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L'objectif général de cette expérience est d'étudier les conséquences sur l'intégrité et la perméabilité des cellules endothéliales suite à leur interaction avec des lymphocytes T activés. Cette méthode permet de répondre à des questions clés dans le domaine de la neuro-immunologie, telles que : comment l'interaction directe entre les lymphocytes T et les cellules endothéliales affecte-t-elle l'intégrité et la perméabilité de la barrière hémato-encéphalique ? Le principal avantage de cette technique est qu'elle permet une évaluation automatisée et en temps réel de la fonction barrière lors d'une modulation ciblée de l'interaction entre les lymphocytes T et les cellules endothéliales.

Les implications de cette technique s'étendent à la thérapie des troubles auto-immuns du SNC, car elle permet de mieux comprendre la rupture de la barrière hémato-encéphalique médiée par les lymphocytes T, une étape cruciale dans la pathogenèse de ces maladies. Cette méthode se concentre sur les propriétés de la barrière hémato-encéphalique marine durant l'EAE. Toutefois, elle peut également être appliquée à des modèles de barrière hémato-encéphalique rouge ou humaine, ainsi qu'à l'étude d'autres troubles auto-immuns du SNC.

En général, les personnes novices dans cette méthode peuvent éprouver des difficultés en raison de problèmes potentiels liés au moment optimal pour combiner la culture primaire de cellules endothéliales et l'activation des lymphocytes T. Nous avons initialement mis au point cette méthode lorsque nous avons entrepris d'étudier les effets de différents niveaux d'activation des lymphocytes T sur les propriétés de la barrière hémato-encéphalique durant l'EAE, un modèle animal de la sclérose en plaques. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car la mise en place de co-cultures de lymphocytes T et de cellules endothéliales est difficile à apprendre, étant donné que des variations initiales de T entre les puits pourraient entraîner par la suite une mauvaise interprétation des résultats.

Pour commencer cette procédure, au cinquième jour suivant l'isolement des MBMEC, prérecouvrir les inserts perméables avec 80 microlitres de solution de recouvrement des MBMEC par insert. Incuber à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant trois heures. Après avoir retiré la solution de recouvrement des MBMEC des inserts, laver les MBMEC en ajoutant deux millilitres de PBS à température ambiante dans chaque puits, puis en aspirant après une minute, et répéter cette opération une fois supplémentaire.

Ensuite, ajouter 0,05 % de trypsine-EDTA, soit 300 microlitres par puits, et incuber de cinq à dix minutes. Puis, ajouter deux millilitres de milieu MBMEC dans chaque puits pour arrêter la trypsination. Transférer ensuite les cellules recueillies dans un tube de centrifugation de 15 millilitres et centrifuger l'échantillon à 700 ×g pendant huit minutes à quatre degrés Celsius.

Après huit minutes, éliminer le surnageant et resuspendre les cellules dans un millilitre de milieu MBMEC sans puromycine. Pour compter les cellules, mélanger 90 microlitres de bleu de trypan à 0,04 % avec 10 microlitres de suspension cellulaire, puis pipeter 10 microlitres du mélange entre la lame couvre-objet en verre et la cellule de comptage.

Ensuite, placer deux fois 10 à la puissance quatre cellules par insert. Ajouter 810 microlitres de milieu MBMEC dans le compartiment inférieur de chaque puits et placer la plaque avec les inserts dans l'incubateur jusqu'au moment de procéder à la mesure de la résistance transépithéliale (TEER). Pour stimuler les lymphocytes T CD4 positifs, prérecouvrir une plaque 96 puits à fond rond avec un anticorps anti-CD3 murin purifié à une concentration finale souhaitée pendant trois heures à 37 degrés Celsius.

Après avoir isolé les lymphocytes T, laver la plaque prérecouverte deux fois avec du PBS. Ensuite, ajouter l'anticorps anti-CD28 purifié aux lymphocytes T isolés à une concentration finale souhaitée et mélanger soigneusement. Puis, incuber les lymphocytes T et les laisser à 37 degrés Celsius pendant deux à trois jours.

Pour configurer la mesure de la résistance transépithéliale (TEER), placez le module 24 puits de l'appareil TEER dans la hotte à flux laminaire. Retirez les couvercles et placez les inserts contenant les MBMEC dans l'appareil à l'aide de pinces. Ensuite, pipetez 810 microlitres de milieu frais dans le compartiment inférieur des puits du module, en ajoutant soigneusement le milieu entre l'insert et la paroi du puits du module.

Ensuite, fermez les couvercles et placez l'appareil dans l'incubateur. Connectez l'appareil à l'ordinateur. Puis, allumez le contrôleur de l'appareil et ouvrez le logiciel.

Dans la fenêtre contextuelle, sélectionnez « Nouvelle mesure », cochez les cases « Afficher TER » et « Afficher Ccl », puis appuyez sur Démarrer. Après avoir terminé la première mesure, sélectionnez « Cocher tous les puits » dans l'onglet Résultats pour afficher toutes les valeurs de TEER et de Ccl.

Ensuite, enregistrez le fichier. Puis, choisissez le point temporel pour co-cultiver les MBMEC avec les lymphocytes T lorsque le Ccl est stable et inférieur à un microfarad par centimètre carré et que la résistance transépithéliale (TEER) a atteint son niveau maximal. Examinez attentivement les valeurs absolues de TEER et de Ccl, et excluez les puits dans lesquels les MBMEC n'ont pas formé de monocouche suffisamment confluente en décochant ces puits.

Regroupez les autres puits en cliquant avec le bouton droit sur les puits et en sélectionnant « ajouter le puit à un nouveau puit moyen ». Nommez-le dans la fenêtre contextuelle et faites de même pour tous les puits individuels à regrouper. Ensuite, vérifiez tous les puits moyens pour vous assurer qu’ils ont tous les mêmes conditions initiales avant la co-culture. Dans l’onglet expérience, appuyez sur pause.

Déconnectez l'appareil et sortez-le de l'incubateur. Ensuite, retirez les couvercles dans le flux laminaire. Puis, retirez une partie du milieu de l'insert situé dans le compartiment supérieur.

Ajouter les lymphocytes T aux MBMEC en pipetant soigneusement 150 microlitres de milieu. Ensuite, reconnecter l'appareil et appuyer sur reprendre la mesure. Après 24 heures, appuyer sur arrêter dans l'onglet expérience et enregistrer le fichier.

On observe ici la morphologie en fuseau visible à l'issue de la coloration immunofluorescente de PECAM-1 et de Cldn-5, cinq jours après l'isolement des MBMEC. Voici les valeurs de résistance transendothéliale (TEER) et de Ccl avant et après regroupement des puits individuels, préalablement à l'ajout des lymphocytes T. La courbe bleue n'est pas utilisée pour l'expérience, car les MBMEC de ce puit n'ont pas développé une résistance transendothéliale aussi élevée que dans les autres puits.

Dans cette expérience, des lymphocytes T CD4 positifs spécifiques marqués, au nombre de 35 à 55, ont été stimulés de manière antigène-spécifique pendant cinq jours. Les lymphocytes T naïfs et les cytokines pro-inflammatoires, interféron gamma et TNF-alpha, ont servi respectivement de contrôle négatif et positif. Ici, les lymphocytes T ont été stimulés par la même quantité d'anticorps anti-CD3 et anti-CD28, et ceux cultivés pendant trois jours ont montré une propension accrue à la perturbation de la barrière par rapport aux lymphocytes T cultivés seulement deux jours.

Les résultats montrent ici que les lymphocytes T stimulés, mais pas leurs surnageants, provoquent des lésions importantes des MBMEC, indiquant que le contact direct entre les lymphocytes T et les MBMEC est essentiel à la rupture de la barrière. D'autre part, l'ajout de l'inhibiteur de la granzyme B deux à la culture de lymphocytes T restaure l'intégrité des MBMEC dans une mesure plus importante, désignant la molécule cytolytique comme un acteur important dans les lésions des MBMEC et la diminution subséquente de la résistance transépithéliale (TEER). Une fois maîtrisée, cette expérience peut être réalisée en 12 jours si elle est correctement effectuée. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de bien choisir le point temporel adéquat pour mettre en place la co-culture des lymphocytes T et des cellules endothéliales.

Après cette procédure, d'autres essais peuvent être utilisés, tels que la microscopie en immunofluorescence, la cytométrie en flux et les essais de probabilité. Afin de répondre à d'autres questions, comme : Comment cette interaction affecte-t-elle l'expression des molécules des jonctions serrées, la perméabilité et l'ampleur de la transmigration des lymphocytes T ? Après son développement, cette technique a permis aux chercheurs dans le domaine de la neuro-immunologie d'étudier les troubles auto-immuns du SNC chez la souris.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne idée de la manière d'évaluer les effets directs entre les lymphocytes T activés et les cellules endothéliales en ce qui concerne l'intégrité et la perméabilité de la barrière hémato-encéphalique.