Name: La production de cellules souches pluripotentes de souris amniotique Cellules Fluid Utilisation dun système de transposon (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 24 s
Description: Découvrez la génération de cellules souches pluripotentes induites à partir de cellules de liquide amniotique murin en utilisant un système de transposon non viral. Cette méthode offre une approche sécurisée pour la médecine régénérative.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ce travail a été soutenu par la Fondation CARIPARO Subvention numéro 13/04 et Fondazione Istituto di Ricerca Pediatrica Città della Speranza Bourse numéro 10/02. Martina Piccoli, Chiara Franzin et Michela Pozzobon sont financées par la Fondazione Istituto di Ricerca Pediatrica Città della Speranza. Enrica Bertin est financée par la Fondation CARIPARO Bourse numéro 13/04. Paolo De Coppi est financé par la Great Ormond Street Hospital Children’s Charity.

Toutes les procédures étaient conformes à la loi italienne. échantillons murin AF ont été récoltées à partir de souris enceintes à 13,5 jours après le coït (dpc) à partir de C57BL / 6-Tg souris (UBC-GFP) 30Scha / J appelé GFP. 1. transposon production REMARQUE: transposon des vecteurs d&#39;expression ont été générés en utilisant des procédures de clonage standard. L&#39;ADN plasmidique pour la transfection des cellules de souris AF a été préparé à l&#39;aide de kits commerciaux. <ol><li> Mélanger 10 ng d&#39;ADN plasmidique avec 50 ul de bactéries DH5a dans un tube de 1,5 ml. Laisser incuber le microtube sur la glace pendant 20 min. </li><li> Le choc thermique à 42 ° C pendant 40 secondes. </li><li> Placez microtube sur la glace pendant 2 min. </li><li> Ajouter 250 pi de (37 ° C) de bouillon de lysogénie (LB) de bouillon préchauffé. Agiter (300 tours par minute) à 37 ° C pendant 30 min. </li><li> Étaler 30 pi de chaque transformation sur des plaques LB avec 0,1 mg / ml d&#39;ampicilline. Laisser les plaques sécher et incuber inversées à 37 ° C overnight. </li><li> Le lendemain, dans l&#39;après-midi, ramasser 3 colonies, en utilisant stériles 200 conseils ul, de chaque transformation et transfert sur 0,1 mg / ml LB amp. </li><li> Agiter (300 rpm) bactéries pendant une nuit à 37 ° C. </li><li> Pour la purification plasmidique utiliser des kits commerciaux. plasmides de stock à -20 ° C. </li></ol> 2. Souris Embryonic Fibroblast (MEF) Culture <ol><li> Revêtement des 6 puits Plaques avec 0,1% Gélatine <ol><li> Plaques de manteau sous le capot en ajoutant 1 ml de gélatine à 0,1% stérile à chacun des six puits. Laissez la gélatine polymériser sur l&#39;incubateur (37 ° C) pendant 1 h. </li><li> Jeter l&#39;excès, et sécher les plaques pendant 1 h. </li><li> Utilisez parafilm pour sceller et plaques de magasin à la température ambiante. </li></ol></li><li> Inactivation du MEF avec mitomycine C <ol><li> Décongelez un flacon de 4 x 10 6 cellules MEF utilisant un bain à 37 °. </li><li> Graine MEF dans la hotte sur une boîte de Pétri (150 mm) avec un milieu MEF. </li><li> Cultiver les cellules à 37 ° C et 5% de CO 2. </li><li> (ATTENTION) Ajouter mitomycine C (5 mg / ml) lorsque les cellules sont confluentes. </li><li> Placer les cellules dans un incubateur (37 ° C et 5% de CO2) pendant 3 h. </li><li> Éliminer le milieu avec les cellules de la mitomycine C. Laver trois fois avec une solution saline de tampon phosphate 1X (PBS). </li><li> Ajouter 2 ml de cellules de trypsine et de placer dans le commerce 37 ° C incubateur pendant 5 min. Après, ajouter 18 ml de blocage moyen pour arrêter la réaction de la trypsine. </li><li> Compter les cellules à l&#39;aide d&#39;une chambre de Burker selon le protocole du fabricant. </li><li> Centrifuger les cellules à 145 g pendant 5 min. Jeter le surnageant. </li><li> Seed 60.000 cellules / cm 2 de inactivé MEF sur 0,1% gélatine plaques revêtues. </li><li> Cultiver des cellules pendant 24 h à 37 ° C et 5% de CO 2, avant le semis AF et / ou cellules iPS-AF. </li></ol></li></ol> 3. Souris AF cellule d&#39;isolement <ol><li> Mettre en place des accouplements chronométrés et vérifier plu vaginalegs après 24 h de co-logement. </li><li> Observer jusqu&#39;à 13,5 dpc et sacrifier barrage enceinte par dislocation cervicale. </li><li> Nettoyer la paroi abdominale de l&#39;animal en utilisant 70% d&#39;éthanol. </li><li> En utilisant des ciseaux, réaliser une laparotomie médiane inciser la longueur de la paroi abdominale pour accéder à la cavité abdominale. </li><li> Exposer l&#39;utérus en utilisant une pince. Retirer l&#39;utérus à l&#39;aide de ciseaux et de transfert dans un plat de 100 mm de Pétri remplie de stérile 1x PBS placé sur la glace. </li><li> Utilisez un stéréomicroscope pour recueillir l&#39;AF au grossissement 10X. </li><li> Tenir l&#39;utérus avec une pince et enlever la paroi utérine avec des ciseaux. Faites attention à ne pas endommager les membranes fœtales et une fuite de liquide amniotique conséquente. </li><li> Collecter les fœtus dans un plat de 100 mm de Pétri remplie de stériles 1x PBS et placer sur la glace. </li><li> Saisir le placenta d&#39;un foetus avec une pince fine de point et les placer dans un endroit propre 100 mm boîte de Pétri. </li><li> Retirer le jaune sac en utilisant pince fine de point. </li><li&gt; Perturber l&#39;amnios en utilisant pince fine de point et de recueillir 30 pl de AF pour chaque foetus en utilisant une seringue d&#39;insuline dans 15 ml flacon conique. </li><li> Après la collecte AF, laver chaque fœtus 1x stérile PBS supplémenté avec du sérum de 1% de veau fœtal (FBS) et de recueillir dans les 15 ml tube conique contenant l&#39;AF. </li><li> Centrifugeuse AF à 145 xg pendant 5 min. Retirer le surnageant sous le capot et épépiner les cellules AF granulées. </li></ol> 4. Souris AF Culture cellulaire <ol><li> Ensemencement des cellules AF souris <ol><li> Un jour avant le semis, préparer une gélatine à revêtement plaque de 6 puits 0,1% avec MEF mitomycine C-traitée. </li><li> Après la collecte AF, ensemencer les cellules obtenues à partir d&#39; une amniocentèse (environ 1 x 10 7 cellules obtenues à partir de 6 fœtus) sur le MEF mitotique inactivé en utilisant un milieu de culture AF. </li><li> Cultiver les cellules à 37 ° C et 5% de CO 2, en changeant le milieu tous les deux jours. </li><li> Après 7 jours de culture, transcellules fet AF suivant la procédure décrite ci-dessous. </li></ol></li></ol> 5. Transfection, iPS-AF cellulaire Génération et culture REMARQUE: Les cellules AF souris ont été transfectées avec le plasmide transposon PB-tetO2-IRES-OKMS, en liaison avec un plasmide d&#39;expression de la transposase (mPBase) et avec le transactivateur de tetracycline inverse (PB-ACG-rtTA) transposon plasmide. Tous les plasmides ont été fournis par le professeur Andras Nagy 33. <ol><li> Mélanger 1 pg de PB-tetO2-IRES-OKMS avec 0,5 pg de mPBase et 0,5 pg de PB-CAG-rtTA (ADN total: 2 pg) dans un tube de 1,5 ml. </li><li> Diluer l&#39;ADN à 100 ul avec du milieu sans sérum (milieu de Eagle modifié par Dulbecco - DMEM). </li><li> Ajouter 8 ul du réactif de transfection (par exemple, FUGENE) (au rapport de l&#39; ADN plasmidique: agent de transfection de 2 ug (ADN) à 8 ul agent de transfection) dans l&#39;ADN contenant 1,5 ml microtube. </li><li> Laisser incuber le mélange réactif / ADN de transfection pendant 15 minutes à température ambiante. </li><li> Ajouter goutte à goutte 100 ul du mélange réactif de transfection / ADN par puits dans une plaque à 6 puits avec des cellules de souris AF et à distribuer par tourbillonnement doux, avec un volume final de 2 ml / puits. Laisser pendant 24 h. </li><li> Le lendemain, induisent l&#39;expression des facteurs de la Yamanaka (Oct4, Klf4, cMyc, Sox2) en alimentant les cellules avec du milieu frais iPS-AF complété avec 1,5 pg / ml de doxycycline (2 ml de milieu pour chaque puits). </li><li> Nourrir les cellules tous les jours, sans passage, avec un milieu contenant de dox-frais (maintenir les cellules dans des milieux supplémentés avec de la doxycycline jusqu&#39;au point de 5.13). </li><li> Observer les cellules dans les 24 h pour une expression mCherry et quotidiennement pendant la formation de colonies (colonies apparaissent typiquement entre 20 et 30 jours après la transfection). </li><li> Un jour avant la cueillette colonie, préparer une plaque à 96 puits de culture tissulaire avec MEF mitomycine C-traitée. </li><li> Choisissez des colonies isolées dans 50 pi de volume de usinga 200 ul pipette, et de les transférer séquentiellement dans une plaque de 96 puits dans des puits individuels. </li><li> Le lendemain, toutes les colonies se dissocient en cellules individuelles en ajoutant 50 pi de la trypsine commerciale et incuber pendant 5 minutes à 37 ° C. </li><li> Pipeter haut et bas pour désagréger la colonie. </li><li> Transférer 50 ul de la trypsine contenant la colonie dissociée dans un nouveau puits avec inactivé MEF sur une gélatine de 0,1% revêtu 96 plaques à puits rempli de 100 pi de milieu frais iPS-AF complété avec de la doxycycline. </li><li> Lorsque les cellules atteignent 60-70% de confluence, répartis dans un puits d&#39;une plaque de 24 puits. </li><li> Lorsque les cellules atteignent 60-70% de confluence, divisé 1: 2 à deux puits, l&#39;une avec la doxycycline et l&#39;autre sans doxycycline, afin de vérifier si les colonies apparaissent également dans la condition sans doxycycline. </li><li> Continuer à maintenir des clones iPS-AF, doxycycline indépendant, sur inactivé MEF dans le milieu iPS-AF. </li><li> Cultiver les cellules à 37 ° C et 5% de CO 2, CHAnging moyenne quotidienne. </li></ol> 6. phosphatase alcaline Staining <ol><li> Effectuer alcaline phosphatase coloration suivant le protocole du fabricant chaque fois qu&#39;il ya l&#39;apparition de cellules iPS-AF indépendantes doxycycline. </li></ol> 7. immunofluorescence <ol><li> Chaque fois qu&#39;il ya l&#39;apparition de doxycycline cellules indépendantes iPS-AF, semences 150.000 cellules / cm2 sur un puits d&#39;une plaque de 24 puits avec inactivé MEF, et faire croître les cellules pendant 48 heures à 37 ° C et 5% de CO 2. </li><li> (ATTENTION) Fixer les cellules en ajoutant 300 ul par puits de 4% de paraformaldehyde (PFA) pendant 15 min à température ambiante. </li><li> Ajouter 300 ul de 0,1% NP-40 cellules pour perméabiliser. </li><li> Rinçage des cellules avec 300 pi de 0,1% de PBS-Tween 20. </li><li> Ajouter 300 pi de tampon de blocage (sérum de cheval à 10% dans 1 x PBS) pendant 1 heure à température ambiante. </li><li> Utilisez les anticorps primaires suivants: Oct4 (1:80), Sox2 (1:80), Klf4 (1:80), Nanog (1:100) et SSEA1 (1:80). Diluer SSEA1 avec 1% d&#39;albumine de sérum bovin (BSA), 10% de sérum de chèvre normal, 0,3 M de glycine à 0,1% de PBS-Tween-20. Diluer tous les autres anticorps avec 10% de sérum de cheval dans du PBS 1x. </li><li> Incuber anticorps nuit à 4 ° C. </li><li> Rincer avec 300 ul de 0,1% de PBS-Tween-20. </li><li> Utiliser les anticorps secondaires dilués dans du sérum de cheval à 10% dans 1 x PBS: chèvre Alexa594 conjugué IgG anti-souris (1: 200), l&#39;IgG de poulet anti-chèvre Alexa594 conjugué (1: 200), le poulet anti-lapin Alexa594 conjugué IgG (1: 200), de chèvre conjugué à Alexa568-IgM anti-souris (1: 200). Incuber pendant 2 heures à la température ambiante. </li><li> Rincer avec PBS 1x. </li><li> noyaux de taches avec une solution Hoechst (1: 10,000) dans PBS 1x. </li></ol> 8. In Vitro Différenciation Cellulaire <ol><li> Pour former suspendus goutte corps embryoïdes (EbS), cultiver simples gouttes (2.000 cellules / 20 ul) sur le couvercle de boîtes de Pétri, en utilisant le moyen de différenciation. </li><li> Incuber les plats à 37 ° Cet 5% de CO 2 pendant 4 jours. </li><li> Transférer EB 100 mm dans des plats de qualité bactérienne dans la culture en suspension pendant 3 jours dans un milieu de différenciation. </li><li> EBs des plaques à 24 puits dans des plaques revêtues de la matrice de membrane basale (dilué à 1:10 dans du DMEM) pendant 14 jours. </li><li> Pour les analyses immunofluorescence, utiliser des anticorps primaires: T (1: 100), αfp (1: 200) et Tubb3 (1: 500) 37. </li></ol> Formation 9. In Vivo Teratoma <ol><li> Injecter 100 ul de 1 x PBS contenant 1 x 10 6 cellules iPS-AF dans le muscle de la patte arrière de RAG2 - / - - / - Yc souris. </li><li> Sacrifiez les souris par dislocation cervicale 6 semaines après l&#39;injection de cellules. </li><li> Retirer les masses tumorales, qui se distinguent par leur taille, à partir de la patte arrière de la souris pour les analyses suivantes. </li><li> Couper 7-10 um d&#39;épaisseur des sections transversales de la tumeur en isopentane congelé à l&#39;aide d&#39;un cryostat. </li><li> Pour Hématoxyline uned éosine (HE) Tache: <ol><li> Colorer avec HE pour évaluer la composition de tissu tumoral, en suivant le protocole du fabricant. </li></ol></li><li> Pour Stain immunoperoxydase: <ol><li> Fixer les sections de tératome avec 4% de PFA pendant 15 min à température ambiante. </li><li> Perméabiliser avec 0,1% de Triton X-100. </li></ol></li><li> Laisser incuber avec les anticorps suivants: Tubb3 (1: 100), αfp (01:50) et αSMA (1: 100) dilué dans 1% de BSA dans PBS 1x. Incuber pendant 1 heure à 37 ° C (pour Tubb3) ou une nuit à 4 ° C (pour les autres anticorps). </li><li> peroxydase de bloc à l&#39;aide de méthanol à 100% pendant 20 minutes. </li><li> Incuber pendant 45 min à 37 ° C avec un anticorps secondaire conjugué à la HRP (1: 150) anti-souris. </li><li> Rincer avec PBS 1x. </li><li> Incuber avec de la peroxydase (HRP) substrat (voir le tableau des matériaux) pendant 5 min. </li><li> Rincer à l&#39;eau du robinet pendant 5 min. </li><li> Colorer avec Hématoxyline QS pendant 9 sec. </li><li> Rincer à l&#39;eau du robinet. </li></ol&gt; 10. Extraction de l&#39;ARN à partir de cellules <ol><li> Utiliser un kit d&#39;extraction d&#39;ARN du commerce, selon le protocole recommandé par le fabricant. </li></ol> 11. Extraction de l&#39;ARN à partir de Teratoma <ol><li> Homogénéiser le tératome aide d&#39;un pilon et d&#39;azote mortier et liquide pour éviter la décongélation de l&#39;échantillon. </li><li> Peser 25 mg de tissu. </li><li> Ajouter 1 mL de réactif commercial pour l&#39;extraction de l&#39;ARN et 200 pi de chloroforme. </li><li> Incuber à température ambiante pendant 5 min. </li><li> Centrifuger à 13 000 x g et 4 ° C pendant 15 min. </li><li> Transférer le surnageant clarifié dans un nouveau tube. </li><li> Pour purifier l&#39;ARN utilise un kit d&#39;extraction d&#39;ARN du commerce, selon le protocole du fabricant. </li></ol> 12. Transcription inverse-polymérase Analyse Chain Reaction <ol><li> Synthétiser le premier brin d&#39;ADNc en utilisant une transcriptase inverse pour la transcription inverse (RT) réaction en chaîne de -polymerase (PCR) et oligo (dT) according le protocole du fabricant, pour obtenir 50 ng / ul d&#39;ADNc. Diluer ADNc avec de l&#39;eau sans RNase à une concentration de 10 ng / ul. </li><li> Effectuer une RT-PCR en utilisant la polymerase d&#39;ADN selon le protocole du fabricant, en utilisant 1 ng / pl d&#39;ADNc. </li></ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à dévoiler.

La méthode choisie pour obtenir l&#39;induction de la pluripotence est pertinente pour la sécurité clinique cellule par rapport à la greffe à long terme. De nos jours, il existe plusieurs méthodes appropriées pour la reprogrammation. Parmi les méthodes non-intégration, le viral (SeV) vecteur Sendai est un virus à ARN qui peut produire de grandes quantités de protéines sans intégrer dans le noyau des cellules infectées 40 et pourrait être une stratégie pour obtenir des cellules iPS. vecteurs SeV p...

Le diagnostic prénatal est un outil clinique important d&#39;évaluer les maladies génétiques (ie des aberrations chromosomiques, des maladies monogéniques ou polygéniques / multifactorielle) et des malformations congénitales (hernie diaphragmatique congénitale ie, lésions pulmonaires kystiques, omphalocèle, gastroschisis). Cellules de liquide amniotique (AF) sont simples à obtenir des procédures régulièrement programmées au cours du deuxième trimestre de la grossesse (c. -à- amniocentèse et amnioreduction) ou césariennes 1, 2. La disponibilité des cellules AF de patients prénatales ou néonatales offre la possibilité d&#39;utiliser cette source pour la médecine régénérative, et plusieurs chercheurs ont étudié la possibilité de traiter les dommages ou les maladies des tissus différents en utilisant une population de cellules souches isolées à partir AF 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12. La possibilité d&#39;obtenir facilement les cellules AF chez des patients malades, dans une fenêtre de temps dans lequel la maladie est souvent fixe, ouvre la voie à l&#39;idée d&#39;utiliser cette source de cellules à des fins de reprogrammation. En effet, souches pluripotentes induites (iPS) des cellules dérivées de cellules AF pourraient être différenciés dans les cellules d&#39;intérêt pour les tests in vitro de médicaments ou pour les approches d&#39;ingénierie tissulaire, afin de préparer une thérapie adéquate spécifique au patient avant l&#39; accouchement. De nombreuses études ont déjà démontré la capacité des cellules AF à être reprogrammé et différenciées dans un large éventail de types de cellules 13, 14, 15, 16, 17 &lt;/ sup&gt;, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27. Depuis la découverte par Takahashi et Yamanaka 28 des cellules somatiques reprogrammées par l&#39;expression forcée de quatre facteurs de transcription (Oct4, Sox2, cmyc et Klf4), des progrès ont été accomplis dans le domaine de la reprogrammation. Compte tenu des différentes méthodes, on peut distinguer entre les approches virales et non virales. Le premier attend l&#39;utilisation de vecteurs viraux (rétrovirus et lentivirus), qui ont un rendement élevé, mais silencieux généralement incomplète du transgène rétroviral, à la fois la conséquence d&#39;une lignée de cellules partiellement reprogrammée et le risque deinsertionnelle mutagenèse 29, 30, 31. La méthode non virale utilise des stratégies différentes: à savoir les plasmides, les vecteurs, les ARNm, les protéines, les transposons. La dérivation de cellules iPS libres de séquences transgéniques vise à contourner les effets potentiellement nocifs de l&#39;expression du transgène qui fuit et la mutagenèse insertionnelle. Parmi toutes les stratégies non viraux mentionnés ci - dessus, le PiggyBac (PB) du système de transposon / transposase ne nécessite que les répétitions terminales inversées qui flanquent un transgène et de l&#39; expression transitoire de l&#39;enzyme transposase pour catalyser l&#39; insertion ou l&#39; excision d&#39; événements de 32. L&#39;avantage d&#39;utiliser transposons sur les autres méthodes pour iPS génération de cellules est la possibilité d&#39;obtenir des cellules sans vecteur-iPS avec une approche de vecteur non viral qui montre la même efficacité des vecteurs rétroviraux. Ceci est possible en trace-moins excision du codage de transposon intégré pour la reprogrammation facteurs suite à une nouvelle expression transitoire de la transposase dans les cellules iPS 33. Étant donné que le PB est efficace dans différents types de cellules 34, 35, 36, 37, est plus approprié pour une approche clinique en ce qui concerne les vecteurs viraux, et permet la production de cellules iPS libre xéno-contrairement aux protocoles de production viraux actuels qui utilisent des xénobiotiques conditions, ce système est utilisé pour obtenir des cellules iPS à partir AF murin. Ici , nous proposons un protocole détaillé qui suit les travaux déjà publiés pour montrer la production de iPS pluripotentes clones à partir de cellules de souris AF (cellules iPS-AF) 38.

<table><tbody><tr><td>Boîtes de Pétri de qualité bactérienne de 100 mm&nbsp ;</td><td>BD Falcon</td><td>351029</td><td>Pour la différenciation in vitro</td></tr><tr><td>2-mercaptoéthanol&nbsp ;</td><td>Sigma</td><td>M6250</td><td>Pour la FA de souris, les cellules iPS-AF et le milieu de différenciation</td></tr><tr><td>IgM de chèvre conjuguée à Alexa568.</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A21043</td><td>Anticorps secondaire (immunofluorescence)</td></tr><tr><td>Poulet conjugué à Alexa594 IgG de poulet&nbsp ;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A21468</td><td>Anticorps secondaire (immunofluorescence)</td></tr><tr><td>Poulet conjugué à Alexa594 IgG&nbsp ;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A21442</td><td>Anticorps secondaire (immunofluorescence)</td></tr><tr><td>IgG de chèvre conjuguée à Alexa594 IgG&nbsp ;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A11005</td><td>Kit d’anticorps secondaires (immunofluorescence)</td></tr><tr><td>Phosphatase alcaline&nbsp ;</td><td>Sigma</td><td>85L1</td><td>Phosphatase alcaline&nbsp ; coloration</td></tr><tr><td>Ampicilline</td><td>Sigma</td><td>A0166</td><td>Pour la sélection bactérienne</td></tr><tr><td>Sérum bovin Albumine&nbsp ;</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td>BSA, pour solution de blocage. Dilué dans du PBS 1x</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma</td><td>C2432</td><td>Pour l’extraction de l’ARN</td></tr><tr><td>Cellules DH5&alpha</td> ; <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>18265-017</td><td>Bactéries pour procédure de clonage</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>41965039</td><td>Pour MEF, souris AF, cellules iPS-AF et milieu</td></tr> <tr><td>de différenciationDoxycycline&nbsp ;</td><td>Sigma</td><td>D9891</td><td>Pour l’expression de facteurs exogènes</td></tr><tr><td>Tubes à microcentrifuger (1,5 ml)&nbsp ;</td><td>Sarstedt&nbsp ;</td><td>72.706</td><td>Pour la production de PB</td></tr><tr><td>ES FBS&nbsp ;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10439024</td><td>Pour la FA de souris, les cellules iPS-AF et le milieu de différenciation</td></tr><tr><td>FBS&nbsp ;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10270106</td><td>Pour MEF Pince à</td></tr><tr><td>pointe fine</td><td>moyenne F.S.T</td><td>Dumont #5&nbsp ;</td><td>Isolation AF</td></tr><tr><td>Gélatine</td><td>J.T.Baker</td><td>131</td><td>Utilisé 0,1 %, dilué dans du PBS 1x</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0718</td><td>Pour solution bloquante. Dilué dans PBS 1x</td></tr><tr><td>Haematoxylin QS</td><td>Vector Laboratories</td><td>H3404</td><td>Détection des noyaux</td></tr><tr><td>HE&nbsp ;</td><td>Bio-Optica</td><td>04-061010</td><td>Analyse histologique du tératome</td></tr><tr><td>Hoechst&nbsp ;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>H3570</td><td>Détection</td></tr><tr><td>de noyaux Sérum de cheval</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16050-122</td><td>Pour solution bloquante</td></tr><tr><td>HRP chèvre conjuguée anti-souris IgG</td><td>SantaCruz</td><td>sc2005</td><td>Anticorps secondaire (immunoperoxydase)</td></tr><tr><td>ImmPACT NovaRED&nbsp ;</td><td>Vector Laboratories</td><td>SK4805</td><td>Substrat de la peroxydase</td></tr><tr><td>Seringue à insuline avec aiguille (25 G)</td><td>Terumo</td><td>SS+01H25161</td><td>Procédure d’amniocentèse</td></tr><tr><td>Klf4&nbsp ;</td><td>SantaCruz</td><td>sc-20691</td><td>IgG polyclonales</td></tr><tr><td>de lapin L-glutamine&nbsp ;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25030</td><td>Pour la FA de souris, les cellules iPS-AF et le milieu de différenciation</td></tr><tr><td>LB bouillon (Lennox)</td><td>Sigma</td><td>L3022</td><td>Pour la croissance bactérienne</td></tr><tr><td>LIF&nbsp ;</td><td>Sigma</td><td>L5158</td><td>Pour les cellules AF de souris et les cellules iPS-AF moyennes</td></tr><tr><td>Matrigel&nbsp ;</td><td>BD</td><td>354234</td><td>Pour la différenciation in vitro. Dilué 1:10 dans DMEM</td></tr><tr><td>Méthanol</td><td>Sigma</td><td>32213</td> Blocage de la <td>peroxydase</td></tr><tr><td>MULTIWELL Plaque à 24 puits</td><td>BD Falcon</td><td>353047</td><td>Pour la différenciation in vitro</td></tr><tr><td>MULTIWELL Plaque à 6 puits</td><td>BD Falcon</td><td>353046</td><td>Pour la culture de cellules MEF, AF de souris et iPS-AF</td></tr><tr><td>Nanog&nbsp ;</td><td>ReproCELL</td><td>RCAB0002P-F</td><td>IgG polyclonaux de lapin</td></tr><tr><td>Acides aminés non essentiels&nbsp ;</td><td>Sigma</td><td>M7145</td><td>Pour la souris AF, les cellules iPS-AF et le milieu de différenciation</td></tr><tr><td>Normal Goat Serum</td><td>Vector Laboratories</td><td>S2000</td><td>Pour la solution de blocage. Dilué dans du PBS 1x</td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Sigma</td><td>12087-87-0</td><td>Pour la perméabilisation cellulaire. Dilué dans PBS 1x</td></tr><tr><td>Oct4</td><td>SantaCruz</td><td>sc-5279</td><td>Souris monoclonale IgG2b</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oligo (dT)&nbsp ;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>18418012</td><td>Pour RT-PCR</td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde (solution)</td><td>Sigma</td><td>441244</td><td>PFA, fixateur, dilué dans PBS</td></tr><tr><td>PBS 10x</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14200-067</td><td>D-PBS, sans Ca2+/Mg2+. Dilué avec de l’eau stérile pour obtenir du PBS 1x</td></tr><tr><td>Pénicilline - Streptomycine&nbsp ;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15070063</td><td>Pour MEF, souris AF, cellules iPS-AF et milieu de différenciation</td></tr><tr><td>Boîte de Petri (150 mm)</td><td>BD Falcon 353025</td><td></td><td>Pour la culture MEF, la culture tissulaire</td></tr><tr><td>Plasmide d’expression de la transposase PiggyBac&nbsp ;</td><td>Fourni par le professeur Andras Nagy</td><td></td> <td>laboratoire-mPBase</td></tr><tr><td>PiggyBac-tetO2-IRES-OKMS plasmide de transposon</td><td>Fourni par le professeur Andras Nagy</td><td></td> <td>laboratoire-PB-tetO2-IRES-OKMS</td></tr><tr><td>QIAprep Spin Maxiprep Kit</td><td>Qiagen</td><td>12663</td><td>Pour la purification des plasmides</td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td><td>Qiagen</td><td>27106</td><td>Pour la purification</td></tr> <tr><td>des plasmidesPlasmide de transposon transactivateur de tétracycline inverse&nbsp ;</td><td>Fourni par le professeur Andras Nagy</td> <td>laboratoire-rtTA</td><td></td></tr> <tr><td>RNeasy Mini Kit&nbsp ;</td><td>Qiagen</td><td>74134</td><td>Pour l’extraction de l’ARN</td></tr><tr><td>Sox2&nbsp ;</td><td>SantaCruz</td><td>sc-17320</td><td>IgG polyclonale de chèvre</td></tr><tr><td>SSEA1&nbsp ;</td><td>Abcam</td><td>ab16285</td><td>Souris monoclonale IgM</td></tr><tr><td>SuperScript II Transcriptase inverse&nbsp ;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>18064-014</td><td>pour RT-PCR</td></tr><tr><td>T&nbsp ;</td><td>Abcam</td><td>ab20680</td><td>Lapin polyclonal IgG</td></tr><tr><td>Taq ADN polymérase</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10342020</td><td>PCR</td></tr><tr><td>Trypsine&nbsp ;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25300-054</td><td>Passage de culture cellulaire</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Bio-Rad</td><td>161-047</td><td>Pour la perméabilisation cellulaire, dilué dans du PBS 1x</td></tr><tr><td>Réactif TRIzol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15596-026</td><td>Pour l’extraction</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> de l’ARN <tr><td>Tubb3&nbsp ; &nbsp ;</td><td>Promega&nbsp ;</td><td>G712A</td><td>Souris monoclonale IgG1</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TWEEN-20</td><td>Sigma</td><td>P1379</td><td>Pour la perméabilisation cellulaire, diluée dans PBS 1x</td></tr><tr><td>&alpha ; fp&nbsp ; &nbsp ; &nbsp ;</td><td>R& D Systems</td><td>MAB1368</td><td>souris monoclonales IgG1</td></tr><tr><td>&alpha ;SMA&nbsp ;</td><td>Abcam</td><td>ab7817</td> Réactif de transfection <td>monoclonal IgG2a</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>de souris (FuGENE HD)</td><td>Promega&nbsp ;</td><td>E2311</td><td>Pour la transfection des cellules AF</td></tr><tr><td>Stéréomicroscope</td><td>Nikon</td><td>SM2645</td><td>Pour effectuer l’amniocentèse&nbsp ;</td></tr><tr><td>200 &mu ; l conseils</td><td>Sarstedt&nbsp ;</td><td>70.760012</td><td>Pour prélever des colonies de bactéries</td></tr><tr><td>Ciseaux</td><td>F.S.T</td><td>14094-11 inox 25U</td><td>Pour effectuer l’amniocentèse&nbsp ;</td></tr><tr><td>Éthanol</td><td>Sigma</td><td>2860</td><td>Pour nettoyer la paroi abdominale de la mère gravide</td></tr><tr><td>Boîte de Pétri de culture tissulaire (150 mm)</td><td>BD Falcon</td><td>353025</td><td>Pour l’expansion MEF</td></tr><tr><td>Mitomycine C</td><td>Sigma</td><td>M4287-2MG</td><td>Pour l’inactivation MEF</td></tr><tr><td>MULTIWELL 96 Plaque</td><td>à puits BD Falcon</td><td>353071</td><td>Pour la culture iPS-AF</td></tr></tbody></table>

la production de cellules souches pluripotentes de souris amniotique cellules fluid utilisation d&#39;un système de transposon

The Production of Pluripotent Stem Cells from Mouse Amniotic Fluid Cells Using a Transposon System

Les cellules souches pluripotentes induites (iPS) sont générées à partir de cellules somatiques de souris et d’humains par expression forcée de facteurs de transcription définis à l’aide de différentes méthodes. Ici, nous avons produit des cellules iPS à partir de cellules de liquide amniotique de souris, en utilisant un système de transposon non viral. Toutes les lignées cellulaires iPS obtenues présentaient des caractéristiques des cellules pluripotentes, y compris la capacité de se différencier vers des dérivés des trois couches germinales in vitro et in vivo. Cette stratégie ouvre la possibilité d’utiliser des cellules de fœtus malades pour développer de nouvelles thérapies contre les malformations congénitales.

Pour évaluer la capacité de reprogrammation, les cellules AF souris ont été prélevés sur des foetus de souris GFP. Les cellules ont été transfectées avec le plasmide transposon circulaire PB-tetO2-IRES-OKMS, qui exprime les facteurs Yamanaka (Oct4, Sox2, cMyc et Klf4) liés à la protéine fluorescente mCherry d'une manière doxycycline inductible, et inverse la tetracycline transactivateur (PB- ACG rtTA) plasmides conjointement avec le plasmide d'expression de la transposase (mPBase). Cellu...

Dans cette étude, nous générons des cellules souches pluripotentes induites à partir de cellules de liquide amniotique de souris, en utilisant un système de transposon non viral.

La production de cellules souches pluripotentes de souris amniotique Cellules Fluid Utilisation d&#39;un système de transposon

Induced pluripotent stem (iPS) cells are generated from mouse and human somatic cells by forced expression of defined transcription factors using ...

L’objectif global de cette procédure est d’isoler et de reprogrammer les cellules du liquide amniotique murin à l’aide d’un système de transposon. Le principal avantage de cette technique est qu’elle est facile à réaliser. Dans un cadre thérapeutique, les cellules de fœtus de maladies humaines peuvent être différenciées en cellules d’intérêt pour les tests de médicaments ou l’ingénierie tissulaire, afin de préparer une autre manière la thérapie spécifique au patient avant l’accouchement.Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés de programmation. Le système de transposon est efficace dans différents types de cellules. Il est plus adapté à l’approche clinique vis-à-vis des vecteurs viraux et permet la production de cellules IPS sans oxyno.Pour commencer l’isolement, nettoyez la paroi abdominale du barrage avec de l’éthanol à 70 %. À l’aide de ciseaux, effectuez une laparotomie médiane, en incisant la longueur de la paroi abdominale pour accéder à la cavité abdominale. Utilisez des pinces pour exposer l’utérus, puis excisez-le à l’aide de ciseaux.Transférez l’utérus dans une boîte de 100 millimètres remplie de 1xPBS stérile et conservez-la sur de la glace. Placez la parabole sous un stéréomicroscope à un grossissement de 10X et tenez l’utérus avec une pince tout en retirant la paroi utérine avec des ciseaux, en prenant soin de ne pas endommager les membranes fœtales. Rassemblez les fœtus dans un plat de 100 millimètres rempli de 1XPBS stérile et placez-le sur de la glace.Saisissez le placenta d’un fœtus à l’aide de la pince à pointe fine et déplacez-le dans une parabole propre de 100 millimètres. Ici, retirez soigneusement le sac de jaune. Interrompez l’amniose à l’aide de la pince et à l’aide d’une seringue à insuline, prélevez 30 microlitres de liquide amniotique.Transférez le liquide dans un flacon conique de 15 millilitres. Répétez ce processus pour chaque fœtus, en recueillant le liquide dans le même flacon à chaque fois. Ensuite, lavez chaque fœtus avec du 1XPBS stérile complété par un pour cent de sérum bovin fœtal et recueillez-le dans le tube conique de 15 millilitres avec le liquide amniotique.Centrifugez le tube à 145 fois G pendant cinq minutes, puis sous une hotte à flux laminaire, retirez le surnageant. Remettre en suspension les cellules granulées dans deux millilitres de milieu de culture de liquide amniotique. Prenez une plaque à six puits recouverte de gélatine à zéro virgule pour cent contenant des fibroblastes embryonnaires de souris traités à la myomycine-C ou MEF, puis ensemencez deux millilitres de cellules sur la plaque.Cultivez les cellules à 37 degrés Celsius et à cinq pour cent de dioxyde de carbone, en changeant de milieu tous les deux jours. Continuez la culture pendant sept jours jusqu’à ce que les cellules soient prêtes pour la transfection. Pour commencer la transfection, dans un tube de microcentrifugation à un virgule cinq millimètres, mélangez un microgramme de plasmide de transposon avec zéro virgule cinq microgrammes de plasmide d’expression de transposase et zéro virgule cinq microgrammes de plasmide de transactivateur de tétracycline inverse.Diluer à 100 microlitres à l’aide de d-man. Ajoutez huit microlitres de réactif de transfection dans le tube de microcentrifugation contenant l’ADN. Incuber ce mélange pendant 15 minutes à température ambiante.En prenant la plaque à six puits avec des cellules AF de souris, ajoutez goutte à goutte 100 microlitres du mélange d’ADN de l’agent de transfection par puits, en distribuant par tourbillonnage doux avec un volume final de deux millilitres par puits. Laissez les cellules pendant 24 heures à 37 degrés Celsius dans cinq pour cent de dioxyde de carbone. Le lendemain, retirez le milieu de culture, puis nourrissez chaque puits de cellules avec deux millilitres de milieu frais iPS AF complété par un virgule cinq microgrammes par millilitre de doxycycline pour induire l’expression des facteurs de Yamanaka.Nourrissez les cellules quotidiennement avec un milieu frais contenant du dox sans passage à partir de ce point. Observez les cellules au microscope fluorescent dans les 24 heures suivant le premier traitement à la doxycylcine pour rechercher toute expression de mCherry et quotidiennement à partir de ce moment pour la formation de colonies. Une fois que la formation des colonies est observée, prélevez des colonies individuelles dans 50 microlitres de milieu de culture cellulaire.Ensuite, transférez-les séquentiellement dans des puits séparés d’une plaque de culture tissulaire de 96 puits avec MEF traitée à la mytomycine c. Le lendemain, ajoutez 50 microlitres de trypsine dans chaque puits et incubez pendant cinq minutes à 37 degrés Celsius pour dissocier les colonies en cellules uniques. Après l’incubation, pipeter le liquide de haut en bas pour désagréger davantage les colonies.Transférez 50 microlitres du mélange de cellules de trypsine dans un nouveau puits contenant du MEF inactivé, puis renvoyez les cellules dans l’incubateur. Lorsque les cellules atteignent 60 à 70 % de confluence, divisez-les dans un nouveau puits d’une plaque de 24 puits, puis poursuivez l’incubation à température ambiante. Une fois que ces cellules atteignent 60 à 70 % de confluence, retournez les cellules une à deux dans deux puits, l’un contenant de la doxycycline et l’autre sans pour vérifier que les colonies se développeront également en l’absence de doxycycline.Continuer à maintenir les colonies IPS AF et le milieu indépendant de la doxycycline sur MEF inactivé à 37 degrés Celsius dans cinq pour cent de dioxyde de carbone. Changez le milieu tous les jours jusqu’à ce que les cellules soient prêtes pour la coloration, l’imagerie et l’extraction de l’ARN. Ici, les cellules gnomiotiques gliotiques positives de souris pleuripotentes induites par la doxycycline expriment les marqueurs de pleuripotence nécessaires pour confirmer la réussite de la reprogrammation.L’analyse RTPCR utilisant des cellules R1 ES comme contrôle a montré l’expression des marqueurs de pleuripotence induits en présence ou en absence de doxycycline. L’expression du gène de l’entretien ménager, la bêta-deux microglobuline, a également été observée dans les trois types de cellules. Des tératomes isolés de souris injectées avec les cellules pleuropotentes induites ont été immunomarqués.La détection de la protéine alpha-fœtale, de l’actine musculaire lisse alpha et de la bêta-trois tubuline dans les masses confirme la différenciation cellulaire en trois couches germinales, l’ectoderme, le mésoderme et l’endoderme. De plus, l’analyse RTPCR de corps embryoïdes in vitro et de cellules tératomes in vivo confirme l’expression de gènes marqueurs spécifiques de la couche germinale pour le mésoderme, l’endoderme et l’ectoderme. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’isoler et de reprogrammer les cellules du liquide amniotique murin.Il s’agit d’une procédure simple et sûre qui peut également être appliquée aux cellules de liquide amniotique humain à partir d’un échantillon obtenu à partir de diagnostics de routine ou de césariennes.

the-production-pluripotent-stem-cells-from-mouse-amniotic-fluid-cells

Research

Recherche

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologie du développement

Cette vidéo montre la procédure pour générer des cellules souches pluripotentes induites à l'aide de lentivirus inductibles qui expriment Oct4, Sox2, c-Myc et Klf4.

Générer des cellules iPS de MEFS travers l&#39;expression forcée de Sox-2, Oct-4, c-Myc et Klf4

Inductible Stemgent Dox souris Lentivirus TF Set peut reprogrammer des fibroblastes embryonnaires de souris (MEF) pour souches pluripotentes induites (iPS). Ici nous démontrons le protocole de DOX-expression inductible de facteurs de transcription de souris reprogrammation Oct4, Sox2, Klf4 et c-Myc pour générer des colonies iPS qui expriment des marqueurs communs MES pluripotence.

Génération de cellules souches pluripotentes induites par la reprogrammation des fibroblastes embryonnaires de souris avec un facteur de transcription Quatre, doxycycline inductible système de transduction lentiviraux

Génération induites pluripotentes (cellules souches iPSC) lignes produit des lignes de différentes potentiel de développement, même quand ils passent des tests standard pour la pluripotence. Nous décrivons ici un protocole de produire des souris provenant entièrement de iPSCs, qui définit les lignes iPSC comme possédant la pluripotence...

Génération de souris dérivées de cellules souches pluripotentes induites

Ici, nous montrons un protocole simple et efficace pour la génération de l'homme iPSCs de 3-4 ml de sang périphérique en utilisant un vecteur lentiviral unique reprogrammation. La reprogrammation des cellules sanguines facilement disponibles promet d'accélérer l'utilisation des technologies de l'iPSC en la rendant accessible à une communauté plus large de la recherche.

Génération de l&#39;homme cellules souches pluripotentes induites à partir de sang périphérique en utilisant le vecteur lentiviral STEMCCA

Le fibroblaste embryonnaire de souris peut être reprogrammé en cellules souches pluripotentes induites à faible efficacité par l’expression forcée des facteurs de transcription Oct-4, Sox-2, Klf-4, c-Myc. Les rares intermédiaires de la réaction de reprogrammation sont isolés par FACS par marquage avec des anticorps contre les fabricants de surface cellulaire Thy-1.2, Ssea-1 et Epcam.

Marqueur de surface cellulaire Purification médiation de iPS intermédiaires cellulaires à partir d&#39;un modèle reprogrammable souris

Cellules souches pluripotentes induites (CISP) représentent une source de tissus spécifiques au patient pour des applications cliniques et la recherche fondamentale. Ici, nous présentons un protocole détaillé pour reprogrammer les cellules humaines périphériques mononucléaires du sang (de PBMNCs) obtenus à partir de couches leucocytaires congelés en CSPi virales sans l'aide de non-intégration des plasmides épisomiques.

Génération de cellules souches pluripotentes induites à partir de Frozen Buffy Manteaux en utilisant non-intégration épisomique plasmides

Ce protocole décrit une méthode détaillée pour la génération efficace d’iPSC sans intégration à partir de cellules sanguines périphériques humaines adultes. Grâce à l’utilisation de quatre vecteurs épisomaux basés sur oriP/EBNA pour exprimer les facteurs de reprogrammation, KLF4, MYC, BCL-XL ou OCT4 et SOX2, des milliers de colonies d’iPSC peuvent être obtenues à partir de 1 mL de sang périphérique.

Génération d&#39;Intégration-libres induits des cellules souches pluripotentes à partir de cellules mononucléaires sang périphérique humain utilisant épisomique Vecteurs

Ce protocole décrit la reprogrammation des primaires amniotique fluide et membrane de cellules souches mésenchymateuses sur les cellules souches pluripotentes induites en utilisant une approche épisomiques sans intégration dans des conditions totalement chimiquement définies. Les procédures d’extraction, la culture, la reprogrammation et la caractérisation des cellules souches pluripotentes induites qui en résulte par une méthodologie rigoureuse sont reprises.

Reprogrammation du liquide amniotique primaire et cellules de Membrane de pluripotence dans des Conditions sans Xeno

Ici, nous décrivons une méthode détaillée d’édition de gènes transparente dans des cellules souches pluripotentes humaines en utilisant un plasmide donneur à base de piggyBac et le mutant Cas9 nickase. Deux mutations ponctuelles ont été introduites dans l’exon 8 du locus du facteur nucléaire 4 alpha des hépatocytes (HNF4α) dans les cellules souches embryonnaires humaines (CSEh).

Introduction de mutations ponctuelles dans des cellules souches pluripotentes humaines à l’aide d’une édition transparente du génome

Nous présentons ici une méthode qui combine l’utilisation de l’effacement épigénétique chimique avec des indices liés à la mécanosension pour générer efficacement des cellules pluripotentes de mammifères, sans avoir besoin de transfection de gènes ou de vecteurs rétroviraux. Cette stratégie est donc prometteuse pour la médecine translationnelle et représente une avancée notable dans la technologie des organoïdes de cellules souches.

Une stratégie en deux étapes qui combine la modification épigénétique et les indices biomécaniques pour générer des cellules pluripotentes de mammifères

Découvrez la génération de cellules souches pluripotentes induites à partir de cellules de liquide amniotique murin en utilisant un système de transposon non viral. Cette méthode offre une approche sécurisée pour la médecine régénérative.

La production de cellules souches pluripotentes de souris amniotique Cellules Fluid Utilisation d'un système de transposon

Explorer plus de vidéos