Name: Des outils pour étudier le rôle de larchitecture Protein HMGB1 dans le traitement des Helix effets de distorsion, lADN spécifique du site InterStrand Crosslinks (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 19 s
Description: Découvrez l'immunoprécipitation chromatine modifiée et les essais de sur-enroulement ADN pour étudier les dommages ADN spécifiques induits par agents chimiothérapeutiques dans les cellules humaines. Cette méthode identifie de nouvelles cibles pharmacologiques pour la thérapie anticancéreuse.

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Les auteurs tiennent à remercier les membres du laboratoire Vasquez pour des discussions utiles. Ce travail a été soutenu par les Instituts nationaux de la santé / Institut national du cancer [CA097175, CA093279 à KMV]; et la prévention du cancer et de l&#39;Institut de recherche du Texas [RP101501]. Le financement des frais d&#39;accès ouvert: National Institutes of Health / National Cancer Institute [de CA093279 à KMV].

1. Préparation de ICL TFO dirigés sur le plasmide Substrats <ol><li> Incuber quantités équimolaires de plasmide pSupFG1 10,11 ADN (ADN plasmidique 5 ug est un bon point de départ) avec psoralène conjugué TFO AG30 dans 8 pi de tampon de triplex de liaison [50% de glycérol, Tris 10 mM (pH 7,6), mM MgCl 10 2] , et dH 2 O pour un volume final de 40 pi dans un tube de couleur ambre. Mélanger soigneusement par pipetage de haut en bas. Laisser incuber la réaction à 37 ° C bain d&#39;eau pendant 12 heures. </li><li> Réchauffez la lampe UVA pour assurer la pleine puissance. Placez la réaction de triplex sur la pellicule de paraffine, et placer le film de paraffine sur la glace sous la (nM 365) lampe UVA. Placer un filtre mylar entre la lampe et la réaction. </li><li> UVA irradient pour une dose totale de 1,8 J / cm 2. Conserver les échantillons à 4 ° C pour une utilisation ultérieure. Attention: Porter des lunettes de protection et des vêtements avec une irradiation UVA. </li><li> Linéariser 200 ng du plasmide préparé ci-dessus avec la restriction enzyme Eco R1 dans un volume total de 20 ul à l&#39; aide du fabricant fourni 10x tampon. Heat dénaturent l&#39;enzyme pendant 20 min à 65 ° C. Faites tourner les échantillons pendant 10 minutes à 10.000 xg et stocker à 4 ° C. </li><li> Préparer 50x tampon alcaline [NaOH 1,5 M, 50 mM d&#39;acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA)]. Ajouter 0,5 mg d&#39;agarose à 50 ml dH 2 O. Faire bouillir pour dissoudre l&#39;agarose et le placer dans un bain d&#39;eau à 50 °. </li><li> Après que la température de l&#39;agarose dissous est à 50 ° C, ajouter 1 ml de tampon 50x alcaline, mélanger puis verser le gel dans le bac de gel. Prévoyez du temps pour le gel de se solidifier à la température ambiante avant utilisation. </li><li> Ajouter 4 ul de 0,5 M d&#39;EDTA à 20 ul d&#39;échantillon d&#39;ADN linéarisée et laisser incuber pendant 10 min à température ambiante. </li><li> Ajouter un tampon de chargement de gel alcalin 6x (NaOH 300 mM, 6 mM d&#39; EDTA, 18% (p / v) d&#39;un polysaccharide de poids moléculaire élevé, à 0,06% de vert de bromocrésol dans dH 2 O) aux échantillons et à une échelle d&#39; ADN de 1 kb. NOTE: Il est important d&#39;utiliser un tampon de chargement de gel alcalin 6x, s&#39;il vous plaît voir la discussion. </li><li> Charger les échantillons sur le gel dans la chambre froide et courir la nuit dans un tampon alcalin 1x (12-16 h) à 3,2 volts par cm. Une fois que les échantillons sont entrés dans le gel, placer une plaque de verre sur le dessus du gel pour l&#39;empêcher de flotter. </li><li> Neutraliser les échantillons par trempage du gel dans un tampon de neutralisation [1 M de Tris-Cl (pH 7,6), 1,5 M de NaCl, 3 M d&#39;acétate de sodium (pH 5,2)] pendant 45 min à température ambiante. </li><li> Colorer le gel de l&#39;ADN avec 4 ul de 1% de bromure d&#39;éthidium (EtBr) dans 50 ml d&#39;eau pendant 1 heure à température ambiante. Destain avec de l&#39;eau pendant 15 min. Visualiser l&#39;ADN en utilisant un système d&#39;imagerie. Attention: EtBr est un mutagène puissant et peut être absorbé par la peau. Éviter tout contact direct avec EtBr. </li></ol> 2. Transfection et immunoprécipitation de ICL contenant Plasmides TFO dirigées dans des cellules humaines <ol><li> Plate 400.000 cellules de mammifères (par exemple, U2OS ocellules steosarcoma) par boîte de 60 mm dans du milieu Eagle modifié Dulbecco (DMEM) additionné de 10% de sérum de veau fœtal (FBS) sans antibiotiques 24 heures avant la transfection. Incuber les cellules pendant une nuit à 37 ° C avec 5% de CO 2. </li><li> Avant la transfection, le milieu de croissance chaud et du tampon phosphate salin (PBS) à 37 ° C dans un bain d&#39;eau. Chauffer le réactif de transfection à la température ambiante. </li><li> Incuber 30 ul de réactif de transfection avec 500 ul de milieu de croissance 1x (mélange 1) et 2 pg de tubes à fond rond TFO dirigés ICL contenant des plasmides dans 500 ul de 1 x milieu de croissance (mélange 2) dans séparés 14 ml pendant 10 min à température ambiante. </li><li> Ajouter mélange 1 à mélanger 2, bien mélanger par pipetage de haut en bas. Incuber pendant 25-30 minutes à la température ambiante. </li><li> Laver les cellules deux fois avec du PBS chaud. Ajouter le mélange de transfection d&#39;une manière goutte à goutte répartir uniformément dans toute la plaque de cellules. Ajouter 1 ml de milieu de croissance de la plaque, et amener le volume final à 2 ml. Mélanger nousll. Placez les plaques de culture à 37 ° C incubateur avec 5% de CO 2 pendant 4 heures. </li><li> Remplacer le support avec 3 ml de milieux de croissance supplémenté avec 10% de FBS, et on incube encore pendant 16 heures. Ne pas utiliser des antibiotiques. </li><li> Traiter les cellules avec 80 pl de 37% de formaldéhyde fraîche par plaque à une concentration finale d&#39;environ 1% et on incube pendant 10 minutes à la température ambiante en l&#39;absence de lumière. Attention: Le formaldéhyde est toxique et doit être manipulé en fonction de ses consignes de sécurité. l&#39;exposition au formaldéhyde peut causer des dommages à la peau, des yeux et des voies respiratoires. </li><li> Étancher le formaldéhyde réticulant par addition de 300 ul de glycine réfrigérée (fournie dans le kit disponible dans le commerce) par plaque et incuber pendant 5 min. Retirez les médias et laver deux fois avec PBS refroidi, puis recueillir des cellules par grattage dans 1 ml refroidi (4 ° C) PBS dans un tube de microcentrifugeuse. Gardez les échantillons sur la glace en tout temps. </li><li> Préparer des pastilles de cellules par centrifugation à 4 ° C pendant 5 min, unet 13.400 xg en utilisant une table réfrigérée centrifugeuse. Pipet le surnageant et placer le culot cellulaire sur la glace. </li><li> De manière homogène resuspendre le culot dans 1 ml refroidie (4 ° C) Tampon A (fournie dans le kit disponible dans le commerce) et laisser incuber sur de la glace pendant 10 minutes. Mélanger de temps en temps en inversant le tube. cellules à granules comme avant (voir l&#39;étape 2.9 ci-dessus). </li><li> De manière homogène resuspendre le culot dans 1 ml refroidie (4 ° C) Tampon B (fournie dans le kit disponible dans le commerce) et laisser incuber sur de la glace pendant 10 min avec un mélange occasionnel par inversion. cellules à granules par centrifugation comme précédemment (voir étape 2.9 ci-dessus). </li><li> Resuspendre les cellules à nouveau dans 200 pi réfrigérés Buffer B. Ajouter 2 pl de micrococcique nucléase (MNase) et incuber à température ambiante pendant 10 min. Mélanger la réaction de temps en temps en tapotant le tube. Arrêter la réaction MNase en plaçant le tube sur de la glace et en ajoutant 40 mM d&#39;EDTA. cellules à granules comme avant (voir l&#39;étape 2.9 ci-dessus). </li><li> Resuspendre les cellules dans 100 immunopr chromatine ul 1xecipitation tampon (ChIP) du tampon (fournie dans le kit disponible dans le commerce) additionné de cocktail inhibiteur de protease. </li><li> Placez les cellules remises en suspension dans un tube de microcentrifugation à paroi mince. Soniquer les échantillons en les faisant flotter sur l&#39;eau de bain sonicateur pendant 20 secondes puis 20 secondes d&#39;incubation sur de la glace. Répétez les étapes 9 fois sonication pour générer ~ 800-1200 fragments de pb. <ol><li> 20 ul des échantillons soniqués ajoute 3 ul de NaCl 5 M et 1 pi de RNase A. Bien mélanger par tourbillonnement et on incube à 37 ° C pendant 30 min. Par la suite, ajouter 2 pl Proteinase K et incuber pendant 2 heures à 65 ° C. Purifier les échantillons en utilisant un kit de purification PCR. Exécutez des échantillons sur un gel d&#39;agarose à 1% et visualiser avec EtBr. REMARQUE: L&#39;intensité maximale de l&#39;ADN qui en résulte doit être égal ou inférieur à 1000 pb. </li></ol></li><li> Dans trois tubes séparés, ajouter 30 ul de lysat dans un tube siliconé prérefroidi, puis ajouter 70 ul de tampon de puces 1x réfrigérées avec des inhibiteurs de protéase ajoutée. Ajouter 1 μg d&#39;anti-immunoglobuline G (IgG), H3 anti-histones (comme témoin positif) ou des anticorps anti-HMGB1 aux tubes respectifs. Laisser incuber pendant une nuit dans une chambre froide avec une rotation continue. </li><li> Resuspendre protéines G perle homogène dans la chambre froide. Ajouter 4 ul de billes de protéine G par le tube et laisser incuber pendant 2-4 heures dans une chambre froide avec une rotation. </li><li> L&#39;utilisation d&#39;un support magnétique, sédimenter les billes et retirer le surnageant. Ajouter 200 ul de 1 x tampon ChIP mélangé avec un cocktail inhibiteur de la protéase au culot et laver pendant 5 min dans la chambre froide avec la rotation. Répétez laver deux fois. </li><li> Effectuer un lavage supplémentaire avec haute teneur en sel tampon 1x ChIP (contenant 70 mM de NaCl). </li><li> Remettre en suspension les pastilles avec un tampon d&#39;élution de 160 ul (fournie dans le kit disponible dans le commerce) et incuber à 37 ° C avec rotation pendant 30 min. </li><li> Pellet les perles et recueillir le surnageant dans un nouveau tube. Ajouter 6 pi 5 M de NaCl et 2 pl de proteinase K, et incuber une nuit à 65° C. </li><li> On purifie l&#39;ADN en utilisant un kit de purification de produit de PCR et éluer l&#39;ADN en utilisant 50 ul dH 2 O. </li><li> Effectuer PCR 16 réactions en utilisant des jeux d&#39;amorces pour la région (s) d&#39;intérêt, et de résoudre les produits sur un gel d&#39; agarose 1% coloré avec EtBr. </li></ol> 3. surenroulement Assay et 2 dimensions Agarose Gel Electrophoresis <ol><li> Préparer l&#39; ADN du tampon de synthèse de réparation (45 mM de Hepes-KOH, pH 7,8, 70 mM de KCl, 7,4 mM MgCl2, DTT mM , 0,9, EDTA 0,4 mM, 2 mM d&#39; ATP, 20 uM de dNTP, 3,4% de glycerol et 18 ug sérumalbumine bovine) . Conserver à -80 ° C. Thaw sur la glace et avant utilisation ajouter 40 phosphocréatine mM et 2,5 pg de la créatine phosphokinase. </li><li> Préparer 10x surenroulement tampon [Tris 500 (pH 8,0), NaCl 500 mM, MgCl2 25 mM, EDTA 1 mM], et conserver à la température ambiante. </li><li> Linéariser 300 ng d&#39;ADN plasmidique surenroulé pSupFG1 complètement en utilisant 1 ul de virus de la vaccine topoisomérase I (5-15 U / pl), avec 1xtampon de surenroulement dans une réaction de 10 ul. Laisser incuber le mélange à 37 ° C pendant 1 heure. </li><li> Décongeler HeLa extrait exempt de cellules 24 sur la glace. Pour les plasmides complètement détendus, ajoutez l&#39;extrait exempt de cellules HeLa 25 pi et un tampon de synthèse de réparation d&#39;ADN. Bien mélanger. Ajouter 1 pl supplémentaires de Vaccinia topoisomérase I au mélange, et incuber pendant 1 heure à 37 ° C. </li><li> Mettre un terme aux réactions par addition de dodécylsulfate de sodium (SDS) (1% en concentration finale) et de la proteinase K (0,25 mg / ml de concentration finale). Incuber à 65 ° C pendant 2 heures. </li><li> Couler un gel d&#39;agarose 1% avec 1 x Tris Borate EDTA (TBE). Ajouter colorant de chargement de l&#39;ADN et charger les réactions directement sur le gel au moins 4 voies en dehors. Exécutez le gel pendant 8-10 h à 2 V / cm 1x TBE (dimension 1) à la température ambiante pour résoudre les topo-isomères. NOTE: Préparer une solution stock 5x TBE dans 1 L de dH 2 O en ajoutant 54 g de base Tris. 27,5 g d&#39;acide borique et 20 ml d&#39;EDTA 0,5 M (pH 8,0). </li><li> Préparer 2 L de 1xTBE avec 3 pg / ml chloroquine-phosphate. Faire tremper le gel dans 200 ml de cette solution pendant 20 min. Couvrir le plateau de gel avec du papier d&#39;aluminium. </li><li> Pour l&#39;électrophorèse du gel dans la deuxième dimension, tourner le gel de 90 ° dans le sens horaire et l&#39;exécuter pour 4-6 heures à 2 V / cm chloroquine contenant 1x TBE pour résoudre les supertours positifs et négatifs. </li><li> Colorer le gel avec EtBr pendant 1 heure sur une bascule. Décolorer le gel avec dH2Û pendant 15 min, puis de visualiser la distribution thermique des topo - isomères à l&#39; aide d&#39; une caméra. </li></ol>

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<li>Betous, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+TLS+DNA+polymerases+eta+and+kappa+in+processing+naturally+occurring+structured+DNA+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Carcinog%22%5BJournal%5D)">Role of TLS DNA polymerases eta and kappa in processing naturally occurring structured DNA in human cells.</a> Mol Carcinog. 48, 369-378 (2009).</li>
<li>Luo, Z., Macris, M. A., Faruqi, A. F., Glazer, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-frequency+intrachromosomal+gene+conversion+induced+by+triplex-forming+oligonucleotides+microinjected+into+mouse+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">High-frequency intrachromosomal gene conversion induced by triplex-forming oligonucleotides microinjected into mouse cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 97, 9003-9008 (2000).</li>
<li>Vasquez, K. M., Wang, G., Havre, P. A., Glazer, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosomal+mutations+induced+by+triplex-forming+oligonucleotides+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Chromosomal mutations induced by triplex-forming oligonucleotides in mammalian cells.</a> Nucleic Acids Res. 27, 1176-1181 (1999).</li>
<li>Puri, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimum+number+of+2%27-O-%282-aminoethyl%29+residues+required+for+gene+knockout+activity+by+triple+helix+forming+oligonucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Minimum number of 2'-O-(2-aminoethyl) residues required for gene knockout activity by triple helix forming oligonucleotides.</a> Biochemistry. 41, 7716-7724 (2002).</li>
<li>Christensen, L. A., Finch, R. A., Booker, A. J., Vasquez, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+oncogenes+to+improve+breast+cancer+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Targeting oncogenes to improve breast cancer chemotherapy.</a> Cancer Res. 66, 4089-4094 (2006).</li>
<li>Boulware, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triplex-forming+oligonucleotides+targeting+c-MYC+potentiate+the+anti-tumor+activity+of+gemcitabine+in+a+mouse+model+of+human+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Carcinog%22%5BJournal%5D)">Triplex-forming oligonucleotides targeting c-MYC potentiate the anti-tumor activity of gemcitabine in a mouse model of human cancer.</a> Mol Carcinog. 53, 744-752 (2014).</li>
</ol>

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

La formation efficace des ICL TFO dirigés dépend de deux facteurs essentiels: premièrement, des composants tampons appropriée (par exemple, MgCl 2) et le temps d&#39;incubation de la TFO avec son substrat d&#39;ADN cible ( en fonction de l&#39;affinité de liaison de l&#39;TFO à sa cible recto-verso, et que les concentrations utilisées); et deuxièmement, la dose appropriée des UVA (365 nm), l&#39;irradiation pour former des reticulations de psoralène de manière efficace. la formation d&#39;un triplex ...

Formant des triplex d&#39; oligonucléotides (OFT) un ADN duplex se lient d&#39;une manière spécifique d&#39; une séquence via une liaison de Hoogsteen d&#39;hydrogène pour former des structures en triple hélice 1-5. La technologie triplex a été utilisé pour interroger une variété de mécanismes biomoléculaires, tels que la transcription, la réparation des dommages de l&#39; ADN et le ciblage génique (passé en revue dans les références 6-8). OFT ont été largement utilisés pour induire des dommages spécifiques au site sur les plasmides rapporteurs 9,10. Notre laboratoire et d&#39; autres ont déjà utilisé un TFO, AG30, attaché à une molécule de psoralène pour induire l&#39; ADN interbrins réticulations spécifiques du site (de ICL) dans le gène supF sur le pSupFG1 plasmidique 5,10-12. ICL sont hautement cytotoxique que ces lésions réticulent de manière covalente les deux brins d&#39;ADN, et si elle unrepaired, peut bloquer la transcription des gènes et empêcher la réplication des machines d&#39;ADN 13,14. En raison de leur potentiel cytotoxique, des agents induisant ICL ont été utilisés comme médicaments chimiothérapeutiques dans le traitementdu cancer et d&#39; autres maladies 15. Cependant, le traitement et la réparation des ICL dans les cellules humaines ne sont pas bien comprises. Ainsi, une meilleure compréhension des mécanismes impliqués dans le traitement des ICL dans les cellules humaines peut aider à améliorer l&#39;efficacité des régimes chimiothérapeutiques à base d&#39;ICL. ICL TFO-induits et leurs intermédiaires de réparation ont le potentiel de provoquer des distorsions structurelles importantes à l&#39;hélice de l&#39;ADN. De telles distorsions sont des cibles probables pour les protéines d&#39; architecture, qui se lient à l&#39; ADN déformé avec une affinité supérieure à canonique B-forme duplex ADN 16-20. Ici, nous avons étudié l&#39;association d&#39;une protéine architecturale très abondante, HMGB1 avec ICL dans les cellules humaines par l&#39;intermédiaire d&#39;immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) essais sur des plasmides de psoralène-réticulé et identifié un rôle pour HMGB1 dans la modulation de la topologie de l&#39;ADN plasmidique psoralène réticulé chez l&#39;homme des lysats de cellules cancéreuses. HMGB1 est une très abondante et ubiquitaire non sonton protéine architecturale qui se lie à l&#39; ADN endommagé et les substrats d&#39;ADN alternativement structurés avec une affinité supérieure canonique forme B de l&#39; ADN 17-20. HMGB1 est impliqué dans plusieurs processus ADN métaboliques, tels que la transcription, la réplication de l&#39; ADN et la réparation d&#39; ADN 16,21-23. Nous avons déjà démontré que HMGB1 se lie à ICL TFO dirigées in vitro avec une grande affinité 20. De plus, nous avons démontré que le manque de HMGB1 a augmenté le traitement mutagène de ICL TFO dirigées et HMGB1 identifié comme une réparation nucleotide excision (NER) co-facteur 23,24. Récemment, nous avons constaté que HMGB1 est associée à ICL TFO dirigées dans les cellules humaines et son recrutement à ces lésions dépend de la protéine NER, XPA 16. Surenroulement négatif de l&#39; ADN a été montré pour favoriser l&#39;élimination efficace des lésions de l&#39; ADN par NER 25, et nous avons constaté que HMGB1 induit surenroulement négatif préférentiellement sur plas ICL contenant TFO dirigéessubstrats milieu ( par rapport aux plasmides substrats non endommagés) 16, fournissant une meilleure compréhension du rôle (s) potentiel de HMGB1 comme un co-facteur de NER. Le traitement des ICL est pas entièrement comprise dans les cellules humaines; ainsi, les techniques et les analyses développées sur la base des outils moléculaires décrits ici pourraient conduire à l&#39;identification de protéines supplémentaires impliquées dans la réparation ICL, qui peut à son tour servir de cibles pharmacologiques qui peuvent être exploitées pour améliorer l&#39;efficacité des traitements de chimiothérapie du cancer. Ici, une approche efficace pour évaluer l&#39;efficacité de la formation ICL TFO dirigée dans l&#39;ADN plasmidique par électrophorèse sur gel dénaturant d&#39;agarose a été discuté. En outre, en utilisant les plasmides contenant les ICL TFO dirigées, des techniques pour déterminer l&#39;association de HMGB1 avec des plasmides ICL endommagés dans un contexte cellulaire en utilisant des essais ChIP modifiés ont été décrits. En outre, une méthode facile pour étudier les modifications topologiques introduites par ee protéine HMGB1 architecturale, en particulier sur des substrats de plasmide ICL endommagés dans les lysats de cellules humaines a été déterminée en effectuant des essais de surenroulement par électrophorèse sur gel d&#39;agarose à deux dimensions. Les techniques décrites peuvent être utilisées pour favoriser la compréhension de l&#39;implication de la réparation de l&#39;ADN et des protéines d&#39;architecture dans le traitement des lésions de l&#39;ADN ciblé sur des plasmides dans les cellules humaines. Nous décrivons des protocoles détaillés pour la formation d&#39;ICL psoralène spécifiques au site TFO dirigés sur l&#39;ADN de plasmide et le plasmide subséquent ChIP et surenroulement des dosages pour identifier des protéines qui associent les lésions et les protéines qui modifient la topologie de l&#39;ADN, respectivement. Ces dosages peuvent être modifiés pour produire avec d&#39;autres agents endommageant l&#39;ADN, OFT, des substrats de plasmide et des lignées de cellules de mammifères présentant un intérêt. En fait, nous avons montré qu&#39;il existe au moins un site potentiel TFO affinité de liaison unique et élevé au sein de chaque gène annoté dans le génome humain 26. Commentjamais, pour plus de clarté, nous avons décrit ces techniques pour l&#39;utilisation d&#39;un TFO spécifique psoralène-conjugué (pAG30) sur un plasmide mutation-rapporteur spécifique (pSupFG1) dans les cellules U2OS humaines que nous avons utilisé dans Mukherjee &amp; Vasquez 2016 16.

<table><tbody><tr><td>5'HMT Psoralen-AG30</td><td>Midland Certified Reagent Co., Midland, TX</td><td>Commande sur mesure</td><td>HPLC (ou gel) purifié</td></tr><tr><td>Simple ChIP Enzymatic Chromatine IP Kit</td><td>Cell signaling Inc.</td><td>9003</td><td>Le protocole suggéré par le fabricant est optimisé pour la propriété intellectuelle de la chromatine et non pour la propriété intellectuelle du plasmide. Les anticorps de contrôle IgG et H3 ainsi que les billes de protéine G et la nucléase micrococcique sont fournis par le fabricant.</td></tr><tr><td>GoTaq Green</td><td>Promega</td><td>M7122</td><td>PCR master mix</td></tr><tr><td>HMGB1 anticorps</td><td>Abcam</td><td>Ab18256</td><td></td></tr><tr><td>Wizard Gel et kit de nettoyage PCR</td><td>Promega</td><td>A9281</td><td></td></tr><tr><td>Sel de chloroquine-diphosphate</td><td>Sigma</td><td>C6628-50G</td><td>Pour électrophorèse bidimensionnelle sur gel d’agarose</td></tr><tr><td>EcoRI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0101S</td><td></td></tr><tr><td>GenePORTER réactif de transfection</td><td>Genlantis</td><td>T201015</td><td></td></tr><tr><td>Vaccinia Topoisomerase I</td><td>Invitrogen</td><td>38042-024</td><td></td></tr><tr><td>Blak-Ray lampe ultraviolette à ondes longues</td><td>Upland, CA</td><td>B 100 AP</td><td>Lampe UVA</td></tr><tr><td>EpiSonic Multi-Functional Bioprocessor 1100</td><td>Epigentek</td><td>EQC-1100</td><td>Sonicateur à bain d’eau</td></tr><tr><td>Filtre Mylar</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td></td><td></td>80112939</tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6111</td><td></td></tr><tr><td>BIO-RAD Chemidoc</td><td>Système BIO-RAD</td><td>XRS+</td><td>Système d’imagerie ADN</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP381-500</td><td></td></tr><tr><td>37 % Formaldéhyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8775-25ML</td><td>Utilisé pour la réticulation&nbsp ;</td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>New England Biolabs</td><td>P8107S</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>ThermoFisher</td><td>11965092</td><td>Milieux de culture cellulaire</td></tr><tr><td>PBS</td><td>ThermoFisher</td><td>70013073</td><td>Culture cellulaire</td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA</td><td>ThermoFisher</td><td>25200056</td><td>Culture cellulaire</td></tr><tr><td>Vert de bromocresol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>114-359</td><td>Colorant de chargement d’ADN</td></tr><tr><td>Tubes siliconés</td><td>Fisher Scientific&nbsp ;</td><td>02-681-320</td><td>Tube microfuge à faible rétention</td></tr><tr><td>Base Tris</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-1</td><td></td></tr><tr><td>Acide borique</td><td>Fisher Scientific</td><td>A74-1</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP24731</td><td></td></tr><tr><td>Photomètre</td><td>InternationalLight Technologies</td><td>ILT1400-A</td><td>Mesure de la dose UVA</td></tr><tr><td>Cell lines</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ostéosarcome humain U2OS</td><td>ATCC</td><td>ATCC HTB-96</td><td>Cultivé selon le fournisseur s recommandation</td></tr><tr><td>Adénocarcinome cervical humain HeLa</td><td>ATCC</td><td>ATCC-CCL-2</td><td>Cultivé selon le fournisseur' s recommandation</td></tr><tr><td>Amorce avant proximale</td><td>5&prime ;-gcc ccc ctg acg agc atc ac</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amorce inverse proximale</td><td>5&prime ;-tag tta ccg gat aag gcg cag cgg</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Distal forward primer</td><td>5&prime ;-aat acc gcg cca cat agc ag Distal</td><td></td><td></td></tr><tr><td>reverse primer</td><td>5&prime ;-agt att caa cat ttc cgt gtc gcc</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

des outils pour étudier le rôle de l&#39;architecture protein hmgb1 dans le traitement des helix effets de distorsion, l&#39;adn spécifique du site interstrand crosslinks

Tools to Study the Role of Architectural Protein HMGB1 in the Processing of Helix Distorting, Site-specific DNA Interstrand Crosslinks

Boîte de high mobility group 1 (HMGB1) protéine est une protéine non-histone architecturale qui est impliquée dans la régulation de nombreuses fonctions importantes dans le génome, tels que la transcription, la réplication de l&#39;ADN et la réparation d&#39;ADN. HMGB1 se lie à l&#39;ADN structurellement déformée avec une affinité supérieure à celle de l&#39;ADN-B canonique. Par exemple, nous avons constaté que la HMGB1 se lie à l&#39;ADN (reticulations interbrins CIST), qui lient de manière covalente les deux brins de l&#39;ADN, provoquent la déformation de l&#39;hélice, et si on les laisse non réparée peut provoquer la mort cellulaire. En raison de leur potentiel cytotoxique, plusieurs agents ICL-inductrices sont actuellement utilisés comme agents chimiothérapeutiques dans la clinique. Alors que les agents ICL formant montrent des préférences pour certaines séquences de base (par exemple, 5&#39;-TA-3 &#39;est le site de réticulation préféré pour psoralène), ils induisent en grande partie des dommages de l&#39; ADN d&#39;une manière aveugle. Cependant, en couplant de façon covalente l&#39;agent induisant la LSC à un oligonucléotide formant triplex (TFO), qui se lie à l&#39;ADN dans une séquence spécifiqueAinsi, des dommages de l&#39;ADN cible peut être atteint. Ici, nous utilisons un TFO conjugué de manière covalente sur &#39;extrémité à un 4&#39;-hydroxyméthyl-4,5&#39; 5 (HMT) psoralène, 8-triméthylpsoralène pour générer un ICL site spécifique sur un plasmide mutation-reporter pour l&#39;utiliser comme un outil pour étudier la modification architecturale, le traitement et la réparation des lésions de l&#39;ADN complexes par HMGB1 dans les cellules humaines. Nous décrivons les techniques expérimentales pour préparer ICL TFO dirigés sur des plasmides rapporteurs et d&#39;interroger l&#39;association de HMGB1 avec les ICL TFO dirigées dans un contexte cellulaire en utilisant des tests chromatine immunoprécipitation. En outre, nous décrivons des tests de surenroulement de l&#39;ADN pour évaluer la modification d&#39;architecture spécifique de l&#39;ADN endommagé en mesurant la quantité de tours superhélices introduits sur le psoralène réticulé plasmide par HMGB1. Ces techniques peuvent être utilisées pour étudier les rôles des autres protéines impliquées dans le traitement et la réparation des ICL TFO dirigées ou d&#39;autres dommages à l&#39;ADN ciblé dans toute lignée cellulaire d&#39;intérêt.

La formation de la LSC TFO dirigée est essentielle pour les dosages à base de plasmides, qui sont utilisées pour interroger les rôles des protéines architecturales dans le traitement ICL dans les cellules humaines. Dénaturation électrophorèse sur gel d&#39;agarose est un moyen facile de déterminer l&#39;efficacité de la formation ICL TFO dirigée. Les plasmides hébergeant ICL TFO dirigés migrent avec une mobilité plus lente à travers la matrice de gel d&#39;agarose (figure 1A,</st...

Des dommages ciblés à l’ADN peuvent être obtenus en attachant un agent endommageant l’ADN à un oligonucléotide formant un triplex (TFO). À l’aide de TFO modifiés, l’association de protéines spécifiques aux dommages à l’ADN et la modification de la topologie de l’ADN peuvent être étudiées dans des cellules humaines à l’aide de tests d’immunoprécipitation de la chromatine modifiée et de tests de super-enroulement de l’ADN décrits dans le présent document.

Des outils pour étudier le rôle de l&#39;architecture Protein HMGB1 dans le traitement des Helix effets de distorsion, l&#39;ADN spécifique du site InterStrand Crosslinks

High mobility group box 1 (HMGB1) protein is a non-histone architectural protein that is involved in regulating many important functions in the genome, ...

L'objectif général des expériences modifiées de chromatine immunoprécipitée et de superenroulement de l'ADN est d'étudier l'association et les modifications topologiques ultérieures induites par des protéines architecturales sur des lésions d'ADN spécifiques au site, provoquées par des agents chimiothérapeutiques ou cancérogènes dans les cellules humaines. Cette méthodologie nous permettra d'aborder des questions essentielles sur les lésions et la réparation de l'ADN, ce qui devrait faciliter la découverte de nouvelles cibles pharmacologiques pour le traitement du cancer. Notre technologie nous permet d'induire des lésions d'ADN spécifiques à un site donné et facilite l'évaluation des processus critiques de réparation de l'ADN liés au cancer humain.Pour commencer, 24 heures avant la transfection, ensemencez 400 000 cellules de mammifères par boîte de 60 millimètres dans du DMEM complété avec 10 % de FBS et sans antibiotiques. Incubez les cellules à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant la nuit. Dans un tube conique de 14 millilitres à fond rond, mélangez 30 microlitres d'agent de transfection à température ambiante avec 500 microlitres de milieu de croissance 1X préalablement réchauffé à 37 degrés Celsius.Dans un deuxième tube, combiner deux microgrammes de plasmides contenant des liaisons covalentes inter-brins dirigés par un ODN triple brin dans 500 microlitres de milieu de croissance 1X. Incuber les tubes à température ambiante pendant 10 minutes. Combiner le mélange un avec le mélange deux, puis pipeter plusieurs fois vers le haut et vers le bas pour bien mélanger.Incubez ensuite la solution à température ambiante pendant 25 à 30 minutes. Ensuite, utilisez du PBS tiède pour laver les cellules deux fois. Puis, ajoutez le mélange de transfection goutte à goutte, en répartissant la solution uniformément sur la totalité de la plaque de cellules.Ajoutez un millilitre de milieu de croissance dans la plaque, puis amenez le volume final à deux millilitres. Mélangez soigneusement, puis placez les plaques de culture à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone. Quatre heures plus tard, remplacez le milieu par trois millilitres de milieu de croissance contenant 10 % de FBS, puis incubez pendant 16 heures supplémentaires.Après l'incubation, ajouter 80 microlitres de formaldéhyde frais à 37 % par plaque dans les cellules, puis incuber à température ambiante à l'abri de la lumière pendant 10 minutes. Bloquer la réticulation par le formaldéhyde en ajoutant 300 microlitres de glycine froide par plaque, et incuber pendant cinq minutes. Puis éliminer le milieu et utiliser du PBS froid pour laver les plaques deux fois.Ensuite, après avoir ajouté un millimètre de PBS froid, récupérez les cellules par écaillage dans un tube microcentrifuge sur glace, en conservant les échantillons sur glace en tout temps. Préparez les culots cellulaires par centrifugation à 13 400 × g et à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes. Puis, éliminez le surnageant et placez les culots sur glace.Utilisez un millilitre de tampon A froid pour redisperser homogènement les culots, puis incubez sur glace pendant 10 minutes. Ensuite, centrifugez les cellules comme précédemment. Maintenant, redisperser homogènement les culots dans un millilitre de tampon B froid, puis incubez sur glace pendant 10 minutes en mélangeant occasionnellement par retournement.Ensuite, centrifuger les cellules comme précédemment. Après avoir de nouveau resuspendu les cellules dans 200 microlitres de tampon B refroidi, ajouter deux microlitres de nucléase micrococquique, ou MNase, et incuber la réaction à température ambiante pendant 10 minutes. Puis, arrêter la réaction de la MNase en plaçant les tubes sur de la glace et en ajoutant 40 millimolaire de EDTA.Le degré de digestion par la nucléase micrococcale est très critique, car une surdigestion peut entraîner une perte de signal, tandis qu'une sous-digestion peut provoquer un fort fond parasite non spécifique. Après avoir centrifugé les cellules, re-suspendez les culots dans 100 microlitres de tampon d'immunoprécipitation de la chromatine, ou tampon ChIP, supplémenté avec un cocktail d'inhibiteurs de protéases. Ensuite, transférez la suspension cellulaire dans un tube microcentrifuge à paroi mince.Soniquez les échantillons en les plaçant dans un bain ultrasons pendant 20 secondes, puis placez-les 20 secondes sur de la glace. Répétez les étapes de sonication neuf fois afin d'obtenir des fragments d'environ 800 à 1 200 paires de bases. À 20 microlitres des échantillons soniqués, ajoutez trois microlitres de chlorure de sodium à cinq molaire et un microlitre de RNase A. Vortexez les tubes et incubez-les à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes.Ensuite, ajouter deux microlitres de protéinase K et incuber à 65 degrés Celsius pendant deux heures. Après purification des échantillons selon le protocole indiqué dans le texte, les faire migrer sur un gel d'agarose à 1 % et les visualiser avec du bromure d'éthidium. Dans trois tubes distincts, prérefroidis et silanisés, ajouter 30 microlitres de lyzat et 70 microlitres de tampon ChIP 1X refroidi contenant des inhibiteurs de protéases.Ajouter un microgramme d'anticorps anti-IgG, anti-histone H3 ou anti-HMGB1 dans les tubes respectifs. Incuber toute la nuit dans une chambre froide avec rotation continue. Dans la chambre froide, après avoir re-suspendu les billes de protéine G, ajouter quatre microlitres de ces billes dans chaque tube de réaction, puis incuber dans la chambre froide avec rotation pendant deux à quatre heures supplémentaires.Placer les tubes sur un support magnétique pour faire tomber les billes en pellet, puis éliminer le surnageant. Ajouter 200 microlitres de tampon ChIP 1X contenant un cocktail d'inhibiteurs de protéase aux pellets, et laver à froid sous agitation rotative pendant cinq minutes. Ensuite, effectuer un lavage supplémentaire avec le tampon ChIP 1X à haute teneur en sel.Ensuite, utiliser 160 microlitres de tampon d'élution pour resuspendre les culots, puis incuber à 37 degrés Celsius avec agitation pendant 30 minutes. Centrifuger pour former un culot des billes et récupérer le surnageant dans un tube propre. Ajouter six microlitres de chlorure de sodium à cinq molaire et deux microlitres de protéinase K, puis incuber toute la nuit à 65 degrés Celsius.Après avoir purifié l'ADN selon le protocole indiqué dans le texte, réalisez des réactions de PCR en utilisant des jeux d'amorces ciblant la ou les régions d'intérêt, puis séparez les produits sur un gel d'agarose à 1 %, coloré avec du bromure d'éthidium. Avant utilisation, décongelez sur de la glace le tampon de synthèse de réparation de l'ADN préparé précédemment, puis ajoutez 40 millimolaire de phosphocréatine et 2,5 microgrammes de créatine phosphokinase. Après avoir préparé le tampon de superenroulement 10X selon le protocole indiqué dans le texte, utilisez un microlitre de topoisomérase 1 du virus vaccinia avec le tampon de superenroulement 1X dans une réaction de 10 microlitres afin de linéariser 300 nanogrammes de plasmide superenroulé, PCA FG1.Aux plasmides relaxés, ajouter 25 microlitres d'extrait de cellules HeLa décongelé fraîchement et du tampon de synthèse d'ADN. Bien mélanger, puis ajouter un microlitre de topoisomérase 1 vaccinia à la réaction, et incuber à 37 degrés Celsius pendant une heure. Arrêter les réactions en ajoutant 1 % de SDS et 0,25 milligramme par millilitre de protéinase K, puis incuber à 65 degrés Celsius pendant deux heures.Après avoir coulé un gel d'agarose à 1 % avec du tampon TPE 1X, ajouter le colorant de charge à l'ADN aux réactions, puis charger directement les échantillons sur le gel en les espaçant d'au moins quatre bandes. Faire migrer le gel pendant huit à dix heures à deux volts par centimètre dans du TBE 1X pendant la première dimension à température ambiante afin de séparer les topoisomères. Préparer deux litres de TBE 1X contenant trois microgrammes par millilitre de chloroquine phosphate.Imprégnez le gel de 200 millilitres de la solution, recouvert de papier d’aluminium, pendant 20 minutes. Pour réaliser l’électrophorèse du gel en seconde dimension, faites pivoter le gel de 90 degrés dans le sens horaire, puis faites-le migrer quatre à six heures à deux volts par centimètre dans du chloroquine contenant du TBE 1X afin de séparer les superhélices positives et négatives. La quantité de chloroquine dans le tampon d’électrophorèse et dans le gel est très critique, tout comme le fait de faire migrer le gel à une tension très faible en seconde dimension, ce qui est essentiel pour séparer les superhélices positives et négatives.Après la coloration et la décoloration du gel, conformément au protocole décrit, utilisez un imageur pour visualiser la distribution thermique des topoisomères. Comme on le voit sur ce gel, environ 79 % des plasmides portant des CLIs dirigées par TFO migrent avec une mobilité plus lente à travers la matrice de gel d'agarose par rapport aux plasmides témoins non réticulés. Les tests ChIP réalisés sur des lysats de cellules humaines U2OS transfectées avec un plasmide témoin ou des plasmides contenant des CLIs dirigées par TFO montrent un enrichissement de HMGB1 dans la région P-CLI par rapport à la région témoin, lorsqu'ils sont immunoprécipités avec un anticorps anti-HMGB1.Lorsque la protéine HMGB1 était épuisée dans les cellules par un traitement au siRNA, l'enrichissement spécifique des CIL-P était réduit. Lorsque les mêmes échantillons étaient immunoprécipités à l'aide d'un anticorps anti-IgG, une amplification PCR minimale était détectée. Enfin, dans cette figure, l'électrophorèse bidimensionnelle sur gel d'agarose montre une modification architecturale des plasmides contenant des CIL dirigées par des ODF, sous forme de superenroulement négatif induit par HMGB1 dans des extraits de cellules HeLa.Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en environ cinq jours, si elle est effectuée correctement. Lors de l'exécution de cette procédure, il est très important de se rappeler que tous les lavages doivent être effectués dans une pièce froide, car des lavages à température ambiante pourraient augmenter le signal de fond. Après cette procédure, d'autres méthodes, telles que la déplétion de protéines par ARNsi, suivie de tests de dépistage de mutations, peuvent être réalisées afin de répondre à des questions telles que : la protéine d'intérêt est-elle impliquée dans la réparation de l'ADN ?Ou bien modifie-t-elle de manière significative les spectres de mutations au cours du processus ? Cette technique a ouvert la voie à l'étude de l'association entre les protéines et les lésions spécifiques de l'ADN. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne idée de la manière d'étudier l'association des protéines architecturales avec des cibles de liaisons croisées de l'ADN, puis de déterminer l'effet d'une telle association sur la topologie de l'ADN.N'oubliez pas que le travail avec le bromure d'éthidium peut être extrêmement dangereux, et par conséquent, des équipements de protection appropriés doivent toujours être portés lors de la réalisation de cette expérience.

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Recherche

JoVE Journal

Genetics

Génétique

La méthode Salut-C permet l'identification sans parti pris, l'ensemble du génome des interactions chromatine (1). Salut-C couples ligature de proximité et le séquençage massivement parallèle. Les données obtenues peuvent être utilisées pour étudier l'architecture génomique à plusieurs échelles: premiers résultats identifié des caractéristiques telles que les territoires chromosomiques, la ségrégation de la chromatine ouverte et fermée, et la structure de la chromatine à l'échelle mégabase.

Salut-C: une méthode d&#39;étude de l&#39;architecture tridimensionnelle des génomes.

Ce protocole décrit une méthode pour visualiser un ADN de protéine cassures double-brin de signalisation activées en réponse aux dommages de l'ADN ainsi que sa localisation au cours de la mitose.

Deux et trois dimensions imagerie de cellules vivantes de protéines endommagent l&#39;ADN de réponse

L’imagerie spectroscopique électronique permet d’imager et de distinguer l’acide nucléique de la protéine à une résolution nanométrique. Il peut être combiné avec le système miniSOG, qui est capable de marquer spécifiquement les protéines marquées dans des échantillons de microscopie électronique à transmission. Nous illustrons l’utilisation de ces technologies en utilisant des foyers de réparation de cassures double brin à titre d’exemple.

Visualisation des miniSOG protéines marquées de réparation d&#39;ADN en combinaison avec Electron imagerie spectroscopique (ESI)

Laser microirradiation est un outil utile pour l’étude de la réparation de l’ADN dans les cellules vivantes. Une approche méthodologique pour l’utilisation des lasers UVA pour induire diverses lésions de l’ADN est montrée. Nous avons optimisé une méthode pour microirradiation locale qui gère le cycle cellulaire normal ; ainsi, les cellules irradiées passent par mitose.

Avancée des Techniques de microscopie confocale afin d’étudier les interactions entre protéines et cinétique aux lésions de l’ADN

Étude cinétique de réparation des dommages ADN nécessite un système d’induire des lésions à des régions sub nucléaires définies. Les auteurs décrivent une méthode pour créer des sauts de double-brin localisées à l’aide d’un microscope confocal à balayage laser équipé d’un laser à 405 nm et fournir des procédures automatisées afin de quantifier la dynamique des facteurs de réparation à ces lésions.

Enquête sur le recrutement de protéines aux lésions de l’ADN à l’aide de 405 Nm Laser Micro-irradiation

Suite à des dommages à l’ADN, les cellules humaines activent des voies de réparation essentielles pour restaurer l’intégrité de leur génome. Ici, nous décrivons la méthode de l’immunofluorescence indirecte comme un moyen de détecter les protéines de réparation de l’ADN, d’analyser leur recrutement spatial et temporel, et d’aider à interroger l’interaction protéine-protéine sur les sites de dommages à l’ADN.

Visualisation de l’ADN Réparation des protéines Interaction par immunofluorescence

Cet article présente les étapes essentielles de immunoprecipitation d’immunostaining et de chromatine. Ces protocoles sont couramment utilisés pour étudier les processus cellulaires liés aux dommages à l’ADN et pour visualiser et quantifier le recrutement des protéines impliquées dans la réparation de l’ADN.

Visualisation et quantification des dommages à l’ADN spécifiques au site à base d’endonucléase

Le présent protocole met en évidence une méthode modifiée pour détecter et quantifier les réticulations ADN-protéines (DPC) et leurs modifications post-traductionnelles (PTM), y compris l’ubiquitylation, la SUMOylation et l’ADP-ribosylation induites par les inhibiteurs de la topoisomérase et par le formaldéhyde, permettant ainsi l’étude de la formation et de la réparation des DPC et de leurs PTM.

Détection quantitative des réticulations ADN-protéines et de leurs modifications post-traductionnelles

Ici, nous présentons un protocole simple et rapide pour la détection de l’interaction protéique aux sites de dommages à l’ADN.

Dosage des ligands de proximité pour localiser les protéines dans les sites de dommages à l’ADN

Ce protocole démontre la réalisation d’un test sur une seule molécule pour la visualisation en direct du déroulement de l’ADN par l’hélicase CMG. Il décrit (1) la préparation d’un substrat d’ADN, (2) la purification de l’hélicase CMG de Drosophila melanogaster marquée par fluorescence, (3) la préparation d’une cellule d’écoulement microfluidique pour la microscopie à fluorescence par réflexion interne totale (TIRF) et (4) le test de déroulement de l’ADN à molécule unique.

Visualisation en temps réel d’une molécule unique du déroulement de l’ADN par CMG Helicase

Nous présentons une méthode rapide et efficace pour détecter les ruptures de sites fragiles courants grâce à l’immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) γH2A.X native. Cette approche réduit considérablement le temps et la main-d’œuvre associés aux tests traditionnels γH2A.X ChIP tout en maintenant une reproductibilité et une fiabilité élevées des résultats.

Capture des ruptures de sites fragiles communes par γH2A natif. X ChIP

Découvrez l'immunoprécipitation chromatine modifiée et les essais de sur-enroulement ADN pour étudier les dommages ADN spécifiques induits par agents chimiothérapeutiques dans les cellules humaines. Cette méthode identifie de nouvelles cibles pharmacologiques pour la thérapie anticancéreuse.

Des outils pour étudier le rôle de larchitecture Protein HMGB1 dans le traitement des Helix effets de distorsion, lADN spécifique du site InterStrand Crosslinks (Vidéo) | JoVE Journal

Des outils pour étudier le rôle de l'architecture Protein HMGB1 dans le traitement des Helix effets de distorsion, l'ADN spécifique du site InterStrand Crosslinks

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