Name: Détection colorimétrique de bactéries à laide de test Litmus (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 5 s
Description: Découvrez une méthode colorimétrique simple pour détecter E. coli à l'aide d'un test au tournesol modifié et d'une DNAzyme spécifique. Cette technique rapide et accessible permet une détection visible des bactéries en quelques minutes.

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Le financement de ce projet de recherche a été fourni par le Conseil de recherches en sciences naturelles et en génie du Canada (CRSNG) par l’intermédiaire d’une subvention à la découverte accordée à YL.

<ol><li>Daar, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Top+ten+biotechnologies+for+improving+health+in+developing+countries%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Top ten biotechnologies for improving health in developing countries.</a> Nat. Genet. 32, 229-232 (2002).</li>
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<li>Aguirre, S. D., Ali, M. M., Salena, B. J., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sensitive+DNA+enzyme-based+fluorescent+assay+for+bacterial+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecules%22%5BJournal%5D)">A sensitive DNA enzyme-based fluorescent assay for bacterial detection.</a> Biomolecules. 3, 563-577 (2013).</li>
<li>Aguirre, S. D., Ali, M. M., Kanda, P., Li, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+Bacteria+Using+Fluorogenic+DNAzymes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Detection of Bacteria Using Fluorogenic DNAzymes.</a> J. Vis. Exp. (63), e3961(2012).</li>
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<li>He, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+specific+recognition+of+breast+tumors+by+an+RNA-cleaving+fluorogenic+DNAzyme+probe%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Highly specific recognition of breast tumors by an RNA-cleaving fluorogenic DNAzyme probe.</a> Anal. Chem. 87, 569-577 (2015).</li>
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<li>Karplus, P. A., Pearson, M., Hausinger, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((70+Years+of+crystalline+urease%3A+What+have+we+learned%5BTitle%5D)+AND+%22Acc.+Chem.+Res%22%5BJournal%5D)">70 Years of crystalline urease: What have we learned.</a> Acc. Chem. Res. 30, 330-337 (1997).</li>
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<li>Cui, S., Schroeder, C. M., Zhang, D. Y., Meng, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+sample+preparation+method+for+PCR-based+detection+of+Escherichia+coli+O157%3AH7+in+ground+beef%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Rapid sample preparation method for PCR-based detection of Escherichia coli O157:H7 in ground beef.</a> J. Appl. Microbiol. 95, 129-134 (2003).</li>
<li>Ibekwe, A. M., Watt, P. M., Grieve, C. M., Sharma, V. K., Lyons, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+fluorogenic+real-time+PCR+for+detection+and+quantification+of+Escherichia+coli+O157%3AH7+in+dairy+wastewater+wetlands%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Multiplex fluorogenic real-time PCR for detection and quantification of Escherichia coli O157:H7 in dairy wastewater wetlands.</a> Appl. Environ. Microbiol. 68, 4853-4862 (2002).</li>
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<li>de Boer, E., Beumer, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methodology+for+detection+and+typing+of+foodborne+microorganisms%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Food+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Methodology for detection and typing of foodborne microorganisms.</a> Int. J. Food Microbiol. 50, 119-130 (1999).</li>
<li>Gracias, K. S., McKillip, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+conventional+detection+and+enumeration+methods+for+pathogenic+bacteria+in+food%5BTitle%5D)+AND+%22Can.+J.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A review of conventional detection and enumeration methods for pathogenic bacteria in food.</a> Can. J. Microbiol. 50, 883-890 (2004).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

La traduction de l&#39;action de l&#39;activité ARN de clivage d&#39;une DNAzyme bactérie sensible à un test décisif est rendu possible grâce à l&#39;utilisation de l&#39; uréase et la séparation magnétique, comme illustré par la figure 1. Bien que la démonstration de la mise à l&#39; épreuve modifiée pour la détection bactérienne est fait avec un E. coli dépendante de l&#39; ARN-clivant DNAzyme, 5,19,20 la conception peut généralement être prolongé pour tout ARN clivant DNAzyme. Com...

Les agents pathogènes bactériens sont l’une des principales causes de morbidité et de mortalité dans le monde. Les éclosions d’infections nosocomiales, d’agents pathogènes d’origine alimentaire et de contaminants bactériens dans l’environnement constituent des menaces graves et continues pour la santé et la sécurité publiques. Pour prévenir ces épidémies, il faut des outils efficaces permettant de détecter les agents pathogènes en temps opportun dans divers contextes. Les tests simples, mais toujours efficaces, portables et rentables sont très convoités, en particulier dans les régions qui sont sensibles aux épidémies mais qui ne peuvent pas se permettre des installations de test coûteuses. 1-3 Bien qu’il existe une multitude de méthodes de détection des bactéries, bon nombre d’entre elles ne conviennent pas comme outils de dépistage ou d’analyse sur site, car elles nécessitent de longues durées d’analyse, des instruments coûteux et des procédures d’analyse compliquées. 
Les tests colorimétriques sont particulièrement intéressants pour les applications sur le terrain ou sur le terrain, car les changements de couleur peuvent être facilement détectés à l’œil nu. Le test décisif pour le pH est simple, rapide et efficace. Bien qu’il s’agisse d’une technologie très ancienne, elle est encore largement utilisée aujourd’hui en raison de sa simplicité et de son efficacité. Étonnamment, ce test simple n’avait jamais été modifié pour permettre la détection d’autres analytes avant que nous ne développions récemment une approche de modification de ce test pour le test E. coli. 4
Le test décisif élargi pour E. coli utilise trois composants supplémentaires : un ADN de clivage de l’ARN activé par E. coli (EC1), 5 uréases et des billes magnétiques. Les DNAzymes font référence à des molécules d’ADN monocaténaire synthétiques à activité catalytique. 6 Ils peuvent être isolés à partir de pools d’ADN à séquence aléatoire en utilisant la sélection in vitro. 7,8 Ils sont très stables et peuvent être produits de manière rentable à l’aide d’une synthèse d’ADN automatisée à haut rendement. 9 Pour ces raisons, les DNAzymes, en particulier les DNAzymes clivant l’ARN, ont été largement étudiés pour des applications de biodétection. 6,10,11 Des capteurs d’ADN clivants d’ARN ont été développés pour détecter les ions métalliques,12-16 petites molécules,17,18 les pathogènes bactériens5,19-21 et les cellules cancéreuses. 22 Étant donné la grande disponibilité d’ADNAzymes induits par l’ARN induits par la cible, tout test qui utilise un DNAzyme peut potentiellement être étendu pour détecter une gamme variée d’analytes.
<classe p ='jove_content'> L’uréase est choisie pour sa capacité à hydrolyser l’urée en ammoniac,23,24 entraînant une augmentation du pH. L’uréase est également très efficace, stable et susceptible d’être conjuguée à d’autres biomolécules. Par conséquent, nous avons postulé qu’un conjugué d’un DNAzyme à clivage de l’ARN avec l’uréase permettrait l’utilisation du test décisif pour la détection d’autres cibles. 5
L’action de l’ADN clivage de l’ARN est relayée à l’augmentation du pH médiée par l’uréase grâce à l’utilisation de billes magnétiques qui sont immobilisées avec le conjugué DNAzyme-uréase. Étant donné que l’activité de l’enzyme ADN étudiée dépend strictement de celle d’E. coli, la présence de cette bactérie dans la solution d’essai entraînera la libération d’uréase des billes magnétiques dans la solution, qui est ensuite prélevée et utilisée pour hydrolyser l’urée dans une solution rapporteure contenant un colorant sensible au pH. Le résultat final de cette procédure est un changement de couleur qui peut être facilement signalé par le colorant ou le papier pH.

<table><tbody><tr><td>Acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA)</td><td>VWR AMRESCO</td><td>0105</td><td></td></tr><tr><td>Granules d’hydroxyde de sodium (NaOH)</td><td>BIO BASIC CANADA INC.</td><td>SB6789</td><td></td></tr><tr><td>Tris-base</td><td>VWR AMRESCO</td><td>0497</td><td></td></tr><tr><td>Acide borique</td><td>AMRESCO</td><td>0588</td><td></td></tr><tr><td>Urée</td><td>VWR AMRESCO</td><td>M123</td><td></td></tr><tr><td>40 % acrylamide/bisacrylamide (29:1) solution</td><td>BIO BASIC CANADA INC.</td><td>A0007</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Bioshop Canada inc.</td><td>SUC507</td><td></td></tr><tr><td>Bleu de bromophénol</td><td>Bioshop Canada inc.</td><td>BRO777</td><td></td></tr><tr><td>Xylènecyanol FF</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>X-4126</td><td></td></tr><tr><td>10 % dodécylsulfate de sodium</td><td>Bioshop Canada inc.</td><td>SDS001</td><td></td></tr><tr><td>Acide chlorhydrique (HCl)</td><td>CALEDON LABORATORIES LTD</td><td>6026</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de sodium (NaCl)</td><td>Bioshop Canada inc.</td><td>SOD001</td><td></td></tr><tr><td>Acide 4-(2-hydroxyéthyl)-1-pipérazinéthanesulfonique (HEPES)</td><td>Bioshop Canada inc.</td><td>HEP001</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de magnésium (II) hexahydraté</td><td>VWR AMRESCO</td><td>0288</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Bioshop Canada inc.</td><td>TW508</td><td></td></tr><tr><td>Adénosine triphospahte (ATP)</td><td>AMRESCO</td><td>0220</td><td></td></tr><tr><td>Acétate de sodium trihydraté (NaOAc)</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>S8625</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Éthanol Alcools commerciaux P016EAAN</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tétraméthylèneéthylènediamine (TEMED)</td><td>AMRESCO</td><td>0761</td><td></td></tr><tr><td>10 % Persulfate d’ammonium (APS)</td><td>BIO BASIC CANADA INC.</td><td>AB0072</td><td></td></tr><tr><td>Succinimidyl 4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate (SMCC)</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>22360</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td><td>CALEDON LABORATORIES</td><td>803540</td><td></td></tr><tr><td>Urease</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>U0251</td><td></td></tr><tr><td>1x Saline tamponnée au phosphate (PBS)</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>70011-069</td><td></td></tr><tr><td>0,04 % rouge de phénol</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>P3532</td><td></td></tr><tr><td>10x tampon de réaction polynucléotidique kinase T4</td><td>Lucigen</td><td>30061-1</td><td></td></tr><tr><td>10x tampon de réaction de l’ADN ligase T4</td><td>Bio Basics Canada</td><td>B1122-B</td><td></td></tr><tr><td>ADN ligase T4 (5 U/&#956 ; l)</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>B1122</td><td></td></tr><tr><td>Luria Bertani (LB) Bouillon</td><td>AMRESCO</td><td>J106</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>AMRESCO</td><td>J637</td><td></td></tr><tr><td>T4 polynucléotide kinase (10 U/&#956 ; l)</td><td>Lucigen</td><td>30061-1</td><td></td></tr><tr><td>E. coli K12 (MG1655)</td><td>ATCC</td><td>ATCC700926</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td></td><td></td>392187</tr><tr><td>Plaques de verre</td><td>CBS scientific</td><td>ngp-250nr</td><td></td></tr><tr><td>Entretoises de 0,75 mm</td><td>d’épaisseur CBS scientific</td><td>VGS-0725r</td><td></td></tr><tr><td>Peigne à 12 puits</td><td>CBS scientific</td><td>VGC-7512</td><td></td></tr><tr><td>Lampe UV</td><td>UVP</td><td>95-0017-09</td><td></td></tr><tr><td>Spectrophotomètre (NanoVue)</td><td>GE Healthcare</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Plaque métallique</td><td>CBS scientifique</td><td>CPA165-250</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>VWR International</td><td>58816-123</td><td></td></tr><tr><td>Appareil d’électrophorèse sur gel</td><td>CBS scientific</td><td>ASG-250</td><td></td></tr><tr><td>Boîtes de Pétri</td><td>VWR International</td><td>25384-342</td><td></td></tr><tr><td>100 kDa MWCO filtres centrifuges</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC510024</td><td></td></tr><tr><td>Magnetic Bead (BioMag)</td><td>Bangs Laboratories Inc</td><td>BM568</td><td></td></tr><tr><td>Rack de séparation magnétique</td><td>New England BioLabs</td><td>S1506S</td><td></td></tr><tr><td>Tubes à microfuge</td><td>Sarstedt</td><td>72.69</td><td></td></tr><tr><td>Filtre à seringue (0.22 &#956 ; m)</td><td>VWR International</td><td>28145-501</td><td></td></tr><tr><td>Tube de culture de 14 ml</td><td>VWR International</td><td>60818-725</td><td></td></tr><tr><td>Incubateur de culture cellulaire</td><td>Eppendorf Scientific</td><td>M13520000</td><td></td></tr><tr><td>Branson Nettoyeur à ultrasons</td><td>Branson</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Camera (Canon Powershot G11)</td><td>Canon</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Tube conique de 50 ml</td><td>VWR International</td><td>Référence 89004-364</td><td></td></tr></tbody></table>

détection colorimétrique de bactéries à l&#39;aide de test litmus

Colorimetric Detection of Bacteria Using Litmus Test

Il existe une demande croissante pour des méthodes simples mais toujours efficaces qui peuvent être utilisées pour détecter des agents pathogènes spécifiques pour des applications sur le lieu d’intervention ou sur le terrain. Ces méthodes doivent être conviviales et produire des résultats fiables qui peuvent être facilement interprétés par les spécialistes et les non-professionnels. Le test décisif pour le pH est simple, rapide et efficace car il signale le pH d’un échantillon de test via un simple changement de couleur. Nous avons développé une approche pour tirer parti du test décisif pour la détection bactérienne. La méthode exploite un ADN clivage de l’ARN spécifique à la bactérie pour remplir deux fonctions : reconnaître une bactérie d’intérêt et fournir un mécanisme pour contrôler l’activité de l’uréase. Grâce à l’utilisation de billes magnétiques immobilisées avec un conjugué DNAzyme-uréase, la présence de bactéries dans un échantillon d’essai est relayée à la libération d’uréase des billes à la solution. L’uréase libérée est transférée dans une solution d’essai pour hydrolyser l’urée en ammoniac, ce qui entraîne une augmentation du pH qui peut être visualisée à l’aide du test décisif classique.

Le principe de l&#39;épreuve décisive bactérienne est expliqué dans la Figure 1 Le test utilise trois matériaux clés:. Un DNAzyme ARN-clivant qui est activé par une bactérie spécifique, uréase et des billes magnétiques. La DNAzyme est utilisé comme élément de reconnaissance moléculaire pour obtenir une détection hautement spécifique d&#39;une bactérie d&#39;intérêt. Uréase et des billes magnétiques sont utilisées pour réaliser la transduction du signal de l&#39;activité ...

Nous décrivons un protocole de détection colorimétrique d’E. coli à l’aide d’un test décisif modifié qui tire parti d’un DNAzyme clivant l’ARN, de l’uréase et de billes magnétiques.

Détection colorimétrique de bactéries à l&#39;aide de test Litmus

There are increasing demands for simple but still effective methods that can be used to detect specific pathogens for point-of-care or field applications. ...

L'objectif général de cette expérience est de démontrer un test de litmus modifié simple pour la détection bactérienne. Cette méthode décrit comment une enzyme ADN clivant l'ARN activée par E.coli peut être couplée à une plateforme de transduction de signal basée sur l'uréase afin de produire un changement de couleur en réponse à E.coli. Les deux principaux avantages de cette technique sont la simplicité du test et son applicabilité à d'autres enzymes ADN clivant l'ARN sensibles à divers analytes.La procédure sera démontrée par Seperh Manchehry et Dingran Chang, étudiants diplômés du laboratoire du Dr Yingfu Li à l'Université McMaster. Après avoir préparé les réactifs et les tampons selon le protocole écrit, préparez une solution mère de succinimidyle 4-cyclohexane-1-carboxylate, ou SMCC, en dissolvant un milligramme de SMCC dans 676 microlitres de DMSO. Vortexez et placez sur de la glace jusqu'à utilisation.Dissoudre un milligramme d'uréase dans un millilitre de PBS 1x et placer également sur de la glace jusqu'à utilisation. Pour synthétiser l'ADN d'uréase, ou UrDNA, ajouter 10 microlitres de LD1 à 100 micromolaire dans un tube microfuge de 2,5 millilitres. Ensuite, ajouter 140 mi

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Une méthode simple pour l'identification de pathogènes bactériens priorité est d'utiliser le phage journaliste génétiquement modifiés. Ces phages journaliste, qui sont spécifiques à leur espèce hôte particulier, sont capables de transduire rapidement une réponse de signal bioluminescent aux cellules hôtes. Nous décrivons ici l'utilisation de phages journaliste pour la détection...

Phage »Bioluminescent&quot; Reporter pour la détection des bactéries pathogènes de la catégorie A

Nous avons récemment rapporté une nouvelle approche pour générer des sondes DNAzyme fluorogènes qui peuvent être appliqués à mettre en place un simple, «mix-and-lire" immunofluorescence pour la détection bactérienne. Ces sondes d'ADN spécifiques catalyser le clivage d'un chromophore de modification d'ADN-ARN substrat chimérique en présence d'un mélange brut extracellulaire (LEC) produite par une bactérie spécifique, traduisant ainsi la détection de bactéries dans la génération du signal de...

Détection des bactéries à l&#39;aide ADNzymes fluorogènes

Nous décrirons une méthode de dosage du capteur électrochimique pour la détection rapide de bactéries et d'identification. L'essai comporte une matrice de capteurs fonctionnalisé avec de l'ADN d'oligonucléotides sondes de capture pour des séquences spécifiques d'espèces d'ARN ribosomique (ARNr). Sandwich hybridation de l'ARNr cible avec la sonde de capture et une sonde de détection d'oligonucléotides d'ADN lié à la peroxydase de raifort produit un courant ampérométrique mesurable.

Bacterial Detection &amp; identification au moyen de capteurs électrochimiques

Cette vidéo décrit un test colorimétrique pour la mesure du lactate dans les lysats cellulaires à l’aide de l’enzyme lactate déshydrogénase. Cette enzyme convertit le lactate en pyruvate, ainsi que la conversion du NAD en NADH qui réagit avec les colorants au tétrazolium et donne un produit coloré qui peut être mesuré spectrophotométriquement pour quantifier le lactate.

Dosage colorimétrique pour la quantification du lactate dans les échantillons d’essai

Cette vidéo présente une méthode de détection colorimétrique d’E. coli, impliquant un biomarqueur d’E. coli activant un DNAzyme, conduisant à un clivage de la liaison ARN et au détachement d’un conjugué DNAzyme-uréase. Un test colorimétrique ultérieur détecte le biomarqueur d’E. coli grâce aux changements de pH induits par l’ammoniac.

Détection colorimétrique d’un biomarqueur bactérien à l’aide d’un test décisif modifié

Cette vidéo démontre la détection bactérienne quantitative multiplexée à l’aide de microsphères de polystyrène magnétique carboxylé teintes en ensembles distincts. La procédure comprend la formation de complexes billes et bactéries, la séparation magnétique et l’analyse en flux, permettant une quantification précise et simultanée de plusieurs bactéries dans le même puits de réaction.

Détection quantitative de bactéries multiplexées à l’aide de microsphères magnétiques marquées à un colorant

Au centre du champ de la pathogenèse bactérienne est la possibilité de définir si et comment les microbes survivent après une exposition à des cellules eucaryotes. Cet article décrit les protocoles pour l'utilisation de colorants fluorescents qui révèlent la viabilité des bactéries individuelles à l'intérieur et associés à des cellules hôtes.

Fluorescence méthodes de microscopie pour déterminer la viabilité des bactéries en association avec des cellules de mammifères

Contrairement à celle observée pour les eucaryotes, il ya un manque d'études qui dépolarisation de la membrane de détail et de la concentration d'ions changements dans les bactéries, principalement que leur petite taille rend les méthodes conventionnelles de mesure difficile. Ici, nous avons des protocoles détaillés pour le suivi de ces événements dans le Gram-positif important agent pathogène Streptococcus pneumoniae en utilisant des techniques de fluorescence.

La surveillance des changements dans la membrane de polarité, Membrane intégrité, et intracellulaires d&#39;ions concentrations dans<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em&gt; Utilisation des colorants fluorescents

Un protocole impliquant la concentration, l’enrichissement et la détection colorimétrique intégrée des agents pathogènes d’origine alimentaire dans de grands volumes d’eau agricole est présenté ici.  L’eau est filtrée à l’aide d’écouvillons Moore modifiés (MMS), enrichis de milieux sélectifs ou non sélectifs, et la détection est effectuée à l’aide de dispositifs analytiques à base de papier (μPAD) intégrés dans des substrats colorimétriques bactériens-indicatifs.

Détection colorimétrique sur papier d’Escherichia coli, de Salmonella spp. et de Listeria monocytogenes dans de grands volumes d’eau agricole

Ici, nous présentons un protocole pour détecter la motilité bactérienne basée sur une réaction de couleur. Les principaux avantages de cette méthode sont qu’elle est facile à évaluer et plus précise, et ne nécessite pas d’équipement spécialisé.

Visualisation de la motilité bactérienne basée sur une réaction de couleur

Découvrez une méthode colorimétrique simple pour détecter E. coli à l'aide d'un test au tournesol modifié et d'une DNAzyme spécifique. Cette technique rapide et accessible permet une détection visible des bactéries en quelques minutes.

Détection colorimétrique de bactéries à l'aide de test Litmus

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