmes conditions.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en deux heures si elle est effectuée correctement. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se rappeler que l'uréase est très active, et qu'un mauvais lavage ou une contamination entraînera un faux positif. Après cette procédure, cette méthode peut être utilisée pour tester la présence d'E.coli dans des conditions plus pertinentes, comme lors du contrôle de la qualité de l'eau environnementale.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment tirer parti d'un simple test au papier tournesol pour détecter E.coli. N'oubliez pas que ce test peut être utilisé pour détecter les souches pathogènes d'E.coli, qui sont extrêmement dangereuses. Vous devez suivre une formation en biosécurité avant d'effectuer des tests sur des bactéries pathogènes.