Name: À long terme à haute résolution Microscopie intravitale dans le poumon avec un vide Stabilisé Imaging Window (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 19 s
Description: Apprenez l'imagerie intravitale à long terme et haute résolution du poumon intact chez la souris à l'aide d'une fenêtre d'imagerie stabilisée par vide. Cette méthode permet de visualiser les interactions stroma-tumeur lors de la métastase.

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Cette recherche a été soutenue par le NIH-CA100324, le P30CA013330 de subvention de soutien du centre de cancérologie de l’Institut national du cancer Einstein, R01CA172451 au JWP et au programme d’imagerie intégrée. Cette technologie a été développée au Centre de biophotonique Gruss-Lipper et au programme d’imagerie intégrée de l’Albert Einstein College of Medicine. Nous reconnaissons le soutien de ces centres dans ce travail. Les auteurs remercient Mike Rottenkolber, Ricardo Ibagon et Anthony Leggiadro de l’atelier d’usinage Einstein pour leur savoir-faire habile et opportun, le laboratoire de Matthew Krummel pour avoir généreusement partagé leurs dessins de conception de fenêtres, Kevin Elicieri et Jeremy Bredfeldt pour leur expertise en microscopie et leurs recommandations d’amplificateurs et Allison Harney et Bojana Gligorijevic pour les discussions informatives.

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Haute résolution en imagerie optique in vivo combinée avec des étiquettes fonctionnelles marquées par fluorescence tels que des protéines et des anticorps a augmenté de façon spectaculaire notre compréhension de la cascade métastatique. Elle a permis la visualisation directe et la quantification d&#39;une seule cellule et des paramètres de sous-cellulaire dans les cellules tumorales, des cellules hôtes et leur microenvironnement. Cette imagerie au sein de la tumeur primaire a conduit, par exemple, à la...

L&#39;imagerie haute résolution optique intravitale est avérée être essentielle à la compréhension de nombreux processus biologiques, ce qui permet une seule cellule et des paramètres de sous-cellulaires qui doivent être mesurés et quantifiés. Dans la recherche sur le cancer, l&#39; imagerie intravitale de cellules tumorales et stromales a conduit à la découverte de nombreuses interactions microenvironnementales 6-11 qui ne sont présents que chez l&#39;animal intact. Les découvertes sur microenvironnements associés à intravasation et la diffusion des cellules tumorales dans le cancer du sein par imagerie optique à résolution cellulaire unique in vivo a même conduit à de nouveaux marqueurs pour le pronostic et la réponse au traitement chez les patients atteints de cancer du sein 12-16. Les meilleures technologies d&#39;imagerie disponibles pour la visualisation profondément dans les organes vitaux internes intacts sont les modalités cliniques (IRM, PET, CT) qui offrent d&#39;excellentes vues de l&#39;organe entier et peut révéler des pathologies avant même qu&#39;ils produisent des symptômes cliniques. Ils sont incapables, houtefois, pour révéler les premiers stades de la métastase et les mécanismes cellulaires de conduite progression de la tumeur en raison de leur manque de résolution de la cellule unique. Au moment où les métastases pulmonaires sont visibles dans ces modalités, elles sont bien établies et la prolifération. Compte tenu de l&#39;estimation selon laquelle 90% des cellules disséminées tumorales qui arrivent dans le poumon soit ne survivent pas à 17 ou initialement restent dormantes 18, et l&#39;observation selon laquelle ils arrivent beaucoup plus tôt que prévu 19, imager les premières étapes de l&#39; arrivée et la survie devient crucial de comprendre le processus d&#39;ensemencement métastatique et la récurrence de la croissance tumorale sur des sites distants. L&#39;exécution de ces observations dans le poumon a prouvé cependant extrêmement difficile; la grande majorité des études d&#39;imagerie ont utilisé ex vivo ou explants préparations 20-23, qui ne donnent une vue dans le poumon à des moments uniques. Bien que ces préparations fournissent des informations utilesrmation, ils ne donnent pas une compréhension complète des interactions, des relations de cause à effet, et la dynamique qui se produisent entre les diverses composantes du microenvironnement. L&#39;absence d&#39;un système adéquat circulatoire (et le déséquilibre concomitant de l&#39; homéostasie) et la déconnexion du reste du système immunitaire de l&#39;organisme, il est désireux de valider les conclusions que ces préparations génèrent dans le tissu intact in vivo. De nombreux groupes ont effectué l&#39; imagerie intravitale du poumon intact 2,4,5,24-33 avec Wearn et l&#39; allemand étant le premier à chirurgicalement exposer la couche pleural 24 et Terry le premier à utiliser une fenêtre d&#39;imagerie implantable 25. imagerie à haute résolution dans le poumon est fortement entravée par le mouvement constant du poumon et plusieurs techniques ont été développées pour surmonter cette limitation. Wagner et Filley 27 ont étudié le mouvement naturel du poumon canineet conçu leur protocole chirurgical pour localiser leur fenêtre implantée sur une région relativement stationnaire tandis que Wagner a utilisé le vide dans sa fenêtre préparation chirurgicale pour immobiliser le tissu 28. Depuis ce temps, une variété de techniques ont été utilisées pour l&#39; image du poumon , y compris: serrage des bronches, l&#39; apnée séquentielle et imagerie fermée, acquisition suréchantillonné, collage du lobe du poumon et de vide 34. Chacun d&#39;eux a ses avantages et ses inconvénients et pas une technique est apparue comme supérieur à un autre 34. Par exemple, la bronche de serrage et de l&#39;apnée séquentielle modifie l&#39;échange normal de gaz dans les poumons et peuvent provoquer une atélectasie. imagerie Gated et l&#39;acquisition suréchantillonné ne souffrent pas de ces inconvénients, mais exigent à grande vitesse ou des équipements spécialisés d&#39;imagerie pas largement accessible. Enfin, tant encollage du poumon et de la technique du vide éviter les deux inconvénients mentionnés ci-dessus, mais peuvent présenter des lésions induites par la force de cisaillement si les soins ne sont pas taken. Au cours des dernières années, la fenêtre de vide a été miniaturisé et adapté pour une utilisation dans des souris en utilisant confocale et multiphotonique microscopie 4,5,33 et une excellente imagerie à haute résolution a été atteint 2. Le tableau 1 résume cette riche histoire et met en évidence ces documents qui décrivent roman les progrès dans l&#39;utilisation de fenêtres d&#39;imagerie intravitale du poumon. Ce protocole décrit l&#39;utilisation de longue time-lapse multiphotonique intravitale microscopie à l&#39;image des métastases dans le, du poumon intact en direct avec la résolution subcellulaire le plus élevé possible. Les images sont acquises pour un maximum de 12 heures en utilisant un microscope multiphoton équipé d&#39;une ouverture numérique objectif élevé et tube photomultiplicateur multiple (PMT) détecteurs. des modèles de souris transgéniques sont utilisés pour l&#39;étiquette fluorescente macrophages natifs avec fluorescent dextran de poids moléculaire élevé et des cellules tumorales de protéines fluorescentes transfectées (pour marquer les cellules tumorales du système vasculaire et respectively). Bien que ce choix de cellules marquées par fluorescence permet la visualisation des interactions cellulaires-macrophage cellules endothéliales tumorales et la dynamique, ce protocole va travailler pour toute souche de souris fluorescent ou non fluorescent. Après l&#39; acquisition, le mouvement de dérive résiduelle ( le cas échéant) est éliminé en utilisant un plug - in Fiji 35,36 et macros personnalisées moyenne temporelle du canal vasculaire pour éliminer le clignotement provoquée par des cellules non marquées du sang circulant. Bien que ce protocole met l&#39;accent sur l&#39;imagerie des métastases, les techniques sont applicables à de nombreux autres processus biologiques observables avec imagerie à haute résolution à cellule unique dans le poumon.

<table><tbody><tr><td>Régulateur de vide en laiton nickelé 1/8 NPT femelle, avec manomètre, 0 - 20" Hg Vide</td><td>McMaster Carr</td><td>4172K12&nbsp ;</td><td>Régulateur de vide</td></tr><tr><td>Adaptateur de raccord de tuyau cannelé en laiton pour tuyau 1/4 « ID x 1/8 » NPTF Tuyau mâle</td><td>McMaster Carr</td><td>5346K13</td><td>Régulateur de vide Adaptateur de tuyau</td></tr><tr><td>de marque Pyrex Fioles filtrantes avec tubulation ; Col usiné pour butée en caoutchouc n° 4 ; Contenance : 50 ml</td><td>Corning Life Sciences Glass</td><td>5360-50</td><td>Flacon à vide</td></tr><tr><td>Recouvrement rond en verre Épaisseur #1,5, 0,16 - 0,19 mm 10 mm de diamètre.</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>260368</td><td>Cathéters</td></tr><tr><td>jetables Exel International Safelet I.V., 22 g x 1 po.</td><td>Exel International</td><td>26746</td><td>Cathéter trachéal</td></tr><tr><td>PERMA-HAND Sutures en soie tressée noire, ETHICON LIGAPAK Bobine de distribution Taille 2-0</td><td>VWR</td><td>95056-992</td><td>String</td></tr><tr><td>Liquid Super Glue, Clair, 0,14 oz</td><td>Hendel Corp.</td><td>LOC1647358</td><td>Colle cyano-acrylate</td></tr><tr><td>Tétraméthylrhodamine isothiocyanate&ndash ; Dextran</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1287-500MG</td><td>155 kD</td></tr> Tube en PVC transparent Dextran <tr><td>Laboratory, 1/16 » ID, 1/8 » OD, 1/32 » Épaisseur de paroi, 25 pi Longueur</td><td>McMaster Carr</td><td>5155T12</td><td>Tube mince et Tubes pour</td></tr><tr><td>tubes en polyéthylène résistant aux fissures Luer, 1/8 » ID, 1/4 » OD, 1/16 » d’épaisseur de paroi, blanc, 50 pieds de longueur.</td><td>McMaster Carr</td><td>5181K24&nbsp ;</td><td>Tube épais</td></tr><tr><td>Lotion dépilatoire</td><td></td> <td>Nair-Micro</td><td></td></tr> <tr><td>Medical Tubing 95 Duromètre LDPE</td><td>Scientific Commodities Inc.</td><td>BB31695-PE/1</td><td>Tubulure pour cathéter veineux de queue</td></tr><tr><td>30 G x 1 po. Aiguille BD PrecisionGlide</td><td>Aiguilles BD</td><td>305128</td><td>pour cathéter veineux de queue</td></tr><tr><td>Puritan Écouvillons non stériles à pointe de coton&nbsp ;</td><td>Fisher Scientific</td><td>867WCNOGLUE</td><td></td></tr><tr><td>Raccord de tube cannelé en polycarbonate transparent, droit réducteur pour tube de 3/32 » x 1/16 » ID</td><td>McMaster Carr</td><td>5117k51</td><td>Connecteurs entre les tubes</td></tr><tr><td>Bouchons en caoutchouc à un trou</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-135F</td><td>Bouchon pour flasque à vide</td></tr><tr><td>SHARP Embouts de barrière de précision, pour P-100, 100 et micro ; l</td><td>Denville Scientific Inc.</td><td>P1125</td><td>Pointe de pipette</td></tr><tr><td>Bande de laboratoire</td><td>Fisher Scientific</td><td>159015R</td><td></td></tr><tr><td>Puralube</td><td>Henry Schein Santé animale</td><td>008897</td><td>Pommade ophtalmique</td></tr><tr><td>Gemini Cautery Kit</td><td>Harvard Apparatus</td><td>726067</td><td>Cautery</td></tr><tr><td>Pen Graefe Micro Dissection Forceps ; Dentelé; légère courbe ; Largeur de pointe de 0,8 mm ; 4" de longueur</td><td>Roboz Surgical</td><td>RS-5135&nbsp ;</td><td>forceps</td></tr><tr><td>Extra Fine Micro Ciseaux de Dissection 4 » Droite Sharp/Sharp 24 mm</td><td>Roboz Surgical</td><td>RS-5912</td><td>Ciseaux Tranchants</td></tr><tr><td>Micro Ciseaux de Dissection 4 » Droite Blunt/Blunt</td><td>Roboz Surgical</td><td>RS-5980</td> Lingettes <td>Ciseaux Blunt</td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>06-666-A&nbsp ;</td><td>harnais</td></tr><tr><td>PhysioSuite System</td><td>Kent Scientific</td><td>PhysioSuite</td><td>Vitals Monitor</td></tr><tr><td>1 ml Seringue, tuberculine Slip Tip</td><td>BD</td><td>309659</td><td>Seringue</td></tr> en <tr><td>acrylate de cyanose</td><td>Agrafes</td><td>LOC1647358</td><td>Cover Slip Adhesive</td></tr><tr><td>Petroleum Jelly</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-086291</td> Adaptateur <td>de barrière d’eau</td></tr><tr><td>Luer Cannulla 1,5 - 2,2 mm</td><td>Appareil</td> <td>Harvard734118</td><td>Connecteur de cathéter</td></tr><tr><td>PhysioSuite MouseOxymètre de pouls STAT</td><td>Oxymètre de pouls</td><td>Kent Scientific</td><td></td></tr><tr><td>Isoethesia (isoflurane)</td><td>Henry Schein Animal Health</td><td>50033</td><td>250 ml</td></tr><tr><td>Oxygen</td><td>TechAir</td><td>OX TM</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS</td><td>Life Technologies</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Vanne à bille en PVC, Push to Connect, 1/4 po</td><td>Grainger</td><td>3CGJ7</td><td>Vacuum Valve</td></tr><tr><td>Small Animal Ventilator</td><td>Harvard Apparatus</td><td>683</td><td>Alternative est disponible auprès de Kent Scientific : MouseVent</td></tr><tr><td>OptiMEM Reduced Serum Medium</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>31985062&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000 Réactif de transfection</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>MacBlue Tg(Csf1r*-GAL4/VP16,UAS-ECFP)1Hume/J</td><td>Mice Jackson</td><td>Laboratory 026051&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Microscope multiphotonique</td><td>Olympus</td><td>Fluoview FV1000</td><td>Alternative à la lunette sur mesure</td></tr><tr><td>Boîtier environnemental</td><td>Chambre en plastique de précision</td><td>pour FV1000</td><td>Alternative au boîtier sur mesure</td></tr><tr><td>Tampon au phosphate Saline</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14190136</td><td></td></tr><tr><td>Capteur de puissance laser</td><td>Champ cohérentMaxIITOP</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tête de wattmètre laser</td><td>cohérente</td><td>PM10</td><td></td></tr><tr><td>pcDNA3-Clover Fluorescent Protein Vector</td><td>Addgene</td><td>40259</td><td></td></tr><tr><td>G418 Sulfate Selective Antibiotic</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10131027</td><td></td></tr><tr><td>MoFlo Fluorescent-Activate Cell Sorter&nbsp ;</td><td>Beckman Coulter</td><td>XDP</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine EDTA 1x</td><td>Corning</td><td>25-052-CL</td><td></td></tr><tr><td>40 &micro ; m Mesh</td><td>Falcon</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>96 Well Plate</td><td>Costar</td><td>3599</td><td></td></tr><tr><td>60 mm Plat de culture</td><td>Corning</td><td>430196</td><td></td></tr><tr><td>10 cm Plat de culture</td><td>Corning</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4503</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline 1x</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6J Souris</td><td>Jackson Laboratoire</td><td>000664&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Kim Wipes</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-666-A&nbsp ;</td><td></td></tr></tbody></table>

À long terme à haute résolution microscopie intravitale dans le poumon avec un vide stabilisé imaging window

Long-term High-Resolution Intravital Microscopy in the Lung with a Vacuum Stabilized Imaging Window

Métastase vers des sites secondaires , tels que le poumon, le foie et l&#39; os est un événement traumatique avec un taux d&#39;environ 1 à 90% de mortalité. Parmi ces sites, le poumon est le plus difficile à évaluer en utilisant l&#39;imagerie optique intravitale en raison de sa position fermée dans le corps, la nature délicate et rôle vital dans le maintien de la physiologie appropriée. Bien que les modalités cliniques (tomographie par émission de positons (TEP), l&#39;imagerie par résonance magnétique (IRM) et de tomodensitométrie (CT)) sont capables de fournir des images non invasives de ce tissu, ils manquent de la résolution nécessaire pour visualiser les premiers événements d&#39;ensemencement, avec un seul pixel constitué de près d&#39;un millier de cellules. Les modèles actuels de poumon métastatique ensemencement postulat que les événements juste après l&#39;arrivée d&#39;une cellule tumorale déterministes pour la survie et la croissance ultérieure. Cela signifie que en temps réel des outils d&#39;imagerie intravitale avec une résolution à une seule cellule 2 sont nécessaires pour définir les phénotypes de l&#39;ensemencement cells et de tester ces modèles. Alors que l&#39; imagerie optique à haute résolution du poumon a été réalisée en utilisant divers ex vivo des préparations, ces expériences sont généralement seule fois-point des tests et sont sensibles à des artefacts et des conclusions erronées possibles en raison de l&#39;environnement considérablement modifié (température, profusion, cytokines, etc. ) résultant de la suppression de la cavité thoracique et le système circulatoire 3. Des travaux récents ont montré que l&#39; imagerie optique intravitale time-lapse du poumon intact est possible en utilisant un vide stabilisé fenêtre d&#39;imagerie 2,4,5 cependant, les temps typiques d&#39;imagerie ont été limités à environ 6 heures. Nous décrivons ici un protocole pour effectuer une imagerie intravitale time-lapse à long terme du poumon en utilisant une telle fenêtre sur une période de 12 heures. Les time-lapse séquences d&#39;images obtenues à l&#39;aide de cette méthode permettent la visualisation et la quantification des interactions entre les cellules, la dynamique des membranes et de la perfusion vasculaire dans les poumons. Nous avons en outre dEscribe une technique de traitement d&#39;image qui donne une vue sans précédent claire de la microvascularisation pulmonaire.

Pour démontrer le type de résultats qui peuvent être obtenus avec cette méthode, nous avons injecté des cellules tumorales E0771-LG étiquetés avec le Clover protéine fluorescente dans la veine de la queue de souris MacBlue 44 à différents points de temps avant la chirurgie. Après la chirurgie, 155 kD rhodamine dextran marqué a été injecté par voie IV pour marquer la vascularisation et imagerie time-lapse a été réalisée. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page=...

Ce protocole décrit l’utilisation de la microscopie multiphotonique pour effectuer une imagerie à long terme, à haute résolution, sur cellule unique, du poumon intact en temps réel à l’aide d’une fenêtre d’imagerie stabilisée sous vide.

À long terme à haute résolution Microscopie intravitale dans le poumon avec un vide Stabilisé Imaging Window

Metastasis to secondary sites such as the lung, liver and bone is a traumatic event with a mortality rate of approximately 90% 1. Of these sites, the lung ...

L'objectif général de cette méthode est de réaliser un imagerie à long terme, à haute résolution et au niveau cellulaire unique du poumon intact à l'aide d'une fenêtre d'imagerie stabilisée sous vide. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la recherche sur le cancer, par exemple quelles interactions s'établissent entre les cellules stromales et les cellules tumorales durant les premières étapes de la métastase. Le principal avantage de cette technique est que le poumon vivant et intact peut théoriquement être visualisé à une résolution au niveau de la cellule unique pendant jusqu'à 12 heures.Commencez par attacher une longueur de 2,5 cm de suture 2-0 à un cathéter trachéal, à 0,6 cm au-dessus de l'embout, à l'aide d'un nœud double. Appliquez ensuite une pommade ophtalmique sur les yeux d'une souris anesthésiée et utilisez une crème dépilatoire pour éliminer les poils du côté gauche de l'animal, depuis la ligne médiane du thorax jusqu'au quart de la région dorsale et depuis l'aisselle jusqu'juste sous la cage thoracique. Nettoyez toute lotion excédentaire et stérilisez la peau exposée avec de l'éthanol à 70 %.Ensuite, intuber l'animal. Placer un fil de suture 2-0 autour du museau, sous les dents antérieures. Déplacer l'animal vers la zone chirurgicale en prenant soin de ne pas déloger les cathéters, puis mettre en marche le ventilateur.Connecter le ventilateur au cathéter trachéal. Ensuite, fixer le cathéter au museau et à l'avant-membre gauche à l'aide de ruban adhésif. Après avoir confirmé l'absence de réponse à une pincée des orteils, utiliser des ciseaux pointus pour retirer un centimètre carré de peau au-dessus de la paroi thoracique gauche.Soulevez la couche de tissu adipeux mammaire et cautérisez tous les vaisseaux sanguins exposés. Ensuite, résectionnez le tissu adipeux et retirez la couche musculaire jusqu’à la cage thoracique, en prenant soin de ne pas sectionner la veine axillaire à la base du membre antérieur. Utilisez une pince pour soulever la sixième côte.Ensuite, en tenant les ciseaux pointus selon un angle faible de cinq degrés, couper la côte près du bord de l'ouverture dans la peau. Retirer quatre côtes consécutives afin d'élargir l'ouverture dans la paroi thoracique, exposant ainsi tout le lobe pulmonaire. Puis transférer délicatement la souris sur la platine du microscope pour l'imagerie.Avec le vide désactivé, remplir la chambre intérieure de la fenêtre sous vide avec du PBS. Retourner la souris et positionner le poumon exposé au-dessus de la fenêtre de la lamelle d'imagerie sous vide. Ensuite, activer lentement le vide.Placer un harnais de contention, constitué d'un morceau de papier absorbant plié en deux, deux fois sur la poitrine de la souris, puis fixer le harnais à la plaque de la platine à l'aide de ruban adhésif. Ensuite, attacher un oxymètre de pouls à la patte de l'animal. Puis placer la chambre environnementale sur la platine et allumer le chauffage afin de maintenir la souris à une température physiologique.Lorsque l'animal est en place, approchez l'objectif de 25 par 95 d'ouverture numérique du coverslip. En mode épifluorescence, visualisez le canal fitzy et mettez le tissu pulmonaire au point. Ensuite, chargez une seringue stérile avec 100 microlitres de la suspension de cellules tumorales, retirez la seringue de PBS du cathéter de la veine caudale et connectez la seringue contenant les cellules tumorales.Injectez lentement les cellules tumorales dans la veine de la queue. Ensuite, reconnectez la seringue de PBS au cathéter de la veine de la queue et localisez les cellules tumorales dans tout le tissu pulmonaire à l’aide de l’oculaire du microscope. Remplacez maintenant la seringue de PBS par une seringue chargée de 100 microlitres de dextrane rhodamine et injectez lentement le dextrane dans la souris via le cathéter de la queue.Après l'administration de la dextrane, effectuer un lavage stérile de 50 microlitres au PBS. Ensuite, acquérir des images à chacun des emplacements tumoraux précédemment identifiés afin de visualiser l'écoulement et l'intégrité de la vascularisation. Vingt-quatre heures après l'injection, des cellules tumorales isolées peuvent être observées en interaction avec des macrophages et des monocytes au sein de la vascularisation.La stabilité de l'imagerie est telle que des Z-stacks séquentiels du champ peuvent être acquis et une reconstruction tridimensionnelle peut être générée. Ici, une mosaïque de cinq par cinq champs d'imagerie, couvrant un champ de vision de 890 microns, sur 200 et cinq minutes, à 15 microns sous la surface du poumon d'une lésion métastatique unique, 12 jours après injection, est présentée. Malgré l'importance du champ de vision, la haute résolution des images sous-jacentes, composant la mosaïque, permet la capture d'événements subcellulaires, tels que la mitose d'une cellule unique, comme en témoigne la séparation des chromosomes.L'injection intravasculaire d'un dextran marqué par un fluorochrome et de haut poids moléculaire entraîne l'étiquetage de la lumière vasculaire ; toutefois, les érythrocytes et les leucocytes circulants non marqués peuvent obstruer le dextran. Dans les petits capillaires du poumon, cette obstruction provoque des clignotements du signal du dextran et une perte de définition des limites vasculaires. La grande stabilité spatiale offerte par ce protocole permet une moyenne temporelle du canal sanguin sans flou, ce qui permet de restaurer les occlusions temporaires.Les autres canaux de signal peuvent ensuite être superposés à la vascularisation pour offrir une vue claire des limites des vaisseaux. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en environ une heure si elle est effectuée correctement. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de veiller à ne pas sectionner de gros vaisseaux sanguins sans les cautériser au préalable et d'éviter tout contact avec le tissu pulmonaire.Grâce à cette procédure, les premiers stades de la dissémination et de la prolifération des cellules tumorales peuvent être visualisés. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment réaliser un imagerie intravitale dans un poumon intact à l’aide d’une fenêtre d’imagerie stabilisée par vide. Merci d’avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.

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Nous montrons, comment utiliser les deux photons de microscopie pour l'observation de la dynamique des granulocytes neutrophiles dans les poumons infectés alors qu'ils phagocyter des pathogènes ou de produire des neutrophiles pièges extracellulaires (NET).

Observation directe de la phagocytose et NET-formation par les neutrophiles dans les poumons infectés en utilisant deux microscopie biphotonique

Dans cette vidéo, nous décrivons l’imagerie intravitale d’un pancréas de souris à travers une fenêtre stabilisée pour la visualisation à long terme de la dynamique cellulaire.

Imagerie intravitale : méthode d’observation cellulaire du pancréas de souris à travers une fenêtre d’imagerie stabilisée

Ce protocole décrit l’imagerie intravitale des souris transgéniques exprimant des marqueurs fluorescents spécifiques des cellules. Intravitale imagerie fournit une méthode non invasive pour les observations à haute résolution dans les animaux vivants à l’aide de windows implantables permettant la visualisation microscopique des processus est possible. Cette méthode est particulièrement utile pour étudier les processus longitudinales.

La microscopie intravitale du système vasculaire associées à la tumeur en utilisant Advanced dorsale pli fenêtre Chambers sur des souris transgéniques fluorescents

L’imagerie in vivo à haute résolution du pancréas a été facilitée par la fenêtre d’imagerie intravitale pancréatique.

Visualisation longitudinale stabilisée au niveau cellulaire in vivo du pancréas dans un modèle murin avec une fenêtre d’imagerie intravitale pancréatique

Une approche est présentée ici pour l’imagerie intravitale à long terme utilisant des fenêtres en silicone optiquement claires qui peuvent être collées directement sur le tissu / organe d’intérêt et la peau. Ces fenêtres sont moins chères et plus polyvalentes que d’autres actuellement utilisées sur le terrain, et l’insertion chirurgicale provoque une inflammation et une détresse limitées chez les animaux.

Imagerie intravitale longitudinale à travers des fenêtres en silicone transparent

Nous présentons ici un protocole pour l’implantation chirurgicale d’une fenêtre optique à demeure permanente pour le thorax murin, qui permet une imagerie intravitale à haute résolution du poumon. La permanence de la fenêtre la rend bien adaptée à l’étude des processus cellulaires dynamiques dans le poumon, en particulier ceux qui évoluent lentement, tels que la progression métastatique des cellules tumorales disséminées.

Une fenêtre permanente pour enquêter sur les métastases cancéreuses au poumon

Le recrutement des leucocytes et des plaquettes constitue un composant essentiel nécessaire à la croissance efficace des artères collatérales au cours de l’artériogenèse. La microscopie multiphotonique est un outil efficace pour suivre la dynamique cellulaire avec une résolution spatio-temporelle élevée in vivo et moins photo-toxicité pour étudier le recrutement et l’extravasation des leucocytes au cours de l’artériogenèse.

Imagerie intravitale multiphotonique pour la surveillance du recrutement leucocytaire au cours de l’artériogenèse dans un modèle murin de membre postérieur

Ce protocole décrit une nouvelle fenêtre d’imagerie mammaire avec un couvercle remplaçable (R.MIW). La microscopie intravitale après implantation du R.MIW permet une imagerie longitudinale et multi-jours de la glande mammaire saine et malade avec une résolution cellulaire au cours des différents stades de développement.

Microscopie intravitale longitudinale à l’aide d’une fenêtre d’imagerie mammaire avec couvercle remplaçable

La microscopie à fluorescence intravitale peut être utilisée pour étudier les interactions leucocytaires-endothéliales et la perfusion capillaire en temps réel. Ce protocole décrit des méthodes pour imager et quantifier ces paramètres dans la microcirculation pulmonaire à l’aide d’un système d’imagerie pulmonaire stabilisé sous vide.

Microscopie à fluorescence intravitale à grand champ de la microcirculation pulmonaire dans une lésion pulmonaire aiguë expérimentale à l’aide d’un système d’imagerie stabilisé sous vide

Ici, nous présentons un protocole d’imagerie intravitale du poumon gauche de souris transplantée à l’aide de la microscopie à deux photons. Il s’agit d’un outil précieux pour étudier la dynamique cellulaire et les interactions en temps réel après une transplantation pulmonaire murine.

Microscopie intravitale à deux photons du poumon de souris transplanté

Ici, nous présentons un protocole pour l’imagerie intravitale d’un Mycobacterium tuberculosis atténué approuvé par BSL-2. Souche dans le poumon murin utilisant une fenêtre pulmonaire permanente. Cette approche permet une analyse longitudinale à résolution unicellulaire des interactions précoces hôte-pathogène, y compris la localisation bacillaire, la dynamique vasculaire et l’absorption des macrophages dans le même microenvironnement pulmonaire.

Imagerie intravitale de Mycobacterium tuberculosis auxotrophe atténué dans le poumon murin lors d’une infection intravasculaire précoce

Apprenez l'imagerie intravitale à long terme et haute résolution du poumon intact chez la souris à l'aide d'une fenêtre d'imagerie stabilisée par vide. Cette méthode permet de visualiser les interactions stroma-tumeur lors de la métastase.

À long terme à haute résolution Microscopie intravitale dans le poumon avec un vide Stabilisé Imaging Window

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