Préparation et

L'objectif général de cette procédure est de présenter la synthèse de la sonde basée sur l'activité, ARN 14 six huit six, spécifique de la N-acyléthanolamine acide amidase, ou NAAA, et de décrire son utilisation pour la détection de l'enzyme catalytiquement active dans des extraits cellulaires et des sections tissulaires. Cette méthode peut aider à répondre à des questions concernant la fonction in vivo de la NAAA, en fournissant des informations sur l'activation de la NAAA dans différentes conditions physiologiques et pathologiques, telles que les maladies inflammatoires et neurodégénératives. Son principal avantage réside dans la simplicité de la manipulation après la réaction de la NAAA avec la sonde, offrant ainsi des informations fiables sur l'état d'activation in vivo de l'enzyme.

Un autre avantage est que, contrairement aux anticorps spécifiques, notre sonde détecte uniquement la forme active de l'enzyme, ce qui est utile pour l'état en microscopie de fluorescence. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car elle combine différentes expertises qui s'assemblent en une histoire complète, allant de la synthèse adéquate jusqu'à ses applications finales. Dans un ballon de 50 millilitres à fond rond, dissoudre 350 milligrammes d'undécynénol et trois virgule cinq millilitres de dichlorométhane anhydre.

Ensuite, ajoutez 25 milligrammes de DMAP et 530 milligrammes de DPC à cette solution. Agitez le mélange à température ambiante pendant 16 heures. Après 16 heures, ajoutez 20 millilitres de dichlorométhane à la solution.

Transférez le mélange dans une ampoule à décanter. Ajoutez 15 millilitres d'eau. Agitez le mélange et laissez les deux phases se séparer.

Ouvrez ensuite le robinet, récupérez la phase organique inférieure, fermez le robinet, puis reversez la phase organique dans l'entonnoir. Ajoutez 15 millilitres d'une solution saturée de bicarbonate de sodium au mélange. Agitez l'ampoule à décanter et laissez les deux phases se séparer.

Après avoir séché la couche organique avec du sulfate de sodium, filtrez-la à travers du coton dans un ballon rond à trois cols. Ensuite, évaporez la couche organique à sec sous pression réduite à l’aide d’un évaporateur rotatif. Pesez le ballon et obtenez 600 milligrammes d’huile, qui est un mélange de deux pyridyl undécynyl carbonate et d’undécynol deux oxypyridine carboxylate dans un rapport de un virgule sept à un.

Dans un ballon de 10 millilitres à fond rond, dissoudre 60 milligrammes d'oxo asétydénol ammonium aséate dans deux millilitres de dichlorométhane anhydre. Refroidir la solution à zéro degré Celsius dans un bain de glace, puis ajouter 81 microlitres de diazapropanéthylamine goutte à goutte. Ensuite, dissoudre 350 milligrammes du mélange brut contenant l'undécynol deux carboxylate d'oxyphényridine dans deux millilitres de dichlorométhane anhydre.

Ajouter le mélange dissous à la solution et agiter à température ambiante pendant 15 heures. Ensuite, évaporer le solvant à sèche sous pression réduite à l’aide d’un évaporateur rotatif. Purifier le composé par chromatographie sur colonne de gel de silice en utilisant un appareil automatisé de chromatographie sur colonne.

Commencez par absorber l'échantillon sur gel de silice. Après avoir équilibré la colonne avec du cyclohexène, chargez l'échantillon dans la cartouche. Éluerez l'échantillon avec de l'acétate d'éthyle dans l'hexane cyclique, en passant de zéro à 100 %, en recueillant les pics dans des tubes à essai.

Évaporer le solvant des fractions correspondant au composé jusqu'à séchage sous pression réduite à l'aide d'un évaporateur rotatif pour obtenir 40 milligrammes d'un solide blanc. Après avoir pré-épuré l'échantillon comme décrit dans le protocole écrit, ajouter 11,3 microlitres d'une solution mère de 5 millimolaire d'azide de polyéthylène glycol biotine et vortexer. Puis ajouter 11,3 microlitres d'une solution mère de 50 millimolaire de TCEP fraîchement préparé à l'échantillon et vortexer.

Après avoir pré-mélangé 34 microlitres d'une solution travail fraîchement préparée de TBTA à 1,7 millimolaire avec 11,3 microlitres d'une solution mère de sulfate de cuivre à 50 millimolaire, ajouter 45,3 millilitres de cette solution à l'échantillon et vortexer. Utiliser des récipients étiquetés. Incuber la réaction à 25 degrés Celsius pendant au moins deux heures.

Après une heure d'incubation, observer la précipitation des protéines et mélanger la réaction. Centrifuger l'échantillon pendant quatre minutes à 6 500 ×g à quatre degrés Celsius. Après avoir éliminé le surnageant, ajouter 750 microlitres de méthanol froid et resuspendre le culot par sonication à l’aide d’un sonicateur à sonde pendant cinq secondes.

Ensuite, centrifugez l'échantillon pendant quatre minutes à 6 500 ×g à quatre degrés Celsius. Retirez le surnageant à l’aide d’une seringue et d’une aiguille. Après deux lavages supplémentaires avec du méthanol froid, ajoutez 325 microlitres de SDS à 2,5 % dans du PBS au culot protéique.

Soniquez l'échantillon trois fois pendant cinq secondes. Ensuite, chauffez l'échantillon pendant cinq minutes à 65 degrés Celsius. Après la sonication, centrifugez l'échantillon pendant cinq minutes à 6 500 ×g à température ambiante.

Transférez ensuite le surnageant dans un tube propre de 15 millilitres et ajoutez 1,4 millilitre de PBS au surnageant afin de diluer la concentration de SDS à 0,5 %. Pour l'enrichissement par streptavidine, ajustez d'abord le volume de l'échantillon à 4,2 millilitres à l'aide de PBS. Ajoutez ensuite 40 microlitres d'une suspension à 50 % d'agarose streptavidine préalablement lavée, en utilisant une pipette munie d'une pointe coupée.

Incuber le mélange pendant deux heures à température ambiante sous agitation rotative. Après centrifugation pendant deux minutes à 1 400 ×g, retirer le surnageant sans sécher le culot de billes. Utiliser le surnageant résiduel pour transférer les billes vers une colonne de centrifugation de un millilitre et laver la colonne par gravité avec un millilitre de SDS à un pour cent dans du PBS.

Poursuivez le lavage des billes avec de l’urée à six molaire, puis avec du PBS comme décrit dans le protocole écrit. Ensuite, utilisez 500 microlitres de PBS pour transférer les billes lavées dans un tube de 1,5 millilitre. Après une centrifugation de l’échantillon pendant deux minutes à 1 400 ×g, aspirez délicatement le surnageant à l’aide d’une seringue et d’une aiguille.

Pour éluer les protéines liées à la résine, ajouter 25 microlitres de tampon d'élution au culot de résine et incuber pendant 15 minutes à température ambiante, puis pendant 15 minutes à 95 degrés Celsius. Ajouter environ 400 microlitres de mélange de chimie click aux tranches de tissu préparées conformément au protocole décrit dans le texte. Veiller à ce que le volume choisi de mélange de chimie click soit suffisant pour recouvrir les tranches.

Incubez ensuite les tranches de tissu pendant une heure à température ambiante, à l'abri de la lumière. Après l'incubation, lavez les échantillons avec du PBS pendant cinq minutes, puis avec du méthanol froid pendant cinq minutes. Lavez ensuite les tranches de tissu trois fois avec une solution contenant un pour cent de Tween 20 et zéro virgule cinq millimolaire de EDTA dans du PBS, pendant deux minutes.

Lavez enfin les tranches une dernière fois avec du PBS pendant cinq minutes. Après séchage à l'air, ajoutez une goutte de milieu de montage antifade contenant du DAPI. Fermez les échantillons avec des lamelles et scellez-les avec du vernis.

Pour la synthèse de la sonde, l'undécynénol est activé par le carbonate de dipyrényle en présence de quatre diméthylaminopyridines catalytiques afin de produire un carbonate mixte, qui réagit ensuite avec le lactame aminé. Le bêta-lactame, ou tête de la sonde, réagit avec le site actif de la NAAA, tandis que l'alkyne terminal peut être fonctionnalisé avec une étiquette rapporteur par chimie click. L'ARN 14 six huit six a été utilisé pour détecter l'activation de la NAAA dans des extraits protéiques de pattes enflammées de rats par blocage protéique. Chez les rats naïfs, aucun signal NAAA n'est détecté.

En revanche, chez les rats traités avec l'adjuvant de Freund complet, une bande marquée correspondant à la NAAA active est observée. Une autre application de l'ARN 14 six huit six est l'imagerie tissulaire par microscopie de fluorescence. Ici, les cellules rouges représentent les macrophages alvéolaires, qui sont positifs pour la NAAA active.

La NAAA est localisée dans des structures vésiculaires diffuses, comme on peut l'observer à un grossissement plus élevé. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment synthétiser et utiliser l'ARN 14 six huit six pour détecter la NAAA active dans les tissus, tant par immunotransfert protéique que par microscopie de fluorescence. En outre, bien que ce protocole soit spécifique à notre cible, les applications de la sonde que nous décrivons pourraient facilement être adaptées à d'autres sondes basées sur l'activité, spécifiques à des cibles autres que la NAAA.