Name: Préparation et In Vivo Lutilisation dune sonde basée sur les activités pour N -acylethanolamine Amidase Acid (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 1 s
Description: Découvrez la synthèse et l'utilisation de la sonde ARN14686 pour détecter la forme active de la N-acylethanolamine acid amidase (NAAA) dans des extraits cellulaires et des coupes tissulaires. Cette méthode offre des informations fiables sur l'état d'activation enzymatique in vivo.

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Les auteurs remercient le Nikon Imaging Center de l’Istituto Italiano di Tecnologia, Gênes, Italie (NIC@IIT).

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

L&#39;activité enzymatique est finement réglée à différents niveaux, y compris la transcription d&#39;ARN, la synthèse protéique, la translocation des protéines, modification post-traductionnelle, et une interaction protéine-protéine. Souvent, l&#39;expression de l&#39;enzyme seule ne tient pas compte de son activité. ABPP a été développé pour étudier l&#39;activité des protéines dans leur état natif. Deux éléments sont nécessaires: une sonde chimique qui se lie de manière covalente au site actif d&#39;une enzyme d&#39;...

Communément utilisé des méthodes pour étudier les profils d&#39;expression, les interactions et les fonctions des protéines, y compris liquides plates - formes de spectrométrie de chromatographie de masse pour l&#39; analyse de fusil de chasse 1,2, la levure méthodes deux hybrides 3,4, et des essais in vitro, sont limités en ce qu&#39;ils sont incapable d&#39;évaluer l&#39;activité des protéines dans leur état natif. par activité protéine profilage (ABPP) peut être utilisé pour combler cette lacune. Dans cette approche, des petites molécules sondes capables de se lier de manière covalente au site actif d&#39;une enzyme d&#39;intérêt sont conjugués à un groupe reporter qui permet la détection de la cible. Utilisation de chimie clic (CC), le journaliste peut être intégré dans la sonde ou peut être introduit après l&#39; engagement de la cible est survenue 5,6. Cette dernière procédure nécessite l&#39;utilisation de sondes contenant des groupes chimiques appropriés, tel qu&#39;un alcyne ou azoture terminal, qui peut être modifié avec un certain nombre de réactifs de rapporteur par des réactions bio-orthogonale SUCh comme le Cu (I) catalysées Huisgen [3 + 2] ou une cycloaddition 7-9 Staudinger ligation 10,11. Récemment, nous avons dévoilé le ARN14686 composé comme le premier ABP pour la in vitro et in vivo de détection de l&#39;hydrolase de cystéine, NAAA 12. NAAA catalyse la désactivation hydrolytique d&#39;acides gras saturés et mono - insaturés, y compris FAE oléoyléthanolamide (BAE) et palmitoyléthanolamide (PEA), qui sont des agonistes endogènes du récepteur nucléaire PPAR-alpha anti-inflammatoire 13-15. NAAA est principalement exprimé dans les macrophages et d&#39; autres cellules dérivées de monocytes, ainsi que dans les lymphocytes B 14,16, ce qui suggère un rôle dans la régulation de la réponse immunitaire innée. L&#39;enzyme est synthétisée dans le réticulum endoplasmique rugueux sous une forme inactive et est activé dans les compartiments acides de la cellule par un mécanisme autoprotéolytique 17. Le clivage autoprotéolytique génère une nouvelle cystéine -terminale N (C131 chez la souris et le rat, chez l&#39; homme C126), qui est le nucléophile chargé de l&#39; hydrolyse EAF 18,19. L&#39; inhibition pharmacologique de l&#39; activité NAAA modifie l&#39;équilibre de synthèse / dégradation EAF en faveur des niveaux cellulaires accrus du FAES 16,20,21. Plusieurs dérivés de β-lactone et de β-lactame a été démontré que pour inhiber l&#39; activité NAAA avec une puissance élevée et une sélectivité 16,22-26. Ces inhibiteurs agissent par S acylation de la cystéine catalytique 16,27,28. ARN14686 le composé a été conçu sur la base de la structure chimique de l&#39;inhibiteur à action systémique, de la sérine dérivé β-lactame NAAA, ARN726 (4-cyclohexylbutyl- N - [(S) -2-oxoazétidin-3-yl] carbamate) 16. Le groupe 4-butyl-cyclohexyle de ARN726 a été remplacé par une chaîne aliphatique C9 saturé portant une étiquette alcyne terminal pour CC ultérieure conjugaison avec un journaliste de tag azoture de palier. Nous avons choisi de concevoir un ABP en deux étapes pour Minimally modifier la structure de l&#39;échafaudage d&#39;origine, conservant ainsi l&#39;affinité de la sonde pour NAAA. De plus, en évitant l&#39;introduction d&#39;étiquettes volumineux, une telle sonde pourrait être plus approprié pour le traitement in vivo d&#39;une ABP directe. ARN14686 inhibe NAAA avec une puissance élevée (hNAAA CI50 = 6 nM, rNAAA IC50 = 13 nM) en formant un adduit covalent avec la cysteine catalytique de l&#39;enzyme 12. Des expériences sur des rats vivants ont montré que la sonde est sélective dans la capture NAAA exprimé dans les poumons. Céramidase acide, une autre cystéine amidase qui partage une identité de 33-34% avec NAAA, a également été identifiée comme étant une cible de faible affinité pour l&#39;utilisation de concentrations élevées de sonde (10 uM in vitro, 10 mg / ml par voie intraveineuse, iv) 12. Nous avons également utilisé ARN14686 pour étudier la présence de NAAA actif dans les tissus de rats enflammées après l&#39; administration de l&#39;adjuvant complet de Freund (CFA) 29. Ici, nous décrivons un protocole pour les preparatisur des ARN14686 (Figure 1) et son application à l&#39;enquête de NAAA activation ex vivo. A titre d&#39;exemple, nous décrivons une procédure expérimentale pour visualiser NAAA dans les pattes de rat après administration CFA. Dans cette expérience, les protéines sont extraites à partir du tissu de la patte après l&#39;injection intraveineuse de la sonde, et le protéome PBA marqué est soumis à CC avec de la biotine-azide. échantillons biotinylés sont enrichis en utilisant des billes de streptavidine, et empreintes de protéines sont effectuées. Dans une autre application, on décrit la localisation de NAAA actif par microscopie de fluorescence dans les poumons de souris provenant de souris traitées à la sonde. Dans ce cas, le tissu est sectionné et sections sont soumis à CC pour l&#39;addition de rhodamine. Un système de workflow est illustré à la figure 2.

<table><tbody><tr><td>1,1'-sulfonyldiimidazole&nbsp ;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>367818</td><td>Nocif</td></tr><tr><td>2-dipyridylcarbonate</td><td>Fluorochem</td><td>11331</td><td>Nocif</td></tr><tr><td>2-méthylbutane</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M32631</td><td>Inflammable, toxique, dangereux pour l’environnement aquatique</td></tr><tr><td>4-(diméthylamino)pyridine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>107700</td><td></td></tr><tr><td>Acide acétique</td><td>toxique Sigma Aldrich</td><td>695092</td><td>Inflammable, corrosif</td></tr><tr><td>Acétonitrile&nbsp ;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>34998</td><td>Charbon actif inflammable et toxique</td></tr><tr><td></td><td>Sigma Aldrich</td><td>161551</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure d’ammonium</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9434</td><td>Nocif</td></tr><tr><td>Azide-PEG3-Biotine</td><td>Jena Biosciences</td><td>CLK-AZ104P4</td><td></td></tr><tr><td>Azide-PEG3-Fluor 545</td><td>Jena Biosciences</td><td>CLK-AZ109</td><td></td></tr><tr><td>Kit de dosage des protéines BCA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>Colonnes de bio-spin</td><td>Biorad</td><td>732-6204</td><td></td></tr><tr><td>Biotine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B4501</td><td></td></tr><tr><td>Tampon bloquant</td><td>Li-Cor Biosciences</td><td>927-40000</td><td></td></tr><tr><td>&beta ;-mercaptoethanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>Albumine sérique de Bovin hautement toxique (BSA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7030</td><td></td></tr><tr><td>Bleu de bromophénol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B0126</td><td></td></tr><tr><td>Bruker Avance III 400</td><td>Bruker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Celite</td><td>Sigma Aldrich</td><td>419931</td><td>Danger pour la santé</td></tr><tr><td>Nitrate d’ammonium céric</td><td>Sigma Aldrich</td><td>22249</td><td>Hydrate de chloral oxydant et nocif</td></tr><tr><td></td><td>Sigma Aldrich</td><td>C8383</td><td></td></tr><tr><td>CuSO4.5H2O&nbsp ;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>209198</td><td>Toxique</td></tr><tr><td>Cyclohexadiène</td><td>Sigma Aldrich</td><td>125415</td><td>Inflammable, Danger pour la santé</td></tr><tr><td>Cyclohexane</td><td>Sigma Aldrich</td><td>34855</td><td>Inflammable, Nocif, Danger pour la santé, Danger pour l’environnement</td></tr><tr><td>Dichlorométhane</td><td>Sigma Aldrich</td><td>34856</td><td>Nocif, Danger pour la santé</td></tr><tr><td>Éther diéthylique</td><td>Sigma Aldrich</td><td>296082</td><td>Inflammable, </td></tr><tr><td>Diméthylsulfoxyde nocif (DMSO)</td><td>Acros Organics</td><td>348441000</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxyde d6 (DMSO-d6)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>175943</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>2860</td><td>Inflammable, Nocif</td></tr><tr><td>Acétate d’éthyle</td><td>Sigma Aldrich</td><td>34858</td><td>Inflammable, Glycérol nocif</td></tr><tr><td></td><td>Sigma Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Irdye 680-LT Streptavidine</td><td>Li-Cor Biosciences</td><td>925-68031</td><td></td></tr><tr><td>IRDye680-LT Streptavidin&nbsp ;</td><td>Licor</td><td>925-68031</td><td>Centrifuger brièvement avant utilisation pour précipiter des complexes protéiques</td></tr><tr><td>Méthanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>34966</td><td>Méthanol hautement toxique</td></tr><tr><td></td><td>Sigma Aldrich</td><td>34860</td><td>Inflammable, Toxique, Danger pour la santé</td></tr><tr><td>N-(3-Dimethylaminopropyl)-N&prime ; Chlorhydrate de -éthylcarbodiimide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E7750</td><td>Nocif, Corrosif</td></tr><tr><td>N-diisopropyléthylamine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D125806</td><td>Inflammable, Corrosif, Toxique</td></tr><tr><td>N-diméthylformamide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>227056</td><td>Inflammable, Nocif, Dangereux pour la santé</td></tr><tr><td>N-Cbz-L-Serine</td><td>Fluorochem</td><td>M03053</td><td></td></tr><tr><td></td> Microscopie <td></td><td>confocale Nikon A1</td> nocive <td>Nikon Lire le manuel d’utilisation</td></tr><tr><td>NuPAGE 4-12 % Bis-Tris gel</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NP0335BOX</td><td></td></tr><tr><td>Palladium sur carbone</td><td>Sigma Aldrich</td><td>330108</td><td></td></tr><tr><td>p-anisidine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A88255</td><td>Toxique, Danger pour la santé, Danger</td></tr> <tr><td>pour l’environnementParaformaldéhyde</td><td>sigma Aldrich</td><td>441244</td><td>Toxique, nocif pour les voies respiratoires, corrosif, falsifiable</td></tr><tr><td>Poly(éthylène glycol)&nbsp ;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3265</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold support anti-effacement avec DAPI&nbsp ;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P36931</td><td>Eviter la formation de bulles</td></tr><tr><td>Cocktail d’inhibiteurs de protéase</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P8340</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonate de sodium</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>Dodécylsulfate de sodium (SDS)&nbsp ;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L3771</td><td>Toxique, corrosif, falmmable</td></tr><tr><td>Hydrure de sodium&nbsp ;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>452912</td> Sulfate de sodium <td>inflammable</td></tr><tr><td></td><td>Sigma Aldrich</td><td>239313</td><td></td></tr><tr><td>Starion FLA-9000 immag scanner</td><td>FUJIFILM</td><td></td><td>Lire le mode d’emploi</td></tr><tr><td>Streptavidin agarose</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>20349</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7903</td><td></td></tr><tr><td>Tert-butanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>360538</td><td>Toxique, inflammable</td></tr><tr><td>Tétrahydrofurane</td><td>Sigma Aldrich</td><td>186562</td><td>Inflammable, nocif, dangereux pour la santé</td></tr><tr><td>Thiourea</td><td>Acros Organics</td><td>424542500</td><td>Toxique, chaud à 50 &deg ; C pour dissoudre</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma Aldrich</td><td>RDD008</td><td></td></tr><tr><td>Tris(2-carboxyéthyl)phosphine (TCEP)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C4706</td><td></td></tr><tr><td>Tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)méthyl]amine (TBTA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>678937</td><td></td></tr><tr><td>Triton-x100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X100</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9416</td><td></td></tr><tr><td>Tween-80</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1754</td><td></td></tr><tr><td>Ultra turrax IKA T18 homogénéisateur de tissus de base</td><td>IKA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Undec-10-yn-1-ol</td><td>Fluorochem</td><td>13739</td><td>Nocif</td></tr><tr><td>Urea</td><td>Sigma Aldrich</td><td>U5378</td><td>Toxique, chaud à 50 &deg ; C pour dissoudre</td></tr></tbody></table>

préparation et<em&gt; in vivo</em&gt; l&#39;utilisation d&#39;une sonde basée sur les activités pour<em&gt; n</em&gt; -acylethanolamine amidase acid

Preparation and In Vivo Use of an Activity-based Probe for N-acylethanolamine Acid Amidase

Le profilage de protéines à base d&#39;activité (ABPP) est une méthode pour l&#39;identification d&#39;une enzyme d&#39;intérêt dans un protéome complexe par l&#39;utilisation d&#39;une sonde chimique qui cible les sites actifs de l&#39;enzyme. Un marqueur rapporteur introduit dans la sonde permet la détection de l&#39;enzyme marquée par un balayage en gel par fluorescence, de la protéine par transfert, la microscopie de fluorescence, ou par spectrométrie de masse Chromatographie en phase liquide. Ici, nous décrivons la préparation et l&#39; utilisation du ARN14686 composé, une sonde à base d&#39;activité click chemistry (CC-ABP) qui reconnaît sélectivement la N amidase d&#39;acide -acylethanolamine enzymatique (PNEDA). NAAA est une hydrolase cystéine qui favorise l&#39;inflammation en désactivant endogène récepteur peroxysomes proliferator-activated (PPAR) agonistes de -Alpha tels que palmitoyléthanolamide (PEA) et oléoyléthanolamide (OEA). NAAA est synthétisée sous la forme d&#39;une proenzyme inactive pleine longueur, qui est activé par autoprotéolyse dans le pH acide du lysosome. études de localisation have montré que NAAA est principalement exprimé dans les macrophages et d&#39;autres cellules dérivées de monocytes, ainsi que dans les lymphocytes B. Nous fournissons des exemples de la façon dont ARN14686 peut être utilisée pour détecter et quantifier NAAA actif ex vivo dans les tissus de rongeurs par transfert de la protéine et la microscopie de fluorescence.

ARN14686 a été conçu sur la base de l&#39;échafaudage de l&#39;inhibiteur ARN726 NAAA. Le groupe 4-butyl-cyclohexyle , de ARN726 a été substituée par une chaîne aliphatique saturée C9 portant une étiquette alcyne terminal (figure 1). La balise alcyne a été introduite afin de permettre l&#39;utilisation d&#39;une procédure d&#39;étiquetage en deux étapes pour ajouter un fluorophore ou une molécule biotine via CC. Cette caractéristique rend ARN14686 un outil très polyvalen...

Ici, nous décrivons la préparation et l&#39; utilisation d&#39;une sonde basée sur les activités (ARN14686, undéc-10-ynyl- N - [(3S) -2-oxoazétidin-3-yl] carbamate) , qui permet la détection et la quantification de la forme active de l&#39;enzyme proinflammatoire N amidase d&#39;acide -acylethanolamine (PNEDA), à la fois in vitro et ex vivo.

Préparation et<em&gt; In Vivo</em&gt; L&#39;utilisation d&#39;une sonde basée sur les activités pour<em&gt; N</em&gt; -acylethanolamine Amidase Acid

Activity-based protein profiling (ABPP) is a method for the identification of an enzyme of interest in a complex proteome through the use of a chemical ...

L'objectif général de cette procédure est de présenter la synthèse de la sonde basée sur l'activité, ARN 14 six huit six, spécifique de la N-acyléthanolamine acide amidase, ou NAAA, et de décrire son utilisation pour la détection de l'enzyme catalytiquement active dans des extraits cellulaires et des sections tissulaires. Cette méthode peut aider à répondre à des questions concernant la fonction in vivo de la NAAA, en fournissant des informations sur l'activation de la NAAA dans différentes conditions physiologiques et pathologiques, telles que les maladies inflammatoires et neurodégénératives. Son principal avantage réside dans la simplicité de la manipulation après la réaction de la NAAA avec la sonde, offrant ainsi des informations fiables sur l'état d'activation in vivo de l'enzyme.Un autre avantage est que, contrairement aux anticorps spécifiques, notre sonde détecte uniquement la forme active de l'enzyme, ce qui est utile pour l'état en microscopie de fluorescence. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car elle combine différentes expertises qui s'assemblent en une histoire complète, allant de la synthèse adéquate jusqu'à ses applications finales. Dans un ballon de 50 millilitres à fond rond, dissoudre 350 milligrammes d'undécynénol et trois virgule cinq millilitres de dichlorométhane anhydre.Ensuite, ajoutez 25 milligrammes de DMAP et 530 milligrammes de DPC à cette solution. Agitez le mélange à température ambiante pendant 16 heures. Après 16 heures, ajoutez 20 millilitres de dichlorométhane à la solution.Transférez le mélange dans une ampoule à décanter. Ajoutez 15 millilitres d'eau. Agitez le mélange et laissez les deux phases se séparer.Ouvrez ensuite le robinet, récupérez la phase organique inférieure, fermez le robinet, puis reversez la phase organique dans l'entonnoir. Ajoutez 15 millilitres d'une solution saturée de bicarbonate de sodium au mélange. Agitez l'ampoule à décanter et laissez les deux phases se séparer.Après avoir séché la couche organique avec du sulfate de sodium, filtrez-la à travers du coton dans un ballon rond à trois cols. Ensuite, évaporez la couche organique à sec sous pression réduite à l’aide d’un évaporateur rotatif. Pesez le ballon et obtenez 600 milligrammes d’huile, qui est un mélange de deux pyridyl undécynyl carbonate et d’undécynol deux oxypyridine carboxylate dans un rapport de un virgule sept à un.Dans un ballon de 10 millilitres à fond rond, dissoudre 60 milligrammes d'oxo asétydénol ammonium aséate dans deux millilitres de dichlorométhane anhydre. Refroidir la solution à zéro degré Celsius dans un bain de glace, puis ajouter 81 microlitres de diazapropanéthylamine goutte à goutte. Ensuite, dissoudre 350 milligrammes du mélange brut contenant l'undécynol deux carboxylate d'oxyphényridine dans deux millilitres de dichlorométhane anhydre.Ajouter le mélange dissous à la solution et agiter à température ambiante pendant 15 heures. Ensuite, évaporer le solvant à sèche sous pression réduite à l’aide d’un évaporateur rotatif. Purifier le composé par chromatographie sur colonne de gel de silice en utilisant un appareil automatisé de chromatographie sur colonne.Commencez par absorber l'échantillon sur gel de silice. Après avoir équilibré la colonne avec du cyclohexène, chargez l'échantillon dans la cartouche. Éluerez l'échantillon avec de l'acétate d'éthyle dans l'hexane cyclique, en passant de zéro à 100 %, en recueillant les pics dans des tubes à essai.Évaporer le solvant des fractions correspondant au composé jusqu'à séchage sous pression réduite à l'aide d'un évaporateur rotatif pour obtenir 40 milligrammes d'un solide blanc. Après avoir pré-épuré l'échantillon comme décrit dans le protocole écrit, ajouter 11,3 microlitres d'une solution mère de 5 millimolaire d'azide de polyéthylène glycol biotine et vortexer. Puis ajouter 11,3 microlitres d'une solution mère de 50 millimolaire de TCEP fraîchement préparé à l'échantillon et vortexer.Après avoir pré-mélangé 34 microlitres d'une solution travail fraîchement préparée de TBTA à 1,7 millimolaire avec 11,3 microlitres d'une solution mère de sulfate de cuivre à 50 millimolaire, ajouter 45,3 millilitres de cette solution à l'échantillon et vortexer. Utiliser des récipients étiquetés. Incuber la réaction à 25 degrés Celsius pendant au moins deux heures.Après une heure d'incubation, observer la précipitation des protéines et mélanger la réaction. Centrifuger l'échantillon pendant quatre minutes à 6 500 ×g à quatre degrés Celsius. Après avoir éliminé le surnageant, ajouter 750 microlitres de méthanol froid et resuspendre le culot par sonication à l’aide d’un sonicateur à sonde pendant cinq secondes.Ensuite, centrifugez l'échantillon pendant quatre minutes à 6 500 ×g à quatre degrés Celsius. Retirez le surnageant à l’aide d’une seringue et d’une aiguille. Après deux lavages supplémentaires avec du méthanol froid, ajoutez 325 microlitres de SDS à 2,5 % dans du PBS au culot protéique.Soniquez l'échantillon trois fois pendant cinq secondes. Ensuite, chauffez l'échantillon pendant cinq minutes à 65 degrés Celsius. Après la sonication, centrifugez l'échantillon pendant cinq minutes à 6 500 ×g à température ambiante.Transférez ensuite le surnageant dans un tube propre de 15 millilitres et ajoutez 1,4 millilitre de PBS au surnageant afin de diluer la concentration de SDS à 0,5 %. Pour l'enrichissement par streptavidine, ajustez d'abord le volume de l'échantillon à 4,2 millilitres à l'aide de PBS. Ajoutez ensuite 40 microlitres d'une suspension à 50 % d'agarose streptavidine préalablement lavée, en utilisant une pipette munie d'une pointe coupée.Incuber le mélange pendant deux heures à température ambiante sous agitation rotative. Après centrifugation pendant deux minutes à 1 400 ×g, retirer le surnageant sans sécher le culot de billes. Utiliser le surnageant résiduel pour transférer les billes vers une colonne de centrifugation de un millilitre et laver la colonne par gravité avec un millilitre de SDS à un pour cent dans du PBS.Poursuivez le lavage des billes avec de l’urée à six molaire, puis avec du PBS comme décrit dans le protocole écrit. Ensuite, utilisez 500 microlitres de PBS pour transférer les billes lavées dans un tube de 1,5 millilitre. Après une centrifugation de l’échantillon pendant deux minutes à 1 400 ×g, aspirez délicatement le surnageant à l’aide d’une seringue et d’une aiguille.Pour éluer les protéines liées à la résine, ajouter 25 microlitres de tampon d'élution au culot de résine et incuber pendant 15 minutes à température ambiante, puis pendant 15 minutes à 95 degrés Celsius. Ajouter environ 400 microlitres de mélange de chimie click aux tranches de tissu préparées conformément au protocole décrit dans le texte. Veiller à ce que le volume choisi de mélange de chimie click soit suffisant pour recouvrir les tranches.Incubez ensuite les tranches de tissu pendant une heure à température ambiante, à l'abri de la lumière. Après l'incubation, lavez les échantillons avec du PBS pendant cinq minutes, puis avec du méthanol froid pendant cinq minutes. Lavez ensuite les tranches de tissu trois fois avec une solution contenant un pour cent de Tween 20 et zéro virgule cinq millimolaire de EDTA dans du PBS, pendant deux minutes.Lavez enfin les tranches une dernière fois avec du PBS pendant cinq minutes. Après séchage à l'air, ajoutez une goutte de milieu de montage antifade contenant du DAPI. Fermez les échantillons avec des lamelles et scellez-les avec du vernis.Pour la synthèse de la sonde, l'undécynénol est activé par le carbonate de dipyrényle en présence de quatre diméthylaminopyridines catalytiques afin de produire un carbonate mixte, qui réagit ensuite avec le lactame aminé. Le bêta-lactame, ou tête de la sonde, réagit avec le site actif de la NAAA, tandis que l'alkyne terminal peut être fonctionnalisé avec une étiquette rapporteur par chimie click. L'ARN 14 six huit six a été utilisé pour détecter l'activation de la NAAA dans des extraits protéiques de pattes enflammées de rats par blocage protéique. Chez les rats naïfs, aucun signal NAAA n'est détecté.En revanche, chez les rats traités avec l'adjuvant de Freund complet, une bande marquée correspondant à la NAAA active est observée. Une autre application de l'ARN 14 six huit six est l'imagerie tissulaire par microscopie de fluorescence. Ici, les cellules rouges représentent les macrophages alvéolaires, qui sont positifs pour la NAAA active.La NAAA est localisée dans des structures vésiculaires diffuses, comme on peut l'observer à un grossissement plus élevé. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment synthétiser et utiliser l'ARN 14 six huit six pour détecter la NAAA active dans les tissus, tant par immunotransfert protéique que par microscopie de fluorescence. En outre, bien que ce protocole soit spécifique à notre cible, les applications de la sonde que nous décrivons pourraient facilement être adaptées à d'autres sondes basées sur l'activité, spécifiques à des cibles autres que la NAAA.

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