Une procédure mécanique simple pour créer Limbal Carence de cellules souches dans la souris
17 novembre 2016
L'article suivant fournit, une technique reproductible facile de créer efficacement un modèle de souris durable de la carence en cellules souches limbiques (LSCD). Ce modèle animal est utile pour tester et comparer l'efficacité des traitements pour les maladies de cellules souches limbiques.
L’objectif global de cette procédure est de créer un modèle murin reproductible, durable et persistant de déficience en cellules souches limbiques. Cette technique simple fournit un modèle animal cohérent de déficience en cellules souches limbiques, sans induire de lésions oculaires indésirables, ce qui est difficile à réaliser avec les modèles de lésions chimiques standard. Ce modèle est utile pour étudier le processus de la maladie à long terme au niveau cellulaire et moléculaire.
Et pour tester ou comparer l’efficacité de nouveaux traitements. Après avoir anesthésié la souris, pincez l’orteil pour assurer une profondeur d’anesthésie adéquate. Inspectez l’œil sous une lampe à fente pour vérifier l’absence de toute lésion cornéenne antérieure.
Instillez une goutte de chlorhydrate de tétracaïne à 1 % dans l’œil et attendez 60 secondes. Ensuite, appliquez doucement 5 % de povidone iodée sur l’œil et les cheveux qui l’entourent. Au bout d’une minute, essuyez la goutte ou étalez-la sur les poils autour de l’œil pour éviter que les cheveux n’interfèrent avec la pointe de l’outil.
Préparez une meule rotative stérile et une paire de pinces à épiler courbées stériles, et conservez-les sur une feuille stérile pendant la procédure. Maintenant, stabilisez l’œil en saisissant les paupières du côté nasal à l’aide de la pince à épiler pliée et en surveillant doucement l’œil. Attention à ne pas appliquer trop de pression.
Sous un microscope chirurgical, rasez deux fois la zone limbique à l’aide de la fraise rotative stérile. Retirez tout l’épithélium cornéen d’un membre à l’autre avec la fraise rotative de manière circulaire et travaillez avec le côté latéral de son extrémité. Pour éviter les lésions du stroma, ne brossez pas à nouveau les parties cornéennes dont l’épithélium a été retiré.
N’appliquez aucune pression sur l’œil. Nettoyez la pointe de la brosse si nécessaire. Appliquez une goutte de PBS stérile sur la cornée et essuyez les feuilles épithéliales détachées avec un chiffon de nettoyage doux.
Ensuite, rasez l’épithélium restant, le cas échéant. Faites attention à la queue de la souris pour assurer une profondeur d’anesthésie adéquate pendant la chirurgie. Appliquez une goutte de Flourescéine sodique sur la cornée.
Nettoyez la cornée après 30 secondes et examinez-la au microscope avec un filtre bleu cobalt pour vérifier l’élimination complète de l’épithélium. Après la procédure, placez l’animal dans sa cage sur une couverture chauffante et observez-le pendant 30 à 45 minutes jusqu’à ce qu’il se remette complètement de l’anesthésie. Pendant ce temps, appliquez la pommade ophtalmique à 1 % d’érythromycine sur l’œil et continuez l’application de l’antibiotique quotidiennement pendant une semaine.
De plus, injectez 0,1 mg/kg de buprénorphine par voie sous-cutanée immédiatement et 12 heures après l’intervention, et continuez l’injection deux fois par jour pendant deux jours. Il s’agit du phénotype de la cornée un mois après l’intervention. Vous pouvez voir une néovascularisation étendue qui est une caractéristique de la déficience en cellules souches limbiques.
Une cornée normale exprime la cytokératine 12 mais est dépourvue de cytokératine 8 ou de cellules caliciformes. En cas de carence en cellules souches limbiques, la cytokératine 8 et les cellules caliciformes apparaissent sur la cornée, tandis que la cytokératine 12 est perdue. Une fois maîtrisée, cette technique entraînera une néovascularisation cornéenne qui couvrira presque toute la surface cornéenne de la souris en un mois, et est stable jusqu’à trois mois.
Il est important d’éviter de rebrosser les parties cornéennes dont l’épithélium a déjà été enlevé. Cela peut provoquer une inflammation et une opacification indésirables du stroma. Suite au développement d’une déficience en cellules souches limbiques, des méthodes de traitement expérimentales peuvent être testées et comparées.
Alternativement, les traitements peuvent être commencés peu de temps après la blessure. Cette vidéo a montré comment enlever efficacement l’épithélium limbique et cornéen pour induire une déficience en cellules souches limbiques chez la souris. Avec quelques modifications, il peut également être effectué sur d’autres animaux.
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Aperçu
Cet article présente une technique reproductible permettant de créer un modèle murin durable de déficience des cellules souches limbiques (LSCD). Ce modèle est essentiel pour l'étude du processus pathologique et l'évaluation de traitements innovants.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Biologie cellulaire
- Ophtalmologie
Contexte
- La déficience des cellules souches limbiques affecte la santé cornéenne et la vision.
- Les modèles actuels provoquent souvent des lésions indésirables, compliquant ainsi la recherche.
- Un modèle durable est nécessaire pour les études à long terme.
- Cette technique vise à combler cette lacune.
Objectif de l'étude
- Développer un modèle murin reproductible de DCSL.
- Faciliter l'étude des processus cellulaires et moléculaires de la maladie.
- Évaluer l'efficacité de traitements potentiels.
Méthodes utilisées
- Une anesthésie est administrée à la souris.
- L’œil est examiné au biomicroscope à fente afin de détecter d’éventuelles lésions préexistantes.
- Une technique spécifique est utilisée pour induire une DCSL sans dommage supplémentaire.
- Un suivi à long terme du modèle est effectué.
Résultats principaux
- Le modèle imite avec succès la DCSL sans provoquer de lésion oculaire indésirable.
- Il permet des études cellulaires et moléculaires à long terme.
- Des traitements nouveaux peuvent être testés efficacement à l'aide de ce modèle.
- Les résultats indiquent une méthode fiable pour les recherches futures.
Conclusions
- Cette technique fournit un outil précieux pour la recherche sur la DCSL.
- Elle améliore la compréhension des maladies des cellules souches limbiques.
- De futures études pourront s'appuyer sur ce modèle afin d'améliorer les options thérapeutiques.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle dans l'industrie
La mise en place d'un modèle reproductible de carence en cellules souches limbiques (LSCD) chez la souris répond à un besoin crucial de systèmes pertinents pour la découverte de médicaments en ophtalmologie. Ce modèle permet une détection mécanistique des risques et offre une prédiction fiable pour l'évaluation préclinique de thérapies régénératives et anti-inflammatoires ciblant les affections cornéennes. Son phénotype durable et son alignement translationnel soutiennent une progression robuste du flux de développement thérapeutique ainsi que la comparabilité entre programmes.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Permet d'étudier la fonction des cellules souches limbiques et les voies de régénération cornéenne.
- Contribue à la réduction des risques biologiques en fournissant un modèle de maladie reproductible contrôlé par une lésion.
- Facilite la validation fonctionnelle des cibles thérapeutiques candidates dans le traitement de la DCSL.
- Améliore la fiabilité prédictive de la pertinence translationnelle dans la recherche sur les maladies de la surface oculaire.
Développement de tests et criblage
- Offre une plateforme in vivo validée pour l'évaluation quantitative de l'efficacité thérapeutique.
- Permet une évaluation standardisée d'extrémités cellulaires et moléculaires, telles que l'expression de la cytokeratine et la néovascularisation.
- Prend en charge un criblage reproductible et évolutif de nouveaux composés ou produits biologiques destinés à la réparation cornéenne.
- Facilite la comparaison fiable de modalités thérapeutiques dans un cadre contrôlé.
Recherche translationnelle et préclinique
- S'aligne sur la pathologie humaine de la DCSC, soutenant le développement translationnel de biomarqueurs.
- Permet une continuité allant de la découverte à la validation préclinique de stratégies régénératives.
- Appuie les décisions d'avancement ajustées au risque pour les thérapeutiques oculaires ciblant la déficience des cellules souches.
- Offre un éclairage mécanistique sur la progression de la maladie et la réponse thérapeutique.
Intégration du pipeline et du flux de travail
Ce modèle de DCLS s'intègre à la continuité découverte-préclinique, permettant la vérification d'hypothèses, l'identification de composés candidats et la validation translationnelle de thérapies pour la surface oculaire.
- Biologie de la découverte : Soutient l'investigation fondée sur des hypothèses concernant la perte des cellules souches limbiques et les mécanismes de réparation cornéenne.
- Essais de dépistage : Fournit des mesures reproductibles et quantitatives pour l'évaluation de l'efficacité et de la sécurité des interventions candidates.
- Analytique : Permet la mesure de marqueurs moléculaires (par exemple, les profils de cytokeratines) et de la néovascularisation pour des analyses comparatives.
- Recherche translationnelle : Établit un lien entre les résultats précliniques et leur pertinence clinique en modélisant des phénotypes persistants de DCSL.
- Réutilisation en entreprise : Offre une plateforme standardisée et adaptable pour l'évaluation transversale de thérapeutiques oculaires.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive et réduit l'ambiguïté mécanistique dans le développement de médicaments ophtalmiques.
- Valeur opérationnelle : Renforce la standardisation, la reproductibilité et la possibilité de passage à l'échelle des études précliniques sur les DCSL.
- Valeur stratégique : Améliore la prise de décision concernant le passage ou non à l'étape suivante et l'efficacité du capital alloué aux portefeuilles ophtalmiques.
- Impact sur le portefeuille : Permet une priorisation et une avancée ajustées au risque des candidats régénératifs et anti-inflammatoires.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en chirurgie ophtalmique sur petits animaux et en soins postopératoires.
- Requiert un accès à des microscopes chirurgicaux, à des fraises motorisées et à des outils d'analyse moléculaire.
- Exige une standardisation interéquipes des protocoles d'induction des lésions et d'évaluation phénotypique.
- Peut être adapté à d'autres modèles de petits animaux moyennant des modifications procédurales.
- Une technique minutieuse est essentielle pour éviter les lésions du stroma et assurer la reproductibilité du modèle.
