Name: Détection colorimétrique de bactéries à laide de test Litmus (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 5 s
Description: Découvrez une méthode colorimétrique simple pour détecter E. coli à l'aide d'un test au tournesol modifié et d'une DNAzyme spécifique. Cette technique rapide et accessible permet une détection visible des bactéries en quelques minutes.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Le financement de ce projet de recherche a été fourni par le Conseil de recherches en sciences naturelles et en génie du Canada (CRSNG) par l’intermédiaire d’une subvention à la découverte accordée à YL.

<ol><li>Daar, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Top+ten+biotechnologies+for+improving+health+in+developing+countries%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Top ten biotechnologies for improving health in developing countries.</a> Nat. Genet. 32, 229-232 (2002).</li>
<li>Newman, J. D., Turner, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Home+blood+glucose+biosensors%3A+a+commercial+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens.+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Home blood glucose biosensors: a commercial perspective.</a> Biosens. Bioelectron. 20, 2435-2453 (2005).</li>
<li>Turner, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biosensors%3A+sense+and+sensibility%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Soc.+Rev%22%5BJournal%5D)">Biosensors: sense and sensibility.</a> Chem. Soc. Rev. 42, 3184-3196 (2013).</li>
<li>Tram, K., Kanda, P., Salena, B. J., Huan, S. Y., Li, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translating+Bacterial+Detection+by+DNAzymes+into+a+Litmus+Test%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Translating Bacterial Detection by DNAzymes into a Litmus Test.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 53, 12799-12802 (2014).</li>
<li>Ali, M. M., Aguirre, S. D., Lazim, H., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorogenic+DNAzyme+probes+as+bacterial+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Fluorogenic DNAzyme probes as bacterial indicators.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 50, 3751-3754 (2011).</li>
<li>Schlosser, K., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biologically+inspired+synthetic+enzymes+made+from+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Biologically inspired synthetic enzymes made from DNA.</a> Chem. Biol. 16, 311-322 (2009).</li>
<li>Tuerk, C., Gold, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+evolution+of+ligand+by+exponential+enrichment%3A+RNA+ligands+to+bacteriophage+T4+DNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Systematic evolution of ligand by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase.</a> Science. 249, 505-510 (1990).</li>
<li>Ellington, A. D., Szostak, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+selection+of+RNA+molecules+that+bind+specific+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands.</a> Nature. 346, 818-822 (1990).</li>
<li>Breaker, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Making+catalytic+DNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Making catalytic DNAs.</a> Science. 290, 2095-2096 (2000).</li>
<li>Liu, J., Cao, Z., Lu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+nucleic+acid+sensors%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Rev%22%5BJournal%5D)">Functional nucleic acid sensors.</a> Chem. Rev. 109, 1948-1998 (2009).</li>
<li>Navani, N. K., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleic+acid+aptamers+and+enzymes+as+sensors%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Nucleic acid aptamers and enzymes as sensors.</a> Curr. Opin. Chem. Biol. 10, 272-281 (2006).</li>
<li>Li, J., Lu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+highly+sensitive+and+selective+catalytic+DNA+biosensor+for+lead+ions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">A highly sensitive and selective catalytic DNA biosensor for lead ions.</a> J. Am. Chem. Soc. 122, 10466-10467 (2000).</li>
<li>Liu, J., Lu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+colorimetric+lead+biosensor+using+DNAzyme-directed+assembly+of+gold+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">A colorimetric lead biosensor using DNAzyme-directed assembly of gold nanoparticles.</a> J. Am. Chem. Soc. 125, 6642-6643 (2003).</li>
<li>Liu, Z., Mei, S. H. J., Brennan, J. D., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assemblage+of+signaling+DNA+enzymes+with+intriguing+metal+specificity+and+pH+dependence%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Assemblage of signaling DNA enzymes with intriguing metal specificity and pH dependence.</a> J. Am. Chem. Soc. 125, 7539-7545 (2003).</li>
<li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+catalytic+beacon+sensor+for+uranium+with+parts-per-trillion+sensitivity+and+millionfold+selectivity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">A catalytic beacon sensor for uranium with parts-per-trillion sensitivity and millionfold selectivity.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104, 2056-2061 (2007).</li>
<li>Huang, P. J., Vazin, M., Liu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+selection+of+a+new+lanthanide-dependent+DNAzyme+for+ratiometric+sensing+lanthanides%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">In vitro selection of a new lanthanide-dependent DNAzyme for ratiometric sensing lanthanides.</a> Anal. Chem. 86, 9993-9999 (2014).</li>
<li>Chiuman, W., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+fluorescent+sensors+engineered+with+catalytic+DNA+%27MgZ%27+based+on+a+non-classic+allosteric+design%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Simple fluorescent sensors engineered with catalytic DNA 'MgZ' based on a non-classic allosteric design.</a> PLoS One. 2, e1224(2007).</li>
<li>Xiang, Y., Lu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+personal+glucose+meters+and+functional+DNA+sensors+to+quantify+a+variety+of+analytical+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Chem%22%5BJournal%5D)">Using personal glucose meters and functional DNA sensors to quantify a variety of analytical targets.</a> Nat. Chem. 3, 697-703 (2011).</li>
<li>Aguirre, S. D., Ali, M. M., Salena, B. J., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sensitive+DNA+enzyme-based+fluorescent+assay+for+bacterial+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecules%22%5BJournal%5D)">A sensitive DNA enzyme-based fluorescent assay for bacterial detection.</a> Biomolecules. 3, 563-577 (2013).</li>
<li>Aguirre, S. D., Ali, M. M., Kanda, P., Li, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+Bacteria+Using+Fluorogenic+DNAzymes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Detection of Bacteria Using Fluorogenic DNAzymes.</a> J. Vis. Exp. (63), e3961(2012).</li>
<li>Shen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+catalytic+DNA+activated+by+a+specific+strain+of+bacterial+pathogen%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">A catalytic DNA activated by a specific strain of bacterial pathogen.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 54, (2015).</li>
<li>He, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+specific+recognition+of+breast+tumors+by+an+RNA-cleaving+fluorogenic+DNAzyme+probe%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Highly specific recognition of breast tumors by an RNA-cleaving fluorogenic DNAzyme probe.</a> Anal. Chem. 87, 569-577 (2015).</li>
<li>Sumner, J. B., Hand, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isoelectric+point+of+crystalline+urease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Isoelectric point of crystalline urease.</a> J. Am. Chem. Soc. 51, 1255-1260 (1929).</li>
<li>Karplus, P. A., Pearson, M., Hausinger, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((70+Years+of+crystalline+urease%3A+What+have+we+learned%5BTitle%5D)+AND+%22Acc.+Chem.+Res%22%5BJournal%5D)">70 Years of crystalline urease: What have we learned.</a> Acc. Chem. Res. 30, 330-337 (1997).</li>
<li>Omiccioli, E., Amagliani, G., Brandi, G., Magnani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+platform+for+Real-Time+PCR+detection+of+Salmonella+spp.%2C+Listeria+monocytogenes+and+Escherichia+coli+O157+in+milk%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A new platform for Real-Time PCR detection of Salmonella spp., Listeria monocytogenes and Escherichia coli O157 in milk.</a> Food Microbiol. 26, 615-622 (2009).</li>
<li>Cui, S., Schroeder, C. M., Zhang, D. Y., Meng, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+sample+preparation+method+for+PCR-based+detection+of+Escherichia+coli+O157%3AH7+in+ground+beef%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Rapid sample preparation method for PCR-based detection of Escherichia coli O157:H7 in ground beef.</a> J. Appl. Microbiol. 95, 129-134 (2003).</li>
<li>Ibekwe, A. M., Watt, P. M., Grieve, C. M., Sharma, V. K., Lyons, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+fluorogenic+real-time+PCR+for+detection+and+quantification+of+Escherichia+coli+O157%3AH7+in+dairy+wastewater+wetlands%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Multiplex fluorogenic real-time PCR for detection and quantification of Escherichia coli O157:H7 in dairy wastewater wetlands.</a> Appl. Environ. Microbiol. 68, 4853-4862 (2002).</li>
<li>Strachan, N. J., Ogden, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sensitive+microsphere+coagulation+ELISA+for+Escherichia+coli+O157%3AH7+using+Russell%27s+viper+venom%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Lett%22%5BJournal%5D)">A sensitive microsphere coagulation ELISA for Escherichia coli O157:H7 using Russell's viper venom.</a> FEMS Microbiol Lett. 186, 79-84 (2000).</li>
<li>de Boer, E., Beumer, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methodology+for+detection+and+typing+of+foodborne+microorganisms%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Food+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Methodology for detection and typing of foodborne microorganisms.</a> Int. J. Food Microbiol. 50, 119-130 (1999).</li>
<li>Gracias, K. S., McKillip, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+conventional+detection+and+enumeration+methods+for+pathogenic+bacteria+in+food%5BTitle%5D)+AND+%22Can.+J.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A review of conventional detection and enumeration methods for pathogenic bacteria in food.</a> Can. J. Microbiol. 50, 883-890 (2004).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

La traduction de l&#39;action de l&#39;activité ARN de clivage d&#39;une DNAzyme bactérie sensible à un test décisif est rendu possible grâce à l&#39;utilisation de l&#39; uréase et la séparation magnétique, comme illustré par la figure 1. Bien que la démonstration de la mise à l&#39; épreuve modifiée pour la détection bactérienne est fait avec un E. coli dépendante de l&#39; ARN-clivant DNAzyme, 5,19,20 la conception peut généralement être prolongé pour tout ARN clivant DNAzyme. Com...

Les agents pathogènes bactériens sont l’une des principales causes de morbidité et de mortalité dans le monde. Les éclosions d’infections nosocomiales, d’agents pathogènes d’origine alimentaire et de contaminants bactériens dans l’environnement constituent des menaces graves et continues pour la santé et la sécurité publiques. Pour prévenir ces épidémies, il faut des outils efficaces permettant de détecter les agents pathogènes en temps opportun dans divers contextes. Les tests simples, mais toujours efficaces, portables et rentables sont très convoités, en particulier dans les régions qui sont sensibles aux épidémies mais qui ne peuvent pas se permettre des installations de test coûteuses. 1-3 Bien qu’il existe une multitude de méthodes de détection des bactéries, bon nombre d’entre elles ne conviennent pas comme outils de dépistage ou d’analyse sur site, car elles nécessitent de longues durées d’analyse, des instruments coûteux et des procédures d’analyse compliquées. 
Les tests colorimétriques sont particulièrement intéressants pour les applications sur le terrain ou sur le terrain, car les changements de couleur peuvent être facilement détectés à l’œil nu. Le test décisif pour le pH est simple, rapide et efficace. Bien qu’il s’agisse d’une technologie très ancienne, elle est encore largement utilisée aujourd’hui en raison de sa simplicité et de son efficacité. Étonnamment, ce test simple n’avait jamais été modifié pour permettre la détection d’autres analytes avant que nous ne développions récemment une approche de modification de ce test pour le test E. coli. 4
Le test décisif élargi pour E. coli utilise trois composants supplémentaires : un ADN de clivage de l’ARN activé par E. coli (EC1), 5 uréases et des billes magnétiques. Les DNAzymes font référence à des molécules d’ADN monocaténaire synthétiques à activité catalytique. 6 Ils peuvent être isolés à partir de pools d’ADN à séquence aléatoire en utilisant la sélection in vitro. 7,8 Ils sont très stables et peuvent être produits de manière rentable à l’aide d’une synthèse d’ADN automatisée à haut rendement. 9 Pour ces raisons, les DNAzymes, en particulier les DNAzymes clivant l’ARN, ont été largement étudiés pour des applications de biodétection. 6,10,11 Des capteurs d’ADN clivants d’ARN ont été développés pour détecter les ions métalliques,12-16 petites molécules,17,18 les pathogènes bactériens5,19-21 et les cellules cancéreuses. 22 Étant donné la grande disponibilité d’ADNAzymes induits par l’ARN induits par la cible, tout test qui utilise un DNAzyme peut potentiellement être étendu pour détecter une gamme variée d’analytes.
<classe p ='jove_content'> L’uréase est choisie pour sa capacité à hydrolyser l’urée en ammoniac,23,24 entraînant une augmentation du pH. L’uréase est également très efficace, stable et susceptible d’être conjuguée à d’autres biomolécules. Par conséquent, nous avons postulé qu’un conjugué d’un DNAzyme à clivage de l’ARN avec l’uréase permettrait l’utilisation du test décisif pour la détection d’autres cibles. 5
L’action de l’ADN clivage de l’ARN est relayée à l’augmentation du pH médiée par l’uréase grâce à l’utilisation de billes magnétiques qui sont immobilisées avec le conjugué DNAzyme-uréase. Étant donné que l’activité de l’enzyme ADN étudiée dépend strictement de celle d’E. coli, la présence de cette bactérie dans la solution d’essai entraînera la libération d’uréase des billes magnétiques dans la solution, qui est ensuite prélevée et utilisée pour hydrolyser l’urée dans une solution rapporteure contenant un colorant sensible au pH. Le résultat final de cette procédure est un changement de couleur qui peut être facilement signalé par le colorant ou le papier pH.

<table><tbody><tr><td>Acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA)</td><td>VWR AMRESCO</td><td>0105</td><td></td></tr><tr><td>Granules d’hydroxyde de sodium (NaOH)</td><td>BIO BASIC CANADA INC.</td><td>SB6789</td><td></td></tr><tr><td>Tris-base</td><td>VWR AMRESCO</td><td>0497</td><td></td></tr><tr><td>Acide borique</td><td>AMRESCO</td><td>0588</td><td></td></tr><tr><td>Urée</td><td>VWR AMRESCO</td><td>M123</td><td></td></tr><tr><td>40 % acrylamide/bisacrylamide (29:1) solution</td><td>BIO BASIC CANADA INC.</td><td>A0007</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Bioshop Canada inc.</td><td>SUC507</td><td></td></tr><tr><td>Bleu de bromophénol</td><td>Bioshop Canada inc.</td><td>BRO777</td><td></td></tr><tr><td>Xylènecyanol FF</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>X-4126</td><td></td></tr><tr><td>10 % dodécylsulfate de sodium</td><td>Bioshop Canada inc.</td><td>SDS001</td><td></td></tr><tr><td>Acide chlorhydrique (HCl)</td><td>CALEDON LABORATORIES LTD</td><td>6026</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de sodium (NaCl)</td><td>Bioshop Canada inc.</td><td>SOD001</td><td></td></tr><tr><td>Acide 4-(2-hydroxyéthyl)-1-pipérazinéthanesulfonique (HEPES)</td><td>Bioshop Canada inc.</td><td>HEP001</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de magnésium (II) hexahydraté</td><td>VWR AMRESCO</td><td>0288</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Bioshop Canada inc.</td><td>TW508</td><td></td></tr><tr><td>Adénosine triphospahte (ATP)</td><td>AMRESCO</td><td>0220</td><td></td></tr><tr><td>Acétate de sodium trihydraté (NaOAc)</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>S8625</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Éthanol Alcools commerciaux P016EAAN</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tétraméthylèneéthylènediamine (TEMED)</td><td>AMRESCO</td><td>0761</td><td></td></tr><tr><td>10 % Persulfate d’ammonium (APS)</td><td>BIO BASIC CANADA INC.</td><td>AB0072</td><td></td></tr><tr><td>Succinimidyl 4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate (SMCC)</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>22360</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td><td>CALEDON LABORATORIES</td><td>803540</td><td></td></tr><tr><td>Urease</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>U0251</td><td></td></tr><tr><td>1x Saline tamponnée au phosphate (PBS)</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>70011-069</td><td></td></tr><tr><td>0,04 % rouge de phénol</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>P3532</td><td></td></tr><tr><td>10x tampon de réaction polynucléotidique kinase T4</td><td>Lucigen</td><td>30061-1</td><td></td></tr><tr><td>10x tampon de réaction de l’ADN ligase T4</td><td>Bio Basics Canada</td><td>B1122-B</td><td></td></tr><tr><td>ADN ligase T4 (5 U/&#956 ; l)</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>B1122</td><td></td></tr><tr><td>Luria Bertani (LB) Bouillon</td><td>AMRESCO</td><td>J106</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>AMRESCO</td><td>J637</td><td></td></tr><tr><td>T4 polynucléotide kinase (10 U/&#956 ; l)</td><td>Lucigen</td><td>30061-1</td><td></td></tr><tr><td>E. coli K12 (MG1655)</td><td>ATCC</td><td>ATCC700926</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td></td><td></td>392187</tr><tr><td>Plaques de verre</td><td>CBS scientific</td><td>ngp-250nr</td><td></td></tr><tr><td>Entretoises de 0,75 mm</td><td>d’épaisseur CBS scientific</td><td>VGS-0725r</td><td></td></tr><tr><td>Peigne à 12 puits</td><td>CBS scientific</td><td>VGC-7512</td><td></td></tr><tr><td>Lampe UV</td><td>UVP</td><td>95-0017-09</td><td></td></tr><tr><td>Spectrophotomètre (NanoVue)</td><td>GE Healthcare</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Plaque métallique</td><td>CBS scientifique</td><td>CPA165-250</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>VWR International</td><td>58816-123</td><td></td></tr><tr><td>Appareil d’électrophorèse sur gel</td><td>CBS scientific</td><td>ASG-250</td><td></td></tr><tr><td>Boîtes de Pétri</td><td>VWR International</td><td>25384-342</td><td></td></tr><tr><td>100 kDa MWCO filtres centrifuges</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC510024</td><td></td></tr><tr><td>Magnetic Bead (BioMag)</td><td>Bangs Laboratories Inc</td><td>BM568</td><td></td></tr><tr><td>Rack de séparation magnétique</td><td>New England BioLabs</td><td>S1506S</td><td></td></tr><tr><td>Tubes à microfuge</td><td>Sarstedt</td><td>72.69</td><td></td></tr><tr><td>Filtre à seringue (0.22 &#956 ; m)</td><td>VWR International</td><td>28145-501</td><td></td></tr><tr><td>Tube de culture de 14 ml</td><td>VWR International</td><td>60818-725</td><td></td></tr><tr><td>Incubateur de culture cellulaire</td><td>Eppendorf Scientific</td><td>M13520000</td><td></td></tr><tr><td>Branson Nettoyeur à ultrasons</td><td>Branson</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Camera (Canon Powershot G11)</td><td>Canon</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Tube conique de 50 ml</td><td>VWR International</td><td>Référence 89004-364</td><td></td></tr></tbody></table>

détection colorimétrique de bactéries à l&#39;aide de test litmus

Colorimetric Detection of Bacteria Using Litmus Test

Il existe une demande croissante pour des méthodes simples mais toujours efficaces qui peuvent être utilisées pour détecter des agents pathogènes spécifiques pour des applications sur le lieu d’intervention ou sur le terrain. Ces méthodes doivent être conviviales et produire des résultats fiables qui peuvent être facilement interprétés par les spécialistes et les non-professionnels. Le test décisif pour le pH est simple, rapide et efficace car il signale le pH d’un échantillon de test via un simple changement de couleur. Nous avons développé une approche pour tirer parti du test décisif pour la détection bactérienne. La méthode exploite un ADN clivage de l’ARN spécifique à la bactérie pour remplir deux fonctions : reconnaître une bactérie d’intérêt et fournir un mécanisme pour contrôler l’activité de l’uréase. Grâce à l’utilisation de billes magnétiques immobilisées avec un conjugué DNAzyme-uréase, la présence de bactéries dans un échantillon d’essai est relayée à la libération d’uréase des billes à la solution. L’uréase libérée est transférée dans une solution d’essai pour hydrolyser l’urée en ammoniac, ce qui entraîne une augmentation du pH qui peut être visualisée à l’aide du test décisif classique.

Le principe de l&#39;épreuve décisive bactérienne est expliqué dans la Figure 1 Le test utilise trois matériaux clés:. Un DNAzyme ARN-clivant qui est activé par une bactérie spécifique, uréase et des billes magnétiques. La DNAzyme est utilisé comme élément de reconnaissance moléculaire pour obtenir une détection hautement spécifique d&#39;une bactérie d&#39;intérêt. Uréase et des billes magnétiques sont utilisées pour réaliser la transduction du signal de l&#39;activité ...

Nous décrivons un protocole de détection colorimétrique d’E. coli à l’aide d’un test décisif modifié qui tire parti d’un DNAzyme clivant l’ARN, de l’uréase et de billes magnétiques.

Détection colorimétrique de bactéries à l&#39;aide de test Litmus

There are increasing demands for simple but still effective methods that can be used to detect specific pathogens for point-of-care or field applications. ...

L'objectif général de cette expérience est de démontrer un test de litmus modifié simple pour la détection bactérienne. Cette méthode décrit comment une enzyme ADN clivant l'ARN activée par E.coli peut être couplée à une plateforme de transduction de signal basée sur l'uréase afin de produire un changement de couleur en réponse à E.coli. Les deux principaux avantages de cette technique sont la simplicité du test et son applicabilité à d'autres enzymes ADN clivant l'ARN sensibles à divers analytes.La procédure sera démontrée par Seperh Manchehry et Dingran Chang, étudiants diplômés du laboratoire du Dr Yingfu Li à l'Université McMaster. Après avoir préparé les réactifs et les tampons selon le protocole écrit, préparez une solution mère de succinimidyle 4-cyclohexane-1-carboxylate, ou SMCC, en dissolvant un milligramme de SMCC dans 676 microlitres de DMSO. Vortexez et placez sur de la glace jusqu'à utilisation.Dissoudre un milligramme d'uréase dans un millilitre de PBS 1x et placer également sur de la glace jusqu'à utilisation. Pour synthétiser l'ADN d'uréase, ou UrDNA, ajouter 10 microlitres de LD1 à 100 micromolaire dans un tube microfuge de 2,5 millilitres. Ensuite, ajouter 140 microlitres d'eau doublement distillée et 40 microlitres de PBS 10x, puis vortexer.Ensuite, ajoutez 80,5 µL de solution mère de SMCC et 159,5 µL de DMSO. Puis, vortexez à nouveau et effectuez une courte centrifugation à l’aide d’une centrifugeuse de banc. Incubez la réaction à 37 °C dans un incubateur ou sur un bloc chauffant pendant 60 minutes.Après l'incubation, ajouter 200 microlitres de PBS 1x, 60 microlitres d'acétate de sodium à trois molaire et 1,5 millilitre d'éthanol froid à 100 % dans le tube. Mélanger par vortexage et incuber la réaction à moins 20 degrés Celsius pendant 30 minutes. Centrifuger la solution à 20 000 fois g et à quatre degrés Celsius pendant 20 minutes.Ensuite, retirez le surnageant et séchez le culot sous vide. Au culot séché, ajoutez 400 microlitres de solution mère d'uréase et incubez à température ambiante pendant 5 heures. Transférez 200 microlitres du conjugué brut vers une colonne filtrante centrifuge préalablement lavée, avec un seuil de coupure de 100 000 de poids moléculaire.Centrifuger la colonne à 14 000 × g pendant cinq minutes. Transférer les 200 microlitres restants du conjugué brut vers la colonne et centrifuger à 14 000 × g pendant cinq minutes. Ensuite, retirer la colonne et la placer à l’envers dans un nouveau tube de collecte microcentrifuge de deux millilitres.Centrifuger la colonne inversée et le tube à 1 000 × g pendant deux minutes. Après avoir retiré le tube de collecte, ajouter 30 microlitres de PBS 1x sur la colonne centrifuge pour laver la membrane et récupérer davantage de conjugués. Inverser à nouveau la colonne et la remettre dans le tube de collecte.Centrifuger la colonne à 1 000 × g pendant deux minutes. Retirer et jeter la colonne. Conserver l'ADN urinaire à quatre degrés Celsius jusqu'à son utilisation.Pour assembler un ADNzyme clivant l'ARN activé par E.coli, ou EC1, et l'UrDNA sur des billes magnétiques, bien mélanger la solution mère de billes magnétiques et transférer 100 microlitres de suspension de billes dans un tube microcentrifuge de 1,5 millilitre. Ensuite, placer le tube sur un support de rack magnétique pour isoler les billes. Éliminer le surnageant par pipetage et ajouter 150 microlitres de tampon de liaison, ou BB, dans le tube.Retirer le tube du support et taper doucement sur le tube pour redisperser les billes en une solution homogène. Après avoir répété deux fois supplémentaires le lavage avec le BB en maintenant les billes en suspension dans le BB, ajouter 10 microlitres de EC1 à 10 micromolaire. Mélanger délicatement en tapotant le tube.Incuber la solution avec un léger agitation pendant 30 minutes. Pour éviter l'agrégation des billes, tapoter sur le tube toutes les deux à trois minutes. Ensuite, replacer le tube microcentrifuge sur le support magnétique pour isoler les billes et éliminer le surnageant à l’aide d’une pipette.Ensuite, utiliser 150 microlitres de BB pour laver les billes trois fois. Une fois le lavage terminé, resuspendre les billes dans un volume total de 150 microlitres de BB. À cette solution, ajouter 15 microlitres d'UrDNA et chauffer l'échantillon à 45 degrés Celsius pendant deux minutes, puis refroidir la solution à température ambiante et incuber pendant deux heures. Placer à nouveau le tube microcentrifuge sur le support magnétique pour isoler les billes et éliminer le surnageant à l’aide d’une pipette.Ajouter 100 microlitres de tampon de réaction, ou RB, puis retirer le tube du support magnétique et redisperser soigneusement les billes. Après avoir préparé les cellules d’E.coli selon le protocole indiqué, pré-laver un tube microcentrifuge de 1,5 millilitre en ajoutant et en vortexant 100 microlitres de RB. Ensuite, éliminer le tampon. Ajouter 15 microlitres de EC1 assemblé au tube lavé, puis placer le tube sur le support magnétique et aspirer le surnageant.Retirez le tube du support, ajoutez 100 microlitres de RB et re-suspendez soigneusement les billes magnétiques. Après avoir lavé les billes deux fois supplémentaires avec du RB et éliminé le RB, ajoutez 10 microlitres de l'échantillon d’E.coli au tube et mélangez délicatement le contenu en tapotant le tube. Incubez ensuite la réaction à température ambiante pendant une heure.Après l'incubation, ajouter 90 microlitres d'eau doublement distillée et placer le tube sur le support magnétique. Après environ trois minutes de séparation magnétique, transférer soigneusement 85 microlitres du surnageant dans un tube microcentrifuge de 0,5 millilitre. Il est très important de pipeter la solution avec précaution sans prélever les billes magnétiques.Ces billes sont chargées d'uréase et généreront un signal faussement positif. Ajoutez 15 microlitres de rouge de phénol à 0,04 % et 100 microlitres de solution substrat. Ensuite, prenez des photographies à des intervalles de temps spécifiques pour enregistrer le changement de couleur.La couleur initiale du test au tournesol doit être jaune, reflétant un pH de la solution inférieur à 5,5. Si nécessaire, le pH initial du test au tournesol peut être ajusté à l’aide d’un tampon faible, tel qu’un tampon d’acétate de sodium un millimolaire à pH cinq. Cette figure montre les résultats du test bactérien au tournesol, dans lequel l’ADNzyme clivant l’ARN activé par E.coli EC1 a été utilisé comme ADNzyme et le rouge de phénol comme indicateur de pH.Comme le montre l'absence de changement de couleur en l'absence d'E.coli, EC1 est hautement spécifique et présente une activité minimale vis-à-vis d'autres bactéries. L'intensité du changement de couleur dépend à la fois du nombre de cellules d'E.coli utilisé lors de l'étape d'activation du DNAzyme et de la durée accordée à l'hydrolyse de l'urée. Un plus grand nombre de cellules d'E.coli entraîne un changement de couleur plus marqué, tandis qu'une durée plus longue d'hydrolyse de l'urée permet la détection d'un nombre moindre de cellules.Ce graphique montre la variation du pH mesurée à l’aide d’un pH-mètre portatif. La présence de 10⁷ cellules d’E. coli a entraîné une augmentation progressive du pH de trois unités en 10 minutes. En revanche, l’absence d’E. coli n’a pas provoqué de changement de pH détectable dans les mêmes conditions.Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en deux heures si elle est effectuée correctement. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se rappeler que l'uréase est très active, et qu'un mauvais lavage ou une contamination entraînera un faux positif. Après cette procédure, cette méthode peut être utilisée pour tester la présence d'E.coli dans des conditions plus pertinentes, comme lors du contrôle de la qualité de l'eau environnementale.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment tirer parti d'un simple test au papier tournesol pour détecter E.coli. N'oubliez pas que ce test peut être utilisé pour détecter les souches pathogènes d'E.coli, qui sont extrêmement dangereuses. Vous devez suivre une formation en biosécurité avant d'effectuer des tests sur des bactéries pathogènes.

colorimetric-detection-of-bacteria-using-litmus-test

Research

Recherche

JoVE Journal

Biology

Biologie

Une méthode simple pour l'identification de pathogènes bactériens priorité est d'utiliser le phage journaliste génétiquement modifiés. Ces phages journaliste, qui sont spécifiques à leur espèce hôte particulier, sont capables de transduire rapidement une réponse de signal bioluminescent aux cellules hôtes. Nous décrivons ici l'utilisation de phages journaliste pour la détection...

Phage »Bioluminescent&quot; Reporter pour la détection des bactéries pathogènes de la catégorie A

Nous avons récemment rapporté une nouvelle approche pour générer des sondes DNAzyme fluorogènes qui peuvent être appliqués à mettre en place un simple, «mix-and-lire" immunofluorescence pour la détection bactérienne. Ces sondes d'ADN spécifiques catalyser le clivage d'un chromophore de modification d'ADN-ARN substrat chimérique en présence d'un mélange brut extracellulaire (LEC) produite par une bactérie spécifique, traduisant ainsi la détection de bactéries dans la génération du signal de...

Détection des bactéries à l&#39;aide ADNzymes fluorogènes

Nous décrirons une méthode de dosage du capteur électrochimique pour la détection rapide de bactéries et d'identification. L'essai comporte une matrice de capteurs fonctionnalisé avec de l'ADN d'oligonucléotides sondes de capture pour des séquences spécifiques d'espèces d'ARN ribosomique (ARNr). Sandwich hybridation de l'ARNr cible avec la sonde de capture et une sonde de détection d'oligonucléotides d'ADN lié à la peroxydase de raifort produit un courant ampérométrique mesurable.

Bacterial Detection &amp; identification au moyen de capteurs électrochimiques

Cette vidéo décrit un test colorimétrique pour la mesure du lactate dans les lysats cellulaires à l’aide de l’enzyme lactate déshydrogénase. Cette enzyme convertit le lactate en pyruvate, ainsi que la conversion du NAD en NADH qui réagit avec les colorants au tétrazolium et donne un produit coloré qui peut être mesuré spectrophotométriquement pour quantifier le lactate.

Dosage colorimétrique pour la quantification du lactate dans les échantillons d’essai

Cette vidéo présente une méthode de détection colorimétrique d’E. coli, impliquant un biomarqueur d’E. coli activant un DNAzyme, conduisant à un clivage de la liaison ARN et au détachement d’un conjugué DNAzyme-uréase. Un test colorimétrique ultérieur détecte le biomarqueur d’E. coli grâce aux changements de pH induits par l’ammoniac.

Détection colorimétrique d’un biomarqueur bactérien à l’aide d’un test décisif modifié

Cette vidéo démontre la détection bactérienne quantitative multiplexée à l’aide de microsphères de polystyrène magnétique carboxylé teintes en ensembles distincts. La procédure comprend la formation de complexes billes et bactéries, la séparation magnétique et l’analyse en flux, permettant une quantification précise et simultanée de plusieurs bactéries dans le même puits de réaction.

Détection quantitative de bactéries multiplexées à l’aide de microsphères magnétiques marquées à un colorant

Au centre du champ de la pathogenèse bactérienne est la possibilité de définir si et comment les microbes survivent après une exposition à des cellules eucaryotes. Cet article décrit les protocoles pour l'utilisation de colorants fluorescents qui révèlent la viabilité des bactéries individuelles à l'intérieur et associés à des cellules hôtes.

Fluorescence méthodes de microscopie pour déterminer la viabilité des bactéries en association avec des cellules de mammifères

Contrairement à celle observée pour les eucaryotes, il ya un manque d'études qui dépolarisation de la membrane de détail et de la concentration d'ions changements dans les bactéries, principalement que leur petite taille rend les méthodes conventionnelles de mesure difficile. Ici, nous avons des protocoles détaillés pour le suivi de ces événements dans le Gram-positif important agent pathogène Streptococcus pneumoniae en utilisant des techniques de fluorescence.

La surveillance des changements dans la membrane de polarité, Membrane intégrité, et intracellulaires d&#39;ions concentrations dans<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em&gt; Utilisation des colorants fluorescents

Un protocole impliquant la concentration, l’enrichissement et la détection colorimétrique intégrée des agents pathogènes d’origine alimentaire dans de grands volumes d’eau agricole est présenté ici.  L’eau est filtrée à l’aide d’écouvillons Moore modifiés (MMS), enrichis de milieux sélectifs ou non sélectifs, et la détection est effectuée à l’aide de dispositifs analytiques à base de papier (μPAD) intégrés dans des substrats colorimétriques bactériens-indicatifs.

Détection colorimétrique sur papier d’Escherichia coli, de Salmonella spp. et de Listeria monocytogenes dans de grands volumes d’eau agricole

Ici, nous présentons un protocole pour détecter la motilité bactérienne basée sur une réaction de couleur. Les principaux avantages de cette méthode sont qu’elle est facile à évaluer et plus précise, et ne nécessite pas d’équipement spécialisé.

Visualisation de la motilité bactérienne basée sur une réaction de couleur

Découvrez une méthode colorimétrique simple pour détecter E. coli à l'aide d'un test au tournesol modifié et d'une DNAzyme spécifique. Cette technique rapide et accessible permet une détection visible des bactéries en quelques minutes.

Détection colorimétrique de bactéries à l'aide de test Litmus

Explorer plus de vidéos