Patch Clamp Enregistrement de cellules amacrines Starburst dans un plat de montage Préparation de Deafferentated Souris Retina

L’objectif global de cette procédure est d’effectuer un enregistrement par patch clamp de cellules entières à partir de neurones rétiniens internes dans la préparation de la rétine de souris à montage plat. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la neurobiologie rétinienne telles que la diversité des neurones, leurs connexions synaptiques dans des conditions normales et pathologiques. Le principal avantage de cette technique est que les connexions verticales et latérales sont préservées, ce qui permet d’étudier les circuits rétiniens à grandes composantes latérales.

En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode auront du mal car la rétine est un tissu mince et délicat qui doit être manipulé avec beaucoup de soin et de patience. La pratique, cependant, est le meilleur moyen de le maîtriser. Pour commencer cette procédure, roulez les globes oculaires de la souris dans une serviette en papier propre pour éliminer tout sang.

Ensuite, immergez-les dans la solution de mammifère carbogéné Ringer. Ensuite, percez un trou sur le limbe avec une aiguille de calibre 23 et coupez les globes oculaires en coupant le long du limbe avec des micro-ciseaux. Ensuite, retirez la cornée et le cristallin à l’aide d’une pince fine.

Pour le montage rétinien entier, décollez doucement toute la rétine de l’épithélium pigmenté avec une pince fine et faites quatre coupes orthogonales de 1,5 à deux millimètres du bord vers la tête du nerf optique. Après cela, plongez une membrane de nitrocellulose perforée dans la boîte et faites glisser doucement la rétine dessus avec le côté GCL vers le haut. Ensuite, placez la tête du nerf optique dans le trou central lors de la préparation d’une rétine entière.

Par la suite, transférez la membrane avec la rétine dans une autre parabole propre. Aplatissez doucement la rétine en croix de Malte avec un pinceau fin et posez les quatre bords sur les trous. Épongez la membrane de nitrocellulose avec un morceau de papier filtre sec et retirez la membrane vitreuse et la membrane limitante interne à l’aide d’une pince et d’un pinceau.

Assurez-vous que tous les bords rétiniens sont bien fixés à la membrane avant de transférer l’ensemble dans la chambre d’enregistrement avec une gaine en verre scellée au fond. Fixez la membrane à la lamelle avec de la graisse sous vide et réhydratez la rétine avec la solution externe. Veillez à ne pas coincer de bulles d’air sous l’ensemble.

Ensuite, placez la chambre sur la platine d’un microscope vertical. Injectez dans la chambre une solution externe carbogénénée à 34 degrés Celsius à une vitesse d’environ trois millilitres par minute. Examinez d’abord la rétine sous une lentille subjective 10x.

Ensuite, utilisez une lentille d’immersion dans l’eau 60x pour voir les neurones GCL et INL sous DIC et le réglage épifluorescent. Pour visualiser tdTomato exprimant les SACs, utilisez une source de lumière LED blanche en combinaison avec un filtre d’excitation de 554 nanomètres et un filtre d’émission de 581 nanomètres. Dans cette procédure, filtrez la solution interne à travers un filtre à seringue dans le filament de remblayage personnalisé.

Ensuite, insérez le filament dans une micropipette fraîchement tirée et distribuez la solution interne près de la pointe jusqu’à ce que la solution recouvre le fil de l’électrode d’argent sur plus de cinq millimètres. Ensuite, fixez la micropipette sur un porte-électrode à l’aide d’une aspiration à travers laquelle la pression à l’intérieur de l’électrode peut être ajustée en poussant ou en tirant le piston d’une seringue en plastique de 10 millilitres connectée à un tube. Ensuite, placez la pipette sous l’objectif et abaissez-la à environ 100 micromètres au-dessus de la rétine.

En mode suiveur de courant, utilisez le décalage CC pour mettre à zéro le signal de tension CC stationnaire. Mesurez la résistance de la pipette en mode pince de courant en injectant des courants d’ondes carrées d’amplitude fixe à travers la pipette pendant qu’elle est dans le bain. Neutralisez la différence en tournant le bouton Raccess et utilisez la lecture sur celui-ci pour calculer la résistance de la pipette.

Après cela, amenez lentement l’électrode à environ 10 micromètres au-dessus de la rétine. Appliquez une pression positive sur l’électrode. Ensuite, observez le reflet changer près de la pointe de la pipette lorsqu’elle s’approche de la rétine.

Rapidement mais doucement, forcez la pipette dans le GCL et réduisez immédiatement la pression positive. Déplacez la pipette vers un neurone marqué et évitez de toucher d’autres neurones, des vaisseaux sanguins et des extrémités des cellules de Müller. Appliquez plus de pression positive, si nécessaire, pour éviter le colmatage de l’électrode.

Ensuite, positionnez la pointe de la pipette près du neurone marqué jusqu’à ce qu’une fossette soit visible. Ensuite, relâchez la pression positive et laissez la membrane plasmique rebondir sur la pointe de la pipette. Appliquez des courants négatifs de 20 à 120 picoampères à la pipette pour aider à la formation d’un joint gigaohm.

Il est important de permettre à la membrane cellulaire de rebondir après avoir relâché la pression positive, car une excellente étanchéité formée naturellement entre la membrane et l’ouverture de la pipette est importante pour préserver la morphologie cellulaire après l’enregistrement. Si nécessaire, appliquez une légère aspiration pour tirer la membrane plasmique dans la pipette. Attendre cinq minutes après la formation du joint pour rompre la membrane cellulaire afin de permettre l’élimination de la solution interne renversée par superfusion.

Une fois la membrane rompue et en mode de serrage actuel, activez la balance du pont et ajustez-la à l’aide du bouton Raccess. Enregistrez les courants postsynaptiques excitateurs et inhibiteurs en mode pince de tension en maintenant la cellule à des potentiels d’inversion. Après l’enregistrement, retirez délicatement la pipette du soma.

Transférez l’ensemble de la chambre dans un plat propre. Ensuite, détachez et rattachez la rétine sur une autre membrane de nitrocellulose aplatie sans percer de trous pour assurer la planéité de la rétine pendant la fixation. Le tissu est maintenant prêt à être coloré.

Ces images montrent que les cellules cholinergiques dans GCL et INL peuvent être identifiées de manière fiable par fluorescence tdTomato et ciblées pour l’enregistrement par patch clamp de cellules entières sous DIC. L’oscillation de leurs potentiels membranaires peut être révélée par l’enregistrement par pince de courant, et l’oscillation entraînée par les courants synaptiques inhibiteurs et excitateurs est révélée en maintenant les cellules à zéro millivolts et moins 75 millivolts respectivement dans les conditions de pince de tension. Ici, la caractérisation histologique post-hoke des cellules enregistrées indique la morphologie dendritique typique du SAC et les niveaux de stratification dans l’IPL.

Lors de cette procédure, il est important de ne pas oublier de fixer l’ensemble de la membrane rétinienne dans la chambre d’enregistrement et de le réhydrater sans piéger les bulles d’air en dessous de manière serrée et délicate pour fournir un échantillon enregistrable. Suite à cette procédure, d’autres méthodes telles que les enregistrements à double patch clamp peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires telles que si les oscillations des cellules multiples cibles sont entraînées par les mêmes mécanismes synaptiques. Après son développement, cette technique ouvre la voie aux chercheurs dans le domaine de la neurobiologie rétinienne pour explorer la synchronicité de l’oscillation entre les neurones rétiniens voisins dans les rétines dégénérées par les photorécepteurs.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’éliminer l’humeur vitrée et de préparer un support plat rétinien pour un enregistrement ciblé à grande échelle des neurones internes de la rétine.