Name: Une procédure mécanique simple pour créer Limbal Carence de cellules souches dans la souris (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 55 s
Description: Découvrez une technique mécanique simple pour créer un modèle de carence des cellules souches limbiques chez la souris. Cette méthode reproduisible permet d'étudier les processus cellulaires et moléculaires sans lésion oculaire indésirable.

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Les auteurs remercient Ruth Zelkha, MS, pour sa généreuse assistance en imagerie. Cette recherche a été soutenue par le Programme de développement scientifique clinique K12EY021475 Award ME, accorder R01 EY024349-01A1 à ARD, noyau subvention EY01792 du National Eye Institute, NIH, et une subvention sans restriction de recherche visant à prévenir la cécité. ARD est le récipiendaire d&#39;une bourse de développement de carrière de la recherche pour prévenir la cécité.

Toutes les procédures effectuées sur les animaux sont conformes à l&#39;Association pour la recherche en vision et ophtalmologie déclarations pour l&#39;utilisation des animaux dans la recherche de vision. Quatorze de quatre à / / 6J mâles de six mois vieilles femelles C57BL sauvages de type ont été utilisés: dix souris pour le modèle de lésion et quatre comme animaux témoins (cornées non blessés). 1. Préparation d&#39;un animal <ol><li> Anesthésier une souris avec une injection intrapéritonéale de 100 mg / kg de kétamine et / kg de xylazine mélange de 5 mg. Après l&#39;anesthésie a pris effet, pincer la pointe pour confirmer la profondeur de l&#39;anesthésie; l&#39;animal ne doit pas réagir. </li><li> Inspecter l&#39;œil sous une lampe à fente avant d&#39;effectuer les expériences afin de vérifier l&#39;absence de toute lésion de la cornée précédente. </li><li> Instiller une goutte de 1% de chlorhydrate de tétracaïne sur l&#39;oeil. Après 60-90 secondes, tester le réflexe cornéen pour confirmer l&#39;absence de sensation. Proparacaine chlorhydrate de 0,5% peut être utilisé à la place. </li><li> Lorsque la perte de sensibilité cornéenne estcertains, placez doucement une goutte de 5% de povidone-iode sur l&#39;oeil et sur les cheveux autour de l&#39;oeil. Essuyer la goutte après 1 min ou l&#39;étaler sur les cheveux autour de l&#39;œil pour empêcher les cheveux d&#39;interférer avec la pointe de l&#39;outil. </li></ol> 2. abraser l&#39;épithélium cornéen <ol><li> Porter des gants chirurgicaux et une robe. Préparer les outils nécessaires: une fraise rotative stérile et une paire de pinces stériles. Pour un meilleur contrôle, utiliser des pinces courbées. Placez les outils sur une feuille stérile pendant la procédure. </li><li> À l&#39;aide des pinces courbées, stabiliser l&#39;œil en saisissant les couvercles du côté nasal et proptosing doucement l&#39;œil. Évitez d&#39;utiliser trop de pression. </li><li> Sous un microscope chirurgical, raser 360 ° autour de la zone limbique deux fois en utilisant la fraise rotative stérile. Faites le tour du limbe avec une vitesse de 5-6 secondes par tour. NOTE: Le trépan a une vitesse fixe. Cependant, pour le faire tourner à la vitesse établie, le &quot;écrou de fin&quot; doit être complètement serré. </li><li> Enlever l&#39;ensemble de l&#39;épithélium cornéen limbique à limbe avec la meule en rotation. Pour de meilleurs résultats, déplacer l&#39;outil de façon circulaire et maintenez-le peu parallèle à la surface de la cornée à travailler avec le côté latéral de la pointe. Prenez soin de ne pas blesser le stroma en ne re-brossant les zones où l&#39;épithélium a déjà été supprimé. Ne pas appliquer de pression sur l&#39;œil. Nettoyez la pointe du pinceau, au besoin. </li><li> Instiller une goutte de solution saline tamponnée au phosphate stérile sur la cornée et essuyer les feuilles épithéliales détachées avec un tissu de nettoyage doux. </li><li> Raser l&#39;épithélium restant, le cas échéant. </li><li> Faites attention à la queue de la souris pendant la chirurgie. NOTE: Si un mouvement se produit, la profondeur de l&#39;anesthésie a disparu et injection supplémentaire est nécessaire. Un tiers à deux tiers du volume injecté primaire devrait être suffisante. Ne pas surdoser l&#39;animal avec le médicament anesthésique. </li><li> Stériliser tous les outils avant de les utiliser sur un autre œil. </li></ol> 3. Confirmer complète Retrait épithéliale <ol><li> Appliquer une goutte de 1 mg / ml de fluorescéine sodique sur la cornée. Nettoyer la cornée après 30 secondes et l&#39;examiner sous un microscope avec un filtre bleu de cobalt pour vérifier le retrait complet de l&#39;épithélium. REMARQUE: Les zones cornéennes avec des défauts épithéliales sont visualisés en vert. </li></ol> 4. Post-opération de soins <ol><li> Mettez l&#39;animal sur une couverture chauffante et le garder dans un endroit sûr (par exemple, dans sa cage) , tandis que dans la récupération. Ne pas garder un animal inconscient en compagnie de ceux conscients. </li><li> Appliquer 1% érythromycine pommade ophtalmique. Cela permettra également de prévenir la sécheresse oculaire. Poursuivre l&#39;application du quotidien antibiotique pendant une semaine. </li><li> Injecter 0,1 mg / kg par voie sous-cutanée buprénorphine après la procédure et à nouveau après 12 heures. Continuer l&#39;injection deux fois par jour pendant deux jours. </li><li> Observez l&#39;animal pour 30 - 45 min, jusqu&#39;à la récupération complète de l&#39;anesthésie. REMARQUE: Mouvement doux des muscles respiratoires sur la surface ventrale indique le bien-être des animaux tandis que sous la récupération. </li></ol>

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<li>Lin, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mouse+model+of+limbal+stem+cell+deficiency+induced+by+topical+medication+with+the+preservative+benzalkonium+chloride%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">A mouse model of limbal stem cell deficiency induced by topical medication with the preservative benzalkonium chloride.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 54 (9), 6314-6325 (2013).</li>
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<li>Liu, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cornea-specific+expression+of+K12+keratin+during+mouse+development%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Cornea-specific expression of K12 keratin during mouse development.</a> Curr. Eye Res. 12 (11), 963-974 (1993).</li>
<li>Nakatsu, M. N., González, S., Mei, H., Deng, S. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+limbal+mesenchymal+cells+support+the+growth+of+human+corneal+epithelial+stem%2Fprogenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Human limbal mesenchymal cells support the growth of human corneal epithelial stem/progenitor cells.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 55 (10), 6953-6959 (2014).</li>
<li>Pajoohesh-Ganji, A., Pal-Ghosh, S., Tadvalkar, G., Stepp, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corneal+goblet+cells+and+their+niche%3A+implications+for+corneal+stem+cell+deficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Corneal goblet cells and their niche: implications for corneal stem cell deficiency.</a> Stem Cells. 30 (9), 2032-2043 (2012).</li>
<li>McCloy, R. A., Rogers, S., Caldon, C. E., Lorca, T., Castro, A., Burgess, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Partial+inhibition+of+Cdk1+in+G+2+phase+overrides+the+SAC+and+decouples+mitotic+events%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Partial inhibition of Cdk1 in G 2 phase overrides the SAC and decouples mitotic events.</a> Cell Cycle. 13, 1400-1412 (2014).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont rien à divulguer.

Cet article décrit une technique reproductible et relativement simple pour créer un modèle de souris de LSCD. Il y a plusieurs aspects importants de ce modèle qui méritent d&#39;être soulignées. Premièrement, les modèles à la différence qui utilisent des produits chimiques 11, 12, la blessure implique principalement l&#39;épithélium de surface (et membrane basale), avec un minimum de dommages à l&#39;stroma cornéen sous - jacente ou à d&#39; autres structures intraoculaires. Ainsi, il n&#39;y a que l&#39;infl...

L&#39;épithélium cornéen est nécessaire pour maintenir la clarté et l&#39;intégrité de la cornée. Il est sans cesse renouvelée tout au long de la vie par les cellules souches épithéliales résidant dans la-un limbe zone étroite à la jonction de la cornée et la conjonctive. Ces cellules souches limbiques auto-renouvellement jouent un rôle crucial dans la régénération de l&#39;épithélium cornéen, à la fois normalement et après une blessure. déplétion partielle ou complète de ces cellules souches se traduira par des érosions cornéennes récurrentes, la douleur, la cicatrisation de la cornée et de la néovascularisation, l&#39;apparition de cellules caliciformes, et l&#39;absence de traitement, la cécité cornéenne. Cette condition est connue comme la déficience limbique de cellules souches (LSCD) et peut être idiopathique; héréditaire; ou acquis en raison de blessures chimiques ou thermiques, des lentilles de contact à long terme portent, et l&#39; inflammation chronique 1-6. La recherche sur LSCD nécessite un modèle animal approprié qui, non seulement imite la maladie chez les humains, mais est reproductible et durable, avec le moinsmontage de blessures à d&#39;autres structures cornéennes et oculaires. Ce modèle est nécessaire pour évaluer les traitements et de clarifier les mécanismes de la maladie au niveau moléculaire et cellulaire. 1 comme décrit précédemment, avec l&#39;utilisation d&#39;une fraise rotative, on peut aisément développer un modèle murin de LSCD qui présente les avantages précités et persiste pendant au moins trois mois. Le but de cette étude est de présenter un modèle simple, reproductible et durable souris LSCD. La fraise rotative est un outil pratique qui élimine uniformément l&#39;épithélium sans blesser le stroma sous - jacent 1. Il a été utilisé pour induire une érosion de la cornée centrale 7, 8 dans les études de cicatrisation des plaies. La technique de la présente-présenté pour créer LSCD dans une souris n&#39;a pas été signalée auparavant. Auparavant introduit des méthodes de grattage de l&#39;épithélium avec un résultat de spatule contondant dans un moins uniforme blessure particulièrement au niveau du limbe et un phénotype plus variable 1, 9, avec plus de restauration of épithélium de la cornée normale 1. A la différence du racleur émoussé, la fraise rotative retire la membrane basale epitheliale et 7, 8, 10. D&#39;autres méthodes rapportées pour sectionner les cellules souches comprennent l&#39;utilisation de produits chimiques tels que l&#39;hydroxyde de sodium, le n-heptanol et le chlorure de benzalkonium, qui non seulement peut induire des lésions indésirables aux structures de l&#39;œil sous-jacentes, mais peut aussi conduire à une inflammation significative et opacification de la cornée postérieure ou épithéliale métaplasie squameuse 11-15. La fraise rotative est pas associée à ces complications graves. Enlever chirurgicalement l&#39;épithélium limbique, seul ou avec l&#39;utilisation de produits chimiques 10, 11, 16, est plus difficile à réaliser et est pas la meilleure option chez les animaux avec de petits yeux et un épithéliums limbique mince (comme des souris). En outre, de manière surprenante, limbectomy peut encore laisser une partie de l&#39;épithélium limbique derrière 10. La technique décrite ci-dessous se traduira par LSCD avec néovascularisation uned conjunctivalization qui imite la présentation LSCD complète chez les patients et dure pendant au moins trois mois 1. Il est adapté pour ceux qui visent à étudier LSCD ou physiopathologie de la cicatrisation des plaies, l&#39;immunologie et les traitements potentiels chez la souris. Éventuellement, avec quelques modifications, cette procédure peut être effectuée chez des rats ou des lapins 10. Comme fraise rotative élimine efficacement l&#39;épithélium, il peut être utilisé dans toute recherche se rapportant à l&#39;épithélium de la cornée à l&#39;abrasion / blessures et dans tous les traitements liés ou des études de biologie moléculaire.

<table><tbody><tr><td>Meule rotative : dissolvant d’anneaux antirouille AlgerBrush II&nbsp ;</td><td>Rumex International Co, Clearwater, FL</td><td>16-141</td><td>Bavure de 0,5 mm. Également disponible auprès d’autres sociétés.</td></tr><tr><td>Microscope chirurgical</td><td>Wild Heerbrugg, Suisse</td><td>Wild M691</td><td></td></tr><tr><td>Appareil photo numérique</td><td>Nikon, Thaïlande Nikon, Thaïlande</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nikon</td><td>, Japon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anticorps polyclonal anti-CK12</td><td>Santa Cruz Blotechnology, CA,SC-17101</td><td></td> <td>Concentration 1:100</td></tr><tr><td>Anticorps monoclonal anti-CK8</td><td>TROMA-I-s, Iowa City, IA</td><td>AB_531826</td><td>Concentration de 1:50</td></tr></tbody></table>

une procédure mécanique simple pour créer limbal carence de cellules souches dans la souris

A Simple Mechanical Procedure to Create Limbal Stem Cell Deficiency in Mouse

carence en cellules souches limbiques (LSCD) est un état de dysfonctionnement ou de perte de cellules souches épithéliales limbiques, après quoi l&#39;épithélium cornéen est remplacé par conjonctive. Les patients souffrent de défauts récurrents de la cornée, la douleur, l&#39;inflammation et la perte de vision. Auparavant, un modèle murin de LSCD a été décrite et comparée aux deux autres modèles. L&#39;objectif était de produire un modèle de souris cohérente de LSCD que les deux imite le phénotype chez l&#39;homme et dure assez longtemps pour permettre d&#39;étudier la physiopathologie de la maladie et d&#39;évaluer de nouveaux traitements. Ici, la technique est décrite plus en détail. Un outil motorisé avec une fraise rotative a été conçu pour enlever les anneaux de rouille de la surface de la cornée ou de lisser le lit de ptérygion chez les patients. Il est un dispositif approprié pour créer le modèle de LSCD souhaité. Il est un outil facile à utiliser facilement disponibles avec une pointe fine qui le rend approprié pour travailler sur de petits yeux, commechez la souris. Son application empêche les traumatismes inutiles à l&#39;œil et il ne donne pas lieu à des blessures non désirées, comme cela est souvent le cas avec les modèles de lésion chimique. Par opposition à un grattoir émoussé, il élimine l&#39;épithélium de la membrane basale. Dans ce protocole, la zone limbique a été abrasée deux fois, puis l&#39;ensemble de l&#39;épithélium cornéen a été rasée de limbe à limbe. Pour éviter les blessures de stroma, on a pris soin de ne pas brosser la surface de la cornée, une fois l&#39;épithélium a déjà été supprimé.

Moins d&#39; un mois après avoir effectué cette technique, 100% des cornées a développé une néovascularisation superficielle (figure 1A. Les photos ont été prises avec un appareil connecté à une lampe à fente sous un champ lumineux et filtre bleu de cobalt). Dans 18/20 (90%) des yeux, la néovascularisation impliquait la totalité de la surface de la cornée (figure 1A). Dans 2/20 (10%), la néovascularisation a été observée dans trois des quatre quarts de c...

L&#39;article suivant fournit, une technique reproductible facile de créer efficacement un modèle de souris durable de la carence en cellules souches limbiques (LSCD). Ce modèle animal est utile pour tester et comparer l&#39;efficacité des traitements pour les maladies de cellules souches limbiques.

Une procédure mécanique simple pour créer Limbal Carence de cellules souches dans la souris

Limbal stem cell deficiency (LSCD) is a state of malfunction or loss of limbal epithelial stem cells, after which the corneal epithelium is replaced with ...

L'objectif général de cette procédure est de créer un modèle murin reproductible, durable et persistant de déficience des cellules souches limbales. Cette technique simple fournit un modèle animal reproductible de déficience des cellules souches limbales, sans provoquer de lésions indésirables de l'œil, ce qui est difficile à obtenir avec les modèles classiques de lésions chimiques. Ce modèle est utile pour l'étude du processus pathologique à long terme aux niveaux cellulaire et moléculaire.Et pour tester ou comparer l'efficacité de nouveaux traitements. Après avoir anesthésié la souris, pincer l'orteil pour s'assurer d'une profondeur adéquate de l'anesthésie. Examiner l'œil au biomicroscope à fente afin de vérifier l'absence de lésion cornéenne préexistante.Instillez une goutte de chlorure de tétracaïne à 1 % sur l’œil et attendez 60 secondes. Ensuite, appliquez doucement de la povidone iodée à 5 % sur l’œil et les poils environnants. Après une minute, essuyez la goutte ou étalez-la sur les poils entourant l’œil afin d’empêcher que ceux-ci n’entravent la pointe de l’instrument.Préparez un foret rotatif stérile et une paire de pinces courbées stériles, et conservez-les sur une feui

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Modélisation de la chirurgie de la cataracte chez la souris

Nous avons développé un modèle chez le rat d’inflammation cornéenne sévère par curetage de l’épithélium cornéen combiné à des sutures cornéennes. L’étude a évalué les modèles d’inflammation cornéenne, la prolifération épithéliale et les changements dans les cellules souches limbiques dans des conditions inflammatoires.

Etablissement d’un modèle d’inflammation cornéenne sévère chez le rat basé sur le curetage de l’épithélium cornéen combiné à des sutures cornéennes

Ici, nous présentons un protocole pour obtenir des suspensions unicellulaires de haute qualité à partir de cornées entières de souris par digestion séquentielle avec collagénase A et trypsine. Cette méthode permet de produire des cellules uniques viables avec une grande intégrité ARN, les rendant compatibles avec des applications en aval telles que le séquençage à ARN monocellulaire et le cytomètrey en flux.

Un protocole pour la récolte de la suspension unicellulaire sur les cornées de souris

Découvrez une technique mécanique simple pour créer un modèle de carence des cellules souches limbiques chez la souris. Cette méthode reproduisible permet d'étudier les processus cellulaires et moléculaires sans lésion oculaire indésirable.

Une procédure mécanique simple pour créer Limbal Carence de cellules souches dans la souris

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