Visualisation de l'Agar Charcoal résazurine Essai pour semi-quantitative, Moyen-débit Enumération des mycobactéries

L'objectif général du CARA est de fournir une évaluation semi-quantitative à débit moyen de l'activité de composés contre des mycobactéries en phase de réplication et non répliquantes. Le principal avantage de cette technique réside dans le fait que, servant de substitut au décompte des UFC, le CARA permet de tester rapidement la dépendance en dose et en temps d'un composé. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la découverte de médicaments contre la tuberculose, comme de déterminer si un composé est bactériostatique ou bactéricide contre les bactéries en phase de réplication, et s'il est bactéricide contre les bactéries non répliquantes.

La méthode sera démontrée par Julia Roberts, une collaboratrice de notre laboratoire. Ajouter 450 millilitres d'eau dans un bécher en verre d'un litre ou 900 millilitres d'eau dans un ballon Erlenmeyer de deux litres. Placer un barreau magnétique autoclavable dans le bécher ou le ballon.

Ensuite, ajoutez une poudre de Middlebrook 7H11, du charbon actif pour obtenir une concentration finale de 0,4 % et une solution de glycérol à 50 % pour atteindre une concentration finale de 0,2 %. Recouvrez l'ouverture du flacon ou du bécher avec du papier d'aluminium et fixez-le au verre à l'aide de ruban autoclave. Après stérilisation du milieu en autoclave, laissez-le refroidir à environ 55 à 65 degrés Celsius sur un agitateur magnétique réglé à faible vitesse afin de maintenir le charbon en suspension.

En travaillant de manière aseptique dans une hotte de sécurité biologique équipée d’un agitateur magnétique, retirez la feuille de papier d’aluminium du milieu et ajoutez respectivement 100 ou 50 millilitres de supplément OADC au flacon de deux litres ou au bécher d’un litre, puis continuez à mélanger. À l’aide d’une pipette multicanal munie de huit ou douze embouts filtrants, remplissez une microplaque de 96 puits avec 200 microlitres par puits de 7H11-OADC-charbon actif provenant du réservoir de réactif ou du bécher, en travaillant rapidement pour éviter la solidification de l’agar et la formation de bulles. Placez les empilements de microplaques CARA dans des sacs en plastique refermables afin d’éviter le dessèchement et conservez-les à quatre degrés Celsius.

Inoculer des tubes à centrifuger coniques ou à fond rond en polypropylène contenant respectivement quatre ou 20 millilitres de Middlebrook 7H9-ADN ou 7H9-OADC avec M. smegmatis à une DO580 de 0,01 à 0,1. Incuber les cultures de M. smegmatis à 37 degrés Celsius et 20 % O₂ sous agitation, en étendant les cultures jusqu’à la phase de croissance exponentielle moyenne ou à une DO580 approximative de 0,5. Pour mettre en place une expérience de type concentration minimale inhibitrice dans des conditions de réplication et de non-réplication, répartir 200 microlitres de cellules en 7H9-ADN à une DO580 de 0,01 dans tous les puits d'une plaque 96 puits à fond transparent, traitée pour la culture de tissus.

Pour le test non réplicatif, utiliser du PBS contenant 0,02 % de tyloxapol pour laver les cellules deux fois. Utiliser ensuite le milieu non réplicatif pour resuspendre les cellules. Utiliser le milieu non réplicatif pour diluer les cellules jusqu'à une DO580 de 0,1 et ajouter du nitrate de sodium à une concentration finale de 0,5 à 5 millimolaire à partir d'une solution mère fraîchement préparée de une molaire.

Répartir 200 microlitres de cellules à une DO580 de 0,1 dans tous les puits d'une plaque 96 puits à fond transparent, traitée pour la culture de tissus. Après avoir préparé les agents d'essai conformément au protocole décrit dans le texte, ajouter deux microlitres de l'agent d'essai un dans les rangées A à E et deux microlitres de l'agent d'essai deux dans les rangées E à H, puis mélanger soigneusement. Pour les essais en réplication, incuber les microplaques de M. smegmatis à 37 degrés Celsius, 20 % O2 et 5 % CO2 pendant une à 48 heures.

Aux moments où le CARA sera utilisé comme indicateur, utiliser une pipette multicanal p200 réglée entre 50 et 75 microlitres pour resuspendre soigneusement le contenu des puits de la plaque de dosage de type MIC90 en aspirant et en expulsant de cinq à dix fois. Ensuite, utiliser les embouts de pipette pour agiter doucement le contenu des puits en un mouvement circulaire. Transférer 10 microlitres du contenu des puits de dosage non dilué vers les puits correspondants de la microplaque CARA en évitant les projections lors du transfert, en s'assurant que l'aliquot de 10 microlitres soit déposé au centre des puits de la microplaque CARA.

Avec du ruban adhésif pour plaques, fixez des empilements de microplaques CARA, puis placez-les dans un sac en plastique refermable. Incubez les microplaques CARA de M. smegmatis à 37 degrés Celsius avec 20 % d’O₂ pendant un à deux jours pour les plaques en phase de réplication et de deux à trois jours pour les plaques non réplicatives. Lorsqu’un film de croissance bactérienne ou des colonies macroscopiques plus grandes sont visibles dans les puits du témoin négatif, utilisez un jeu unique de 12 embouts p200 avec une pipette multicanal pour distribuer 40 microlitres de PBS stérile le long du bord des puits, en laissant le PBS se répartir sur la surface des microcolonies bactériennes/agar.

Préparez le réactif de développement CARA en mélangeant cinq milligrammes de résazurine et 50 millilitres de Tween80 à 5 % dans du PBS. Ajoutez 50 microlitres de réactif de développement CARA fraîchement préparé dans chaque puits de la microplaque CARA. Ensuite, agitez doucement les plaques de droite à gauche plusieurs fois pour aider à répartir le réactif uniformément sur l'agar et la pellicule bactérienne de chaque puits.

Placer les plaques dans un sac en plastique refermable et incuber à 37 degrés Celsius pendant au moins 30 minutes pour M. smegmatis. Avant la lecture de la fluorescence, placer les microplaques CARA dans une hotte de sécurité biologique pendant 15 minutes à température ambiante, couvercles retirés. Lors de l'utilisation de spectrophotomètres BSL3 à l'extérieur d'une enceinte de sécurité biologique, fixer une étiquette PCR de qualité optique sur la plaque et utiliser une serviette en papier douce pour bien sceller en appuyant délicatement sur la surface de l'étiquette.

Déterminez la fluorescence par lecture en haut avec une excitation à 530 nanomètres et une émission à 590 nanomètres. Il n'est pas nécessaire de faire un blanc de la plaque. Pour analyser les données, tracez la concentration de l'inhibiteur sur l'axe des X selon une échelle log10 et la fluorescence sur l'axe des Y selon une échelle linéaire.

Se référer au protocole écrit pour des détails supplémentaires. La concentration de l'agent testé entraînant l'absence d'augmentation de la fluorescence CARA au-dessus des niveaux de fond correspond à la CMI-CARA supérieure ou égale à 99, indiquée ici. Le symbole « supérieur ou égal à 99 » en indice indique que la CMI-CARA fournit une concentration estimée de l'agent testé provoquant une réduction bactérienne supérieure ou égale à deux logarithmes décimaux (log₁₀).

On soupçonne les composés d'exercer un effet post-antibiotique s'ils présentent une fenêtre statique, définie comme un décalage vers la droite supérieur à quatre fois entre les courbes de la CMI et de l'ARAC. La fenêtre statique indique qu'une molécule active contre *M. tuberculosis* en phase de replication peut être bactériostatique plutôt que bactéricide. Pour les molécules dotées d'un effet post-antibiotique puissant, les fenêtres statiques peuvent être difficiles à observer et ne deviennent apparentes qu'après examen d'un axe des ordonnées élargi pour la fluorescence de l'ARAC, comme illustré ici.

Les molécules actives réplicatives et non réplicatives testées par les méthodes MIC90 et CARA sont présentées ici. Bien que l'isoniazide et la linézolide semblent présenter une activité contre les bactéries non réplicatives dans le test MIC90, la CARA indique qu'elles sont inactives dans les conditions non réplicatives testées. Dans cette expérience CARA, l'exposition de M. smegmatis à des concentrations croissantes de rifampicine a révélé un effet en aussi peu qu'une heure et a montré une activité bactéricide croissante entre trois et 24 heures, entraînant une réduction d'au moins deux à trois log10 à environ 10 microgrammes par millilitre au bout de 24 heures.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en environ deux heures pour la préparation des plaques, en moins d'une heure pour le transfert des cellules vers les plaques CARA, et en environ une à deux heures pour le développement et la mesure de la fluorescence des plaques CARA, si elle est effectuée correctement. Lors de l'exécution de cette procédure, il est important de se souvenir d'utiliser le CARA comme un test prédictif afin de déterminer si un composé possède une activité bactéricide ou bactériostatique contre les mycobactéries en cours de réplication ou non répliquantes. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la mise en place d'un CARA et de l'analyse des données d'une manière permettant de prédire le type d'activité d'un composé.

Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.