Visualisation de l'Agar Charcoal résazurine Essai pour semi-quantitative, Moyen-débit Enumération des mycobactéries

L’objectif global du CARA est de fournir une évaluation semi-quantitative à moyen débit de l’activité des composés contre les mycobactéries répliquantes et non répliquantes. Le principal avantage de cette technique est qu’en tant que substitut de l’UFC, le CARA permet de tester rapidement la dépendance dose-temps d’un composé. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la découverte de médicaments contre la tuberculose, telles que déterminer si un composé est bactériostatique ou bactéricide contre les bactéries répliquantes et s’il est bactéricide contre les bactéries non réplicatives.

La démonstration de la méthode sera assurée par Julia Roberts, associée dans notre laboratoire. Ajoutez 450 millilitres d’eau dans un bécher en verre d’un litre ou 900 millilitres d’eau dans un erlenmeyer de deux litres. Incluez une barre d’agitation autoclavable dans le bécher ou le flacon.

Ensuite, ajoutez une poudre Middlebrook 7H11, du charbon actif à une concentration finale de 0,4 % et une solution de glycérol à 50 % pour atteindre une concentration finale de 0,2 %. Couvrez l’ouverture de la fiole ou du bécher avec du papier d’aluminium et fixez-le au verre avec du ruban adhésif autoclave. Après avoir autoclavé le fluide, refroidissez-le à environ 55 à 65 degrés Celsius sur une plaque d’agitation magnétique réglée à basse vitesse pour maintenir le charbon de bois en suspension.

Tout en travaillant de manière aseptique dans une hotte de biosécurité dotée d’une plaque d’agitation magnétique, retirez la feuille du milieu et ajoutez 100 ou 50 millilitres de supplément OADC dans le ballon de deux litres ou le bécher d’un litre respectivement et continuez à mélanger. À l’aide d’une pipette multicanaux avec huit ou 12 pointes filtrantes, remplissez une microplaque de 96 puits avec un puits de 200 microlitres de charbon de bois 7H11-OADC à partir du réservoir de réactif ou du bécher, en travaillant rapidement pour éviter la solidification de la gélose et la formation de bulles. Placez les piles de microplaques CARA dans des sacs en plastique refermables pour éviter qu’elles ne se dessèchent et rangez-les à quatre degrés Celsius.

Inoculer des tubes de centrifugation en polypropylène, à fond rond ou conique contenant respectivement quatre ou 20 millilitres de Middlebrook 7H9-ADN ou 7H9-OADC avec M. smegmatis à une DO 580 de 0,01 à 0,1. Incuber les cultures de M. smegmatis à 37 degrés Celsius et 20 % O2 en secouant, en étendant les cultures jusqu’à la phase mi-logarithmienne ou une OD580 approximative de 0,5. Pour mettre en place une expérience de type concentration inhibitrice minimale dans des conditions de réplication et de non-réplication, distribuez 200 microlitres de cellules en 7H9-ADN à une DO 580 de 0,01 dans tous les puits d’une plaque de 96 puits à fond clair, traitée par culture tissulaire.

Pour le test non réplicatif, utilisez du PBS contenant 0,02 % de tyloxapol pour laver les cellules deux fois. Et utilisez un milieu non réplicatif pour remettre les cellules en suspension. Utilisez un milieu non réplicatif pour diluer les cellules à une OD580 de 0,1 et ajoutez du nitrate de sodium à une concentration finale de 0,5 à 5 millimolaires à partir d’un stock molaire fraîchement préparé.

Distribuez 200 microlitres de cellules à une OD580 de 0,1 dans tous les puits d’une plaque à 96 puits à fond clair, traitée par culture tissulaire. Après avoir préparé les agents d’essai selon le protocole textuel, ajoutez deux microlitres d’agent d’essai dans les rangées A à E et deux microlitres d’agent d’essai deux dans les rangées E à H, et mélangez soigneusement. Pour reproduire les essais, incuber des microplaques de M. smegmatis à 37 degrés Celsius, 20 % O2 et 5 % CO2 pendant une à 48 heures.

Aux moments où le CARA sera utilisé comme lecture, utilisez une pipette multicanaux p200 réglée à 50 à 75 microlitres pour remettre soigneusement en suspension le contenu du puits de la plaque de test de type MIC90 en pipetant vers le haut et vers le bas cinq à 10 fois. Utilisez ensuite les pointes de pipette pour faire tourbillonner doucement le contenu des puits dans un mouvement circulaire. Transférez 10 microlitres du contenu du puits d’analyse non dilué dans les puits correspondants de la microplaque CARA, en évitant les éclaboussures pendant les transferts, en veillant à ce que l’aliquote de 10 microlitres soit repérée au milieu des puits de microplaques CARA.

À l’aide de ruban adhésif, liez des piles de microplaques CARA, puis placez-les dans un sac en plastique refermable. Incuber les microplaques CARA de M. smegmatis à 37 degrés Celsius avec 20 % d’O2 pendant un à deux jours pour les plaques répliquantes et pendant deux à trois jours pour les plaques non réplicatives. Lorsqu’un film de croissance bactérienne ou des colonies macroscopiques plus grandes sont visibles dans les puits de contrôle négatif, utilisez un seul ensemble de 12 pointes p200 avec une pipette multicanaux pour distribuer 40 microlitres de PBS stérile le long du côté des puits et permettre au PBS de se répartir sur le dessus des microcolonies de gélose/bactéries.

Préparez le réactif de développement CARA en mélangeant cinq milligrammes de résazurine et 50 millilitres de 5 % de Tween80 dans du PBS. Ajoutez 50 microlitres de réactif de développement CARA fraîchement préparé dans chaque puits de la microplaque CARA. Ensuite, balancez les plaques d’avant en arrière plusieurs fois pour aider à répartir le réactif sur la gélose et le tapis bactérien dans chaque puits.

Placez les plaques dans un sac en plastique refermable et incubez à 37 degrés Celsius pendant au moins 30 minutes pour M. smegmatis. Avant de lire la fluorescence, placez les microplaques CARA dans une hotte de biosécurité pendant 15 minutes à température ambiante avec les couvercles retirés. Lorsque vous utilisez des spectrophotomètres BSL3 à l’extérieur d’une enceinte de biosécurité, collez un autocollant PCR de qualité optique sur la plaque et utilisez une serviette en papier doux pour bien sceller en appuyant doucement sur la surface de l’autocollant.

Déterminer la fluorescence par lecture supérieure avec excitation à 530 nanomètres et émission à 590 nanomètres. Il n’est pas nécessaire de blanchir la plaque. Pour analyser les données, tracez la concentration de l’inhibiteur sur l’axe des X sur une échelle log10 et la fluorescence sur l’axe des Y sur une échelle linéaire.

Pour plus de détails, reportez-vous au protocole texte. La concentration de l’agent d’essai qui empêche la fluorescence CARA d’augmenter au-dessus des niveaux de fond est le CARA-MBC supérieur à 99 qui est illustré ici. L’indice grand supérieur à 99 indique que le CARA-MBC fournit une concentration estimée de l’agent d’essai, ce qui donne lieu à une destruction bactérienne supérieure à deux log10.

Les composés sont soupçonnés d’exercer un effet post-antibiotique s’ils présentent une fenêtre statique, définie comme un décalage supérieur à quatre fois vers la droite entre les courbes CMI et CARA. La fenêtre statique indique qu’une molécule active contre la réplication de M. tuberculosis peut être bactériostatique au lieu d’être bactéricide. Pour les molécules ayant un puissant effet post-antibiotique, les fenêtres statiques peuvent être difficiles à observer et elles ne sont apparentes qu’après l’inspection d’un axe Y élargi pour la fluorescence CARA, comme on le voit ici.

Les molécules actives réplicatives et non réplicatives testées par MIC90 et CARA sont présentées ici. Bien que l’isoniazide et le linézolide semblent avoir une activité contre les bactéries non répliquantes selon le test MIC90, le CARA suggère qu’ils sont inactifs dans les conditions non réplicatives testées. Dans cette expérience CARA, l’exposition de M. smegmatis à des concentrations croissantes de rifampicine a révélé un impact en aussi peu qu’une heure et a montré une activité bactéricide croissante entre trois et 24 heures, tuant plus de deux à trois log10 à environ 10 microgrammes par millilitre pendant 24 heures.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en environ deux heures pour préparer les plaques, en moins d’une heure pour transférer les cellules sur les plaques CARA, et en environ une à deux heures pour développer et mesurer la fluorescence des plaques CARA si elle est effectuée correctement. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler d’utiliser le CARA comme test prédictif pour déterminer si un composé a une activité bactéricide ou bactériostatique contre les mycobactéries qui se répliquent ou non. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de configurer un CARA et d’analyser les données de manière à aider à prédire le type d’activité d’un composé.

Merci d’avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.