À long terme à haute résolution Microscopie intravitale dans le poumon avec un vide Stabilisé Imaging Window

L'objectif général de cette méthode est de réaliser un imagerie à long terme, à haute résolution et au niveau cellulaire unique du poumon intact à l'aide d'une fenêtre d'imagerie stabilisée sous vide. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la recherche sur le cancer, par exemple quelles interactions s'établissent entre les cellules stromales et les cellules tumorales durant les premières étapes de la métastase. Le principal avantage de cette technique est que le poumon vivant et intact peut théoriquement être visualisé à une résolution au niveau de la cellule unique pendant jusqu'à 12 heures.

Commencez par attacher une longueur de 2,5 cm de suture 2-0 à un cathéter trachéal, à 0,6 cm au-dessus de l'embout, à l'aide d'un nœud double. Appliquez ensuite une pommade ophtalmique sur les yeux d'une souris anesthésiée et utilisez une crème dépilatoire pour éliminer les poils du côté gauche de l'animal, depuis la ligne médiane du thorax jusqu'au quart de la région dorsale et depuis l'aisselle jusqu'juste sous la cage thoracique. Nettoyez toute lotion excédentaire et stérilisez la peau exposée avec de l'éthanol à 70 %.

Ensuite, intuber l'animal. Placer un fil de suture 2-0 autour du museau, sous les dents antérieures. Déplacer l'animal vers la zone chirurgicale en prenant soin de ne pas déloger les cathéters, puis mettre en marche le ventilateur.

Connecter le ventilateur au cathéter trachéal. Ensuite, fixer le cathéter au museau et à l'avant-membre gauche à l'aide de ruban adhésif. Après avoir confirmé l'absence de réponse à une pincée des orteils, utiliser des ciseaux pointus pour retirer un centimètre carré de peau au-dessus de la paroi thoracique gauche.

Soulevez la couche de tissu adipeux mammaire et cautérisez tous les vaisseaux sanguins exposés. Ensuite, résectionnez le tissu adipeux et retirez la couche musculaire jusqu’à la cage thoracique, en prenant soin de ne pas sectionner la veine axillaire à la base du membre antérieur. Utilisez une pince pour soulever la sixième côte.

Ensuite, en tenant les ciseaux pointus selon un angle faible de cinq degrés, couper la côte près du bord de l'ouverture dans la peau. Retirer quatre côtes consécutives afin d'élargir l'ouverture dans la paroi thoracique, exposant ainsi tout le lobe pulmonaire. Puis transférer délicatement la souris sur la platine du microscope pour l'imagerie.

Avec le vide désactivé, remplir la chambre intérieure de la fenêtre sous vide avec du PBS. Retourner la souris et positionner le poumon exposé au-dessus de la fenêtre de la lamelle d'imagerie sous vide. Ensuite, activer lentement le vide.

Placer un harnais de contention, constitué d'un morceau de papier absorbant plié en deux, deux fois sur la poitrine de la souris, puis fixer le harnais à la plaque de la platine à l'aide de ruban adhésif. Ensuite, attacher un oxymètre de pouls à la patte de l'animal. Puis placer la chambre environnementale sur la platine et allumer le chauffage afin de maintenir la souris à une température physiologique.

Lorsque l'animal est en place, approchez l'objectif de 25 par 95 d'ouverture numérique du coverslip. En mode épifluorescence, visualisez le canal fitzy et mettez le tissu pulmonaire au point. Ensuite, chargez une seringue stérile avec 100 microlitres de la suspension de cellules tumorales, retirez la seringue de PBS du cathéter de la veine caudale et connectez la seringue contenant les cellules tumorales.

Injectez lentement les cellules tumorales dans la veine de la queue. Ensuite, reconnectez la seringue de PBS au cathéter de la veine de la queue et localisez les cellules tumorales dans tout le tissu pulmonaire à l’aide de l’oculaire du microscope. Remplacez maintenant la seringue de PBS par une seringue chargée de 100 microlitres de dextrane rhodamine et injectez lentement le dextrane dans la souris via le cathéter de la queue.

Après l'administration de la dextrane, effectuer un lavage stérile de 50 microlitres au PBS. Ensuite, acquérir des images à chacun des emplacements tumoraux précédemment identifiés afin de visualiser l'écoulement et l'intégrité de la vascularisation. Vingt-quatre heures après l'injection, des cellules tumorales isolées peuvent être observées en interaction avec des macrophages et des monocytes au sein de la vascularisation.

La stabilité de l'imagerie est telle que des Z-stacks séquentiels du champ peuvent être acquis et une reconstruction tridimensionnelle peut être générée. Ici, une mosaïque de cinq par cinq champs d'imagerie, couvrant un champ de vision de 890 microns, sur 200 et cinq minutes, à 15 microns sous la surface du poumon d'une lésion métastatique unique, 12 jours après injection, est présentée. Malgré l'importance du champ de vision, la haute résolution des images sous-jacentes, composant la mosaïque, permet la capture d'événements subcellulaires, tels que la mitose d'une cellule unique, comme en témoigne la séparation des chromosomes.

L'injection intravasculaire d'un dextran marqué par un fluorochrome et de haut poids moléculaire entraîne l'étiquetage de la lumière vasculaire ; toutefois, les érythrocytes et les leucocytes circulants non marqués peuvent obstruer le dextran. Dans les petits capillaires du poumon, cette obstruction provoque des clignotements du signal du dextran et une perte de définition des limites vasculaires. La grande stabilité spatiale offerte par ce protocole permet une moyenne temporelle du canal sanguin sans flou, ce qui permet de restaurer les occlusions temporaires.

Les autres canaux de signal peuvent ensuite être superposés à la vascularisation pour offrir une vue claire des limites des vaisseaux. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en environ une heure si elle est effectuée correctement. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de veiller à ne pas sectionner de gros vaisseaux sanguins sans les cautériser au préalable et d'éviter tout contact avec le tissu pulmonaire.

Grâce à cette procédure, les premiers stades de la dissémination et de la prolifération des cellules tumorales peuvent être visualisés. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment réaliser un imagerie intravitale dans un poumon intact à l’aide d’une fenêtre d’imagerie stabilisée par vide. Merci d’avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.