Méthodes d'étude Les modifications lipidiques de neutrophiles et de la formation subséquente des neutrophiles pièges extracellulaires

L’objectif global de cette méthode est d’étudier les changements dans la composition lipidique des neutrophiles lors de la libération de pièges extracellulaires de neutrophiles en utilisant la chromatographie sur couche mince et la HPLC. Cette méthode peut être utilisée pour obtenir des informations plus détaillées sur les mécanismes impliqués dans la formation des pièges extracellulaires des neutrophiles, ou brièvement nommés, la formation de NET. Le principal avantage de cette procédure est qu’elle fournit des informations sur le rôle des lipides dans la fonction générale des neutrophiles en utilisant un protocole facile à suivre.

L’isolement de cellules dérivées du sang humain sera démontré par une ancienne doctorante de notre laboratoire, Ariane Neumann. Et elle sera assistée par Friederike Reuner. La préparation des cellules pour l’analyse des lipides sera démontrée par Graham Brogden, post-doctorant dans mon laboratoire, et Diab Husein, étudiant à la maîtrise dans le programme de biochimie.

Pour isoler les neutrophiles dérivés du sang humain, superposer environ 20 mL de sang sur 20 mL de solution de diatrizoate de sodium/dextran près d’une flamme, sans mélanger. Centrifuger pendant 30 minutes à 470 fois g sans freiner. Il est essentiel de ne pas mélanger la phase sanguine avec le degré de densité en solution.

Après l’étape de centrifugation, les cellules mononucléées doivent être soigneusement retirées pour éviter la contamination ou l’activation non spécifique des cellules. Retirez les cellules mononucléées et la couche de plasma jaunâtre. Transférez la cellule polymorphonucléaire, ou phase PMN, dans un nouveau tube de 50 mL et remplissez-la jusqu’à 50 mL avec une solution saline tamponnée au phosphate 1X.

Centrifuger l’échantillon pendant 10 minutes à 470 fois g avec freinage. Ensuite, retirez le surnageant et remettez la pastille en suspension dans 5 mL d’eau stérile pendant cinq secondes pour lyser les érythrocytes. Remplissez immédiatement le tube à 50 ml avec 1X PBS et centrifugez l’échantillon.

Lors de l’élimination du surnageant, la pastille doit être blanche. S’il est toujours rouge, répétez ces étapes. Ensuite, remettez le granulé en suspension dans 1000 microlitres de Roswell Park Memorial Institute, ou milieu RPMI.

Comptez le numéro de cellule à l’aide d’une coloration au bleu trypan et d’un hémocytomètre au microscope optique. Préparer une suspension cellulaire dans du RPMI à une concentration de deux millions de cellules par ml. Environ 25 millions de neutrophiles peuvent être prélevés à partir de 20 ml de sang.

Pour traiter pharmacologiquement les neutrophiles pour l’analyse des lipides, utilisez 15 millions de cellules préparées. Incuber les échantillons dans les tubes de réaction pendant deux heures à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone. Après la centrifugation des échantillons, retirez le surnageant et remettez en suspension la pastille cellulaire dans 300 microlitres de HBSS.

Après avoir centrifugé à nouveau l’échantillon en utilisant les mêmes paramètres, remettre la pastille cellulaire en suspension dans 1 mL d’une solution chloroforme :méthanol 1:1. Ensuite, homogénéisez la pastille remise en suspension à l’aide d’une canule de calibre 26 en poussant l’échantillon dans et hors d’une seringue de 1 mL 10 fois. Pour isoler les lipides des neutrophiles dérivés du sang périphérique humain, prenez les neutrophiles préparés et placez-les sur de la glace.

Pipeter les neutrophiles dans un tube en verre à bouchon à vis de 15 mL avec un joint en PTFE, et les homogénéiser en les agitant pendant une minute. Ajoutez ensuite 2 ml de méthanol suivi une minute plus tard de 1 ml de chloroforme. Après avoir secoué pendant encore une minute, faites pivoter les tubes de verre à température ambiante et à 50 tr/min pendant 30 minutes.

Ensuite, granulez la fraction protéique en centrifugeant la solution à 7 degrés Celsius et 1 952 fois g pendant 10 minutes. Décanter soigneusement le surnageant dans un nouveau tube en verre de 15 mL à bouchon à vis, en laissant la pastille contenant des protéines. Conservez la pastille à 20 degrés Celsius pour une quantification future.

Ajouter 1 mL de chloroforme et attendre une minute. Ensuite, ajoutez 1 ml d’eau distillée deux fois et retournez le tube à bouchon à vis en verre avec l’échantillon pendant 30 secondes. Après avoir centrifugé l’échantillon comme précédemment, retirez et jetez la phase supérieure jusqu’à la couche trouble, mais sans l’inclure.

Séchez les échantillons dans un concentrateur sous vide à 60 degrés Celsius et stockez-les à 20 degrés Celsius jusqu’à ce que vous en ayez besoin. Pour commencer, remplissez jusqu’à 5 ml de chaque solution dans la chambre en verre correspondante. Ajoutez n’importe quel type de papier filtre pour augmenter la vitesse de fonctionnement dans chaque chambre.

Pré-incubez une plaque de verre de 20x10cm HPTLC silica gel 60 dans la première solution de course. Une fois que la solution courante atteint le haut de l’assiette, séchez-la pendant 10 minutes à 110 degrés Celsius. Dissoudre la pastille lipidique, préalablement obtenue après séchage avec un concentrateur sous vide, dans le volume souhaité de solution chloroforme :méthanol 1:1, et incuber pendant 15 minutes à 37 degrés Celsius pour dissoudre.

Ensuite, à l’aide d’une règle et d’un crayon doux, marquez les points de chargement pour le nombre souhaité d’échantillons plus au moins un étalon. Marquez la distance de course à environ 4 cm pour la première solution de course et à environ 6 cm pour la deuxième solution de course. Pour charger les échantillons, lavez la seringue de 10 microlitres trois fois dans du chloroforme :méthanol 1:1 avant de charger chaque nouvel échantillon.

Chargez 10 microlitres de chaque échantillon goutte à goutte en essayant de concentrer l’échantillon sur une zone aussi petite que possible. Placez la plaque verticalement dans la première chambre avec la première solution en cours d’exécution. Assurez-vous que la plaque est parallèle à la paroi de la chambre en verre pour obtenir une vitesse de migration uniforme.

Veillez à ce que les plaques soient placées parallèlement à la paroi arrière des chambres en verre et à ce que les fronts de solvant ne s’étendent pas trop loin pour garantir une séparation efficace des lipides. Une fois que la ligne de solvant a atteint le premier repère, retirez la plaque, séchez-la et placez-la dans la deuxième solution. Répétez les étapes similaires pour la deuxième et pour la troisième solution de course.

Laissez la plaque dans la solution jusqu’à ce que la face du solvant atteigne le haut de la plaque. Ensuite, retirez la plaque et séchez-la à température ambiante pendant une minute. Placez la plaque dans la solution de sulfate de cuivre pendant sept secondes.

Après avoir soigneusement séché la plaque, faites-la cuire au four pendant sept minutes à 170 degrés Celsius. Sortez la plaque du four et laissez-la refroidir. Pour effectuer une HPLC, fixez la colonne à une cartouche de protection sur l’instrument et chauffez-la à 32 degrés Celsius.

Utilisez le méthanol comme phase mobile à un débit de 1 mL par minute et 65 bars. Réglez le détecteur UV pour qu’il mesure à 202 nanomètres afin de quantifier la quantité de cholestérol dans chaque échantillon. Lavez soigneusement l’appareil HPLC avant d’analyser les échantillons et établissez une courbe standard de cholestérol comme décrit dans le protocole textuel.

Enfin, remettez les échantillons en suspension dans 500 microlitres de chloroforme :méthanol 1:1 dans des bouteilles en verre de 1,5 ml de couleur ambrée avec des couvercles en PTFE rouge / silicone blanc à vis avant de les charger sur l’instrument HPLC. Le profil lipidique des neutrophiles sur une plaque HPTLC est illustré ici. Les lipides peuvent être identifiés en comparant les distances de migration à la norme.

Un chromatogramme HPLC montrant deux grands pics est également illustré. Le premier pic juste avant deux minutes est le chloroforme. Le deuxième grand pic à cinq minutes est le cholestérol.

Voici les courbes standard de cholestérol déterminées par HPLC et par HPTLC. La courbe standard obtenue par HPLC est linéaire sur une plage de concentration plus large par rapport à la courbe standard HPTLC. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’isoler les neutrophiles dérivés du sang humain et d’analyser ensuite leur composition lipidique.

Lors de cette procédure, il est important de ne pas oublier de porter des gants en nitrile pour protéger vos mains contre l’exposition dangereuse au chloroforme :méthanol et également pour travailler sous une hotte. Les expériences futures fourniront des informations supplémentaires sur les mécanismes impliqués dans la formation des TNE et les fonctions générales des neutrophiles, qui ne sont pas encore entièrement comprises. N’oubliez pas que travailler avec des cellules primaires dérivées du sang humain nécessite une autorisation éthique ainsi que des précautions de sécurité appropriées, telles que le travail dans un laboratoire de biosécurité respectif pour éviter le risque d’exposition à des agents pathogènes humains.

Enfin, le but de notre étude est de trouver de nouvelles cibles thérapeutiques contre une infection basées sur le système immunitaire inné, et surtout la composition lipidique est très intéressante pour nous puisqu’elle nous aidera à comprendre pourquoi le neutrophile agit de manière antimicrobienne contre une infection.