Des outils pour étudier le rôle de l'architecture Protein HMGB1 dans le traitement des Helix effets de distorsion, l'ADN spécifique du site InterStrand Crosslinks

L’objectif global des expériences d’immunoprécipitation de la chromatine modifiée et de superenroulement de l’ADN est d’étudier l’association et les modifications topologiques ultérieures induites par les protéines architecturales sur les dommages à l’ADN spécifiques au site induits par des agents chimiothérapeutiques ou cancérigènes dans les cellules humaines. Cette méthodologie nous permettra de répondre à des questions clés sur les dommages et la réparation de l’ADN, ce qui devrait faciliter la découverte de nouvelles cibles pharmacologiques pour le traitement du cancer. Notre technologie nous permet de diriger les dommages à l’ADN spécifiques à un site et facilite l’évaluation des processus critiques de réparation de l’ADN pertinents pour le cancer humain.

Pour commencer, 24 heures avant la transfection, mettez en boîte 400 000 cellules de mammifères par boîte de 60 millimètres dans du DMEM complété par 10 % de FBS sans antibiotiques. Incuber les cellules à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant la nuit. Dans un tube à fond rond de 14 millilitres, combinez 30 microlitres d’agent transfectionnaire à température ambiante avec 500 microlitres de milieu de croissance 1X qui a été chauffé à 37 degrés Celsius.

Dans un deuxième tube, combinez deux microgrammes de plasmides contenant des ICL dirigés TFO dans 500 microlitres de milieu de croissance 1X. Incuber les tubes à température ambiante pendant 10 minutes. Mélangez le premier mélange avec le deuxième mélange, et pipetez de haut en bas pour bien mélanger.

Ensuite, incubez la solution à température ambiante pendant 25 à 30 minutes. Ensuite, utilisez du PBS chaud pour laver les cellules deux fois. Ensuite, ajoutez le mélange de transfection par gouttes, en répartissant la solution uniformément dans toute la plaque de cellules.

Ajoutez un millilitre de milieu de croissance dans l’assiette et portez le volume final à deux millilitres. Mélangez bien et placez les plaques de culture à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone. Quatre heures plus tard, remplacez le milieu par trois millilitres de milieu de culture avec 10 % de FBS et incubez 16 heures supplémentaires.

Après l’incubation, ajoutez 80 microlitres de formaldéhyde frais à 37 % par plaque dans les cellules et incubez à température ambiante dans l’obscurité pendant 10 minutes. Trempez la réticulation au formaldéhyde en ajoutant 300 microlitres de glycine réfrigérée par assiette et incubez pendant cinq minutes. Retirez ensuite le milieu et utilisez du PBS réfrigéré pour laver les plaques deux fois.

Ensuite, après avoir ajouté un millimètre de PBS réfrigéré, collectez les cellules en les grattant dans un tube de microcentrifugation sur de la glace, en gardant les échantillons sur la glace à tout moment. Préparez les pastilles cellulaires en les centrifugeant à 13, 400 fois G et quatre degrés Celsius pendant cinq minutes. Ensuite, retirez le surnageant et placez les granulés sur de la glace.

Utilisez un millilitre de tampon A réfrigéré pour remettre les granulés en suspension de manière homogène et incubez sur de la glace pendant 10 minutes. Ensuite, granulez les cellules comme précédemment. Maintenant, avec un millilitre de tampon B réfrigéré, remettez les granulés en suspension de manière homogène et incubez sur de la glace pendant 10 minutes en les mélangeant occasionnellement en les inversant.

Ensuite, granulez les cellules comme précédemment. Après avoir remis les cellules en suspension, dans 200 microlitres de tampon B réfrigéré, ajoutez deux microlitres de nucléase micrococcique, ou MNase, et incubez la réaction à température ambiante pendant 10 minutes. Ensuite, arrêtez la réaction MNase en plaçant les tubes sur de la glace et en ajoutant 40 millimolaires d’EDTA.

Le niveau de digestion par la nucléase micrococcique est très critique, car la surdigestion peut entraîner une perte de signal, tandis que la sous-digestion peut causer beaucoup de bruit de fond non spécifique. Après avoir granulé les cellules, remettez les granulés en suspension dans 100 microlitres d’immunoprécipitation de la chromatine, ou tampon ChIP, complété par un cocktail d’inhibiteurs de protéase. Ensuite, transférez la suspension cellulaire dans un tube de microcentrifugation à paroi mince.

Soniquez les échantillons en les faisant flotter sur un sonicateur à bain d’eau pendant 20 secondes, puis 20 secondes sur de la glace. Répétez les étapes de sonication neuf fois pour générer environ 800 à 1 200 fragments de paires de bases. À 20 microlitres d’échantillons soniqués, ajoutez trois microlitres de chlorure de sodium à cinq molaires et un microlitre de RNase A.Vortex dans les tubes, et incubez-les à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes.

Ensuite, ajoutez deux microlitres de protéinase K et incubez à 65 degrés Celsius pendant deux heures. Après avoir purifié les échantillons, selon le protocole de texte, analysez-les sur du gel d’agarose à 1 % et visualisez-les avec du bromure d’éthidium. Dans trois tubes siliconés séparés et pré-refroidis, ajoutez 30 microlitres de lysat et 70 microlitres de tampon ChIP 1X réfrigéré avec des inhibiteurs de protéase ajoutés.

Ajoutez un microgramme d’anticorps anti-IgG, anti-histone H3 ou anti-HMGB1 dans les tubes respectifs. Incuber une nuit dans une chambre froide à rotation continue. Dans la chambre froide, après avoir remis en suspension les billes de protéine G, ajoutez quatre microlitres de billes dans chaque tube de réaction et incubez dans une chambre froide avec rotation pendant deux à quatre heures supplémentaires.

Placez les tubes sur une grille magnétique pour granuler les billes et retirez le surnageant. Ajoutez 200 microlitres de tampon 1X ChIP avec cocktail inhibiteur de protéase aux granulés et lavez-les à froid en rotation pendant cinq minutes. Ensuite, avec un tampon ChIP 1X à haute teneur en sel, effectuez un lavage supplémentaire.

Ensuite, utilisez 160 microlitres de tampon d’élution pour remettre les granulés en suspension et incubez à 37 degrés Celsius avec rotation pendant 30 minutes. Granulez les billes et recueillez le surnageant dans un tube frais. Ajoutez six microlitres de chlorure de sodium à cinq molaires et deux microlitres de protéinase K, et incubez toute la nuit à 65 degrés Celsius.

Après avoir purifié l’ADN, selon le protocole textuel, effectuez des réactions PCR à l’aide d’ensembles d’amorces sur la ou les régions d’intérêt, et résolvez les produits sur un gel d’agarose à 1 %, coloré au bromure d’éthidium. Avant l’utilisation, décongelez le tampon de synthèse de réparation de l’ADN préalablement préparé sur de la glace et ajoutez 40 millimolaires de phosphocréatine et 2,5 microgrammes de créatine phosphokinase. Après avoir préparé un tampon de super-enroulement 10X, selon le protocole de texte, utilisez un microlitre de vaccine topoisomérase 1 avec un tampon de super-enroulement 1X dans une réaction de 10 microlitres pour linéariser 300 nanogrammes de plasmide superenroulé, PCA FG1.

Aux plasmides détendus, ajoutez 25 microlitres d’extrait de cellule HeLa fraîchement décongelé et un tampon de synthèse d’ADN. Mélangez bien, puis ajoutez un microlitre de vaccine topoisomerase 1 à la réaction et incubez à 37 degrés Celsius pendant une heure. Terminez les réactions en ajoutant 1 % de SDS et 0,25 milligramme par millilitre de protéinase K, et incubez à 65 degrés Celsius pendant deux heures.

Après avoir coulé un gel d’agarose à 1 % avec un tampon TPE 1X, ajoutez un colorant chargé d’ADN aux réactions et chargez les échantillons directement sur le gel à au moins quatre voies de distance. Faites fonctionner le gel pendant huit à 10 heures à deux volts par centimètre en TBE 1X pour la première dimension à température ambiante afin de résoudre les topoisomères. Préparez deux litres de 1X TBE avec trois microgrammes par millilitre de phosphate de chloroquine.

Faites tremper le gel dans 200 millilitres de solution, recouvert de papier d’aluminium pendant 20 minutes. Pour électrophoriser le gel dans la deuxième dimension, tournez le gel de 90 degrés dans le sens des aiguilles d’une montre et faites-le fonctionner pendant quatre à six heures à deux volts par centimètre dans de la chloroquine contenant 1X TBE pour résoudre les superbobines positives et négatives. La quantité de chloroquine dans le tampon d’électrophorèse et dans le gel est très critique, ainsi que le fonctionnement du gel à une tension très basse pour la deuxième dimension est très critique pour séparer les superbobines positives et négatives.

Après la coloration et la décoloration du gel, conformément au protocole textuel, utilisez un imageur pour visualiser la thermodistribution des topoisomères. Comme on le voit dans ce gel, environ 79 % des plasmides hébergeant des ICL dirigées par TFO migrent avec une mobilité plus lente à travers la matrice de gel d’agarose par rapport aux plasmides témoins non réticulés. Les dosages ChIP réalisés sur des lysats de cellules U2OS humaines transfectées avec un plasmide témoin ou des plasmides contenant des ICL dirigées TFO montrent un enrichissement en HMGB1 dans la région P-ICL par rapport à la région témoin lorsqu’il est immunoprécipité avec un anticorps anti-HMGB1.

Lorsque HMGB1 a été épuisé des cellules par le traitement par siRNA, l’enrichissement spécifique de P-ICL a été diminué. Lorsque les mêmes échantillons ont été immunoprécipités à l’aide d’un anticorps anti-IgG, une amplification PCR minimale a été détectée. Enfin, dans cette figure, l’électrophorèse bidimensionnelle sur gel d’agarose démontre une modification architecturale des plasmides contenant des ICL dirigés par TFO sous forme de surenroulement négatif par HMGB1 dans les extraits de cellules HeLa.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en environ cinq jours, si elle est exécutée correctement. Lors de cette procédure, il est très important de se rappeler que tous les lavages doivent être effectués dans la chambre froide, car les lavages à température ambiante peuvent augmenter le signal de fond. À la suite de cette procédure, d’autres méthodes, telles que la déplétion protéique médiée par siRNA, suivie de tests de criblage de mutations, peuvent être effectuées afin de répondre à des questions telles que : la protéine d’intérêt est-elle impliquée dans la réparation de l’ADN ?

Ou est-ce que cela modifie de manière significative les spectres de mutation au cours du processus ? Cette technique a ouvert la voie à l’étude de l’association entre les protéines et les dommages à l’ADN spécifiques au site. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne idée de la façon d’étudier l’association de protéines architecturales pour cibler une liaison croisée de l’ADN, et par la suite, de déterminer l’effet d’une telle association sur la topologie de l’ADN.

N’oubliez pas que travailler avec du bromure d’éthidium peut être extrêmement dangereux et, par conséquent, un équipement de protection approprié doit toujours être porté lors de la réalisation de cette expérience.