Name: LED Thermo Flow - Optogenetics Combinant avec cytométrie de flux (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-30T12:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 49 s
Description: Découvrez une méthode innovante d'optogénétique combinée à la cytométrie de flux pour étudier en temps réel les voies de signalisation cellulaire. Cette technique permet la caractérisation d'outils optogénétiques avec des lymphocytes B Ramos.

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Nous remercions J. Schmidt de l’Université de Fribourg pour la construction de l’appareil. Nous remercions P. Nielsen et D. Medgyesi pour leur soutien et leur lecture critique de ce manuscrit. Cette étude a été soutenue par la Deutsche Forschungsgemeinschaft par le biais de SFB746 et par l’Initiative d’excellence de la Fondation allemande pour la recherche (GSC-4, Spemann Graduate School).

1. Conception et création de l&#39;appareil <ol><li> Des expériences pilotes NOTE: L&#39;intensité lumineuse nécessaire pour un outil et une cellule optogenetic type spécifique peut varier de façon significative. Des expériences pilotes avec des prototypes sont utiles pour estimer l&#39;intensité de la lumière minimale nécessaire. L&#39;outil optogenetic utilisé pour les expériences suivantes est une construction de fusion Dronpa-Lieur-Dronpa. La séquence Dronpa a été obtenu dans le commerce (voir la liste des matériaux). Une longue liaison a été clone entre les deux séquences Dronpa pour permettre la construction exprimée pour former des dimères intramoléculaires (et intermoléculaires). Les étapes décrites ci-dessous peuvent être adaptées à de nombreux autres outils optogénétiques ou des substances optiquement contrôlées. <ol><li> Transduction des lymphocytes B Ramos avec un contenant construction Dronpa-Linker-Dronpa suivant les instructions du fabricant pour la transduction en utilisant le surnageant retroviral contenant des cellules d&#39;emballage. La récolte et des cellules de comptage en fonction d&#39;un prédemment publié le protocole 13. </li><li> Resuspendre les cellules à une concentration de 1 x 10 6 / ml dans du milieu (RPMI 1640, 10% de FCS, 2 mM de L-glutamine inactivé par la chaleur, 100 U / ml de pénicilline, 100 U / ml de streptomycine et 50 pM de 2-mercaptoéthanol) et les transférer dans un tube FACS de verre. </li><li> Insérer le tube dans un cytomètre de flux et de mesurer l&#39;intensité de fluorescence de Dronpa (canal de GFP) 14,15. </li><li> Porter des lunettes de protection pour toutes les autres mesures pour protéger les yeux des longueurs d&#39;onde éventuellement dommageables. </li><li> Placer manuellement un éclairage à LED 500 nm à l&#39;extérieur du tube et continuer à mesurer l&#39;intensité de fluorescence de Dronpa. </li><li> Augmenter le nombre et / ou l&#39;intensité des lumières LED jusqu&#39;à Dronpa intensité de fluorescence diminue. </li><li> Placer manuellement un éclairage à LED 400 nm à l&#39;extérieur du tube et continuer à mesurer l&#39;intensité de fluorescence de Dronpa. </li><li> Augmenter le nombre et / ou l&#39;intensité des lumières LED jusqu&#39;à ce que le fluo Dronparescence intensité augmente. </li><li> Utilisez au moins autant de lumières LED pour la construction de l&#39;appareil comme prévu nécessaire du photocommutation dans les étapes 1.1.5 et 1.1.7. </li></ol></li><li> Construire le dispositif REMARQUE: L&#39;appareil a été construit par un atelier d&#39;usinage professionnel, le Arbeitsgruppe Technik de l&#39;Université de Fribourg. La plupart des pièces sont fabriquées sur mesure et non disponibles dans le commerce. Les dimensions exactes de chaque pièce sont représentés sur les figures 1 et 2. Pour clarifier l&#39;ensemble de ce dispositif, complémentaire vidéo 1 est fourni et les étapes les plus essentielles sont décrites ci-dessous. <ol><li> Un broyeur pièce à partir de chlorure de polyvinyle (PVC) , avec les dimensions exactes représentées sur la figure 1A. </li><li> Insérez les lumières LED dans les trous percés de la pièce A et sceller chaque trou avec de la colle PVC pour éviter les fuites d&#39;eau. </li><li> Connecter les LED à un transformateur multicanal (chaque longueur d&#39;onde doit occuper une chann séparéeel) avec une puissance de sortie réglable 0-29 mA. </li><li> Fixer la gaine extérieure (B) avec 3 vis à la pièce A comme représenté pour protéger les LED contre les dommages physiques. </li><li> Pour être en mesure de connecter l&#39;appareil à une pompe à eau, de la colle dans les colliers de serrage (C) dans les trous forés de la pièce A (représentée sur la figure 1a, section transversale Y: 9 mm et 61,5 mm) à l&#39; aide de la colle PVC. </li><li> Coupez un long tube en plexiglas de 58,5 mm (D1). </li><li> Fabriquer des pièces D2 et D3 à partir de Plexiglas comme cela est représenté sur la figure 2. </li><li> Pièce de colle D3 au fond de D1 en Plexiglas avec de la colle. </li><li> Fixer un joint torique en caoutchouc pour pièce D2 et il colle à la partie supérieure de D1 avec Plexiglas colle. NOTE: Les pièces D1, D2 et D3 forment ensemble pièce D. </li><li> Insérez la pièce D dans la pièce A avec 3 vis. </li><li> Testez le dispositif de fuite d&#39;eau avant la mise sous tension du transformateur. </li></ol></li></ol> 2. Mesurer la cinétique d&#39;un outil optogénétiques <ol&gt; <li> préparer des cellules <ol><li> La culture de cellules B Ramos dans le milieu RPMI (RPMI 1640, 10% de FCS, 2 mM de L-glutamine inactivé par la chaleur, 100 U / ml de pénicilline, 100 U / ml de streptomycine et 50 pM de 2-mercaptoéthanol) à une densité de 3- 10 x 10 6 cellules / mL à 37 ° C et 5% de CO 2. </li><li> la récolte des cellules B Ramos par centrifugation à 350 x g et 4 ° C pendant 5 min. </li><li> Nombre de cellules en utilisant une chambre de comptage de Neubauer en suivant les instructions du fabricant et resuspendre 1-5 x 10 6 cellules dans 600 ul de milieu. </li><li> Transférer les cellules dans un tube de FACS de verre, mettez-les sur de la glace et de les protéger de la lumière jusqu&#39;à la mesure. </li></ol></li><li> Préparer le cytomètre de flux et le dispositif. <ol><li> Connectez l&#39;appareil à une pompe à eau chauffée et régler la température à 37 ° C. </li><li> Lors de l&#39;utilisation des tubes FACS de verre, échanger le joint torique noir de la cytométrie de flux avec un joint torique en caoutchouc et appliquer en plus gr de siliciumfacilité. </li></ol></li><li> La mesure <ol><li> Insérez soigneusement le verre FACS tube dans le dispositif et le connecter à la cytométrie de flux (Figure 3). </li><li> Lancer la mesure et enregistrer Dronpa intensité de fluorescence (canal GFP). </li><li> Illuminez l&#39;échantillon de cellules avec 400 nm ou 500 nm de lumière, respectivement, et enregistrer l&#39;intensité de fluorescence Dronpa (canal GFP). </li></ol></li><li> L&#39;analyse des données <ol><li> Analyser les données expérimentales avec un débit approprié cytomètre logiciel. Plot diffusion vers l&#39;avant contre la dispersion et la porte latéralement les cellules vivantes. Tracer l&#39;intensité de fluorescence Dronpa au fil du temps. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Dugue, G. P., Akemann, W., Knopfel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+concept+of+optogenetics%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">A comprehensive concept of optogenetics.</a> Prog Brain Res. 196, 1-28 (2012).</li>
<li>Tischer, D., Weiner, O. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Illuminating+cell+signalling+with+optogenetic+tools%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Illuminating cell signalling with optogenetic tools.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (8), 551-558 (2014).</li>
<li>Toettcher, J. E., Voigt, C. A., Weiner, O. D., Lim, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+promise+of+optogenetics+in+cell+biology%3A+interrogating+molecular+circuits+in+space+and+time%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">The promise of optogenetics in cell biology: interrogating molecular circuits in space and time.</a> Nat Methods. 8 (1), 35-38 (2011).</li>
<li>Zhang, K., Cui, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+control+of+intracellular+signaling+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Optogenetic control of intracellular signaling pathways.</a> Trends Biotechnol. 33 (2), 92-100 (2015).</li>
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<li>Bugaj, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+endogenous+transmembrane+receptors+through+optogenetic+Cry2+clustering%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Regulation of endogenous transmembrane receptors through optogenetic Cry2 clustering.</a> Nat Commun. 6, 6898(2015).</li>
<li>Strickland, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TULIPs%3A+tunable%2C+light-controlled+interacting+protein+tags+for+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">TULIPs: tunable, light-controlled interacting protein tags for cell biology.</a> Nat Methods. 9 (4), 379-384 (2012).</li>
<li>Taslimi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+optogenetic+clustering+tool+for+probing+protein+interaction+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">An optimized optogenetic clustering tool for probing protein interaction and function.</a> Nat Commun. 5, 4925(2014).</li>
<li>Toettcher, J. E., Gong, D., Lim, W. A., Weiner, O. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-based+feedback+for+controlling+intracellular+signaling+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Light-based feedback for controlling intracellular signaling dynamics.</a> Nat Methods. 8 (10), 837-839 (2011).</li>
<li>Toettcher, J. E., Weiner, O. D., Lim, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+optogenetics+to+interrogate+the+dynamic+control+of+signal+transmission+by+the+Ras%2FErk+module%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Using optogenetics to interrogate the dynamic control of signal transmission by the Ras/Erk module.</a> Cell. 155 (6), 1422-1434 (2013).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utilization+of+a+photoactivatable+antigen+system+to+examine+B-cell+probing+termination+and+the+B-cell+receptor+sorting+mechanisms+during+B-cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Utilization of a photoactivatable antigen system to examine B-cell probing termination and the B-cell receptor sorting mechanisms during B-cell activation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (5), E558-E567 (2016).</li>
<li>Wend, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+control+of+protein+kinase+activity+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synth+Biol%22%5BJournal%5D)">Optogenetic control of protein kinase activity in mammalian cells.</a> ACS Synth Biol. 3 (5), 280-285 (2014).</li>
<li>Zhou, X. X., Chung, H. K., Lam, A. J., Lin, M. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+control+of+protein+activity+by+fluorescent+protein+domains%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Optical control of protein activity by fluorescent protein domains.</a> Science. 338 (6108), 810-814 (2012).</li>
<li>Baumgarth, N., Roederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+approach+to+multicolor+flow+cytometry+for+immunophenotyping%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">A practical approach to multicolor flow cytometry for immunophenotyping.</a> J Immunol Methods. 243 (1-2), 77-97 (2000).</li>
<li>Givan, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry%3A+an+introduction%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry: an introduction.</a> Methods Mol Biol. 699, 1-29 (2011).</li>
<li>Brakemann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+reversibly+photoswitchable+GFP-like+protein+with+fluorescence+excitation+decoupled+from+switching%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A reversibly photoswitchable GFP-like protein with fluorescence excitation decoupled from switching.</a> Nat Biotechnol. 29 (10), 942-947 (2011).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Le Thermo flux LED est un dispositif innovant pour étudier les outils optogénétiques dans un cytomètre de flux. Jusqu&#39;à présent, les échantillons optogénétiques ont été illuminée seulement avec des lasers de microscopie ou des dispositifs de lampe de poche 11,12. En fonction de l&#39;angle et la distance de la lampe torche à l&#39;échantillon, la variabilité importante de la quantité d&#39;éclairement est prévu entre les expériences. En outre, il y a une limite au nombre de la...

Outils optogénétiques ont gagné en popularité, en partie parce qu&#39;ils peuvent être utilisés pour déchiffrer le câblage des voies de signalisation 1-4. Ils sont basés sur la capacité des protéines photoactivables pour changer leur conformation et l&#39;affinité de liaison lorsqu&#39;il est éclairé par la lumière. Fusionnant ces protéines à des éléments de signalisation permet la régulation spécifique d&#39;un seul joueur dans complexes voies de signalisation intracellulaires 5-12. Par conséquent, une voie de signalisation peut être étudiée avec une résolution spatiale et temporelle élevée. La plupart des études basées sur des cellules optogénétiques utilisent des méthodes basées sur la microscopie, combinée à la culture en présence de lumière, suivie par l&#39; analyse biochimique 11,12. En revanche, un flux singularise cytomètre de cellules le long d&#39;un capillaire et mesure la taille de la cellule, la granularité et l&#39;intensité de fluorescence. Cette méthode présente des avantages majeurs sur la microscopie ou biochimiques méthodes, y compris la capacité d&#39;analyser thousands de cellules à une résolution unique cellule vivante dans un temps très court. Par conséquent, il est souhaitable de combiner avec optogénétique cytométrie de flux. À notre connaissance, il n&#39;y a pas de protocole établi pour cytométrie de flux optogenetic. Une méthode largement acceptée consiste à éclairer manuellement les cellules à l&#39;extérieur du tube de réaction avec des dispositifs d&#39;affichage lumineux. Cependant, l&#39;éclairage manuel du débit nécessite cytomètre la lumière de passer à travers le tube de réaction et, pour l&#39;imagerie des cellules vivantes, une forme cylindrique, chambre d&#39;eau chauffée. Cela provoque la diffusion de lumière importante et la perte de lumière. En outre, l&#39;intensité de la lumière fournie par un éclairage manuel est pas reproductible entre les expériences (angle, distance, etc.) et il y a une limite pratique au nombre de longueurs d&#39;onde dans une expérience. En construisant le dispositif LED Thermo Flow, nous avons pu surmonter ces limitations. Avec ce dispositif, les cellules peuvent être éclairées par des longueurs d&#39;onde spécifiques dans une températurelit- contrôlée de manière pendant les mesures de cytométrie en flux. Cela permet des quantités précises et reproductibles de la lumière à l&#39;intérieur et entre les expériences. Pour démontrer l&#39;utilité de notre dispositif in vivo, nous avons enregistré le signal de fluorescence de Dronpa dans les cellules B Ramos pendant photocommutation. les cellules B Ramos sont dérivées d&#39;un lymphome de Burkitt humain. Dronpa est une protéine fluorescente qui existe sous forme d&#39;un monomère, dimère ou un tétramère. Dans sa forme monomère, il est non-fluorescent. Illumination avec 400 nm de lumière induit dimérisation et tétramérisation et rend la protéine fluorescente Dronpa. Ce processus peut être inversé par illumination avec 500 nm de lumière. La protéine Dronpa a été utilisé pour contrôler la fonction et la localisation des protéines de signalisation 4,13. Ici, nous avons exprimé une protéine Dronpa-Linker-Dronpa dans les cellules B Ramos pour étudier photocommutation de Dronpa dans un cytomètre de flux. En utilisant notre dispositif, nous avons pu efficacement etPHOTOSWITCH reproductible Dronpa lors de l&#39;enregistrement de son intensité de fluorescence en temps réel. Cette méthode offre des avantages substantiels par rapport aux protocoles d&#39;éclairage actuels avec éclairage manuel et élargit considérablement le répertoire expérimental pour les outils optogénétiques et des composés de la cage. Grâce à notre dispositif simplifiera considérablement et d&#39;accélérer la découverte et le développement de nouveaux outils de optogénétiques.

<table><tbody><tr><td>Tube en verre FACS</td><td>Thermo Fisher Scientific ; Waltham, États-Unis</td><td>14-961-26</td><td>Tubes en verre borosilicaté 12x75 mm</td></tr><tr><td>Cytomètre</td><td>en flux BD Bioscienceg ; Heidelberg, Allemagne</td><td>Fortessa II</td><td>Commande spéciale</td></tr><tr><td>Dronpa : pcDNA3-mNeptune2-N</td><td>Addgene ; Cambridge, États-Unis</td><td>41645</td><td></td></tr><tr><td>PolyJet</td><td>SignaGen, Rockville, États-Unis</td><td>SL100688</td><td></td></tr><tr><td>LED 505 nm</td><td>Avago Technologies ; Boeblingen, Allemagne</td><td>HLMP-CE34-Y1CDD</td><td></td></tr><tr><td>LED 400 nm</td><td>Avago Technologies ; Boeblingen, Allemagne</td><td>UV5TZ-400-15</td><td></td></tr><tr><td>Tube plexiglas 15 mm</td><td>Maertin ; Fribourg, Allemagne</td><td>76999</td><td></td></tr><tr><td>Plexiglas 3 mm</td><td>Maertin ; Fribourg, Allemagne</td><td>692230</td><td></td></tr><tr><td>Plexiglas 2,5 mm</td><td>Maertin ; Fribourg, Allemagne</td><td>692225</td><td></td></tr><tr><td>Plexiglas 1,5 mm</td><td>Maertin ; Fribourg, Allemagne</td><td>692215</td><td></td></tr><tr><td>dalle PVC 5 mm</td><td>Maertin ; Fribourg, Allemagne</td><td>690020.005</td><td></td></tr><tr><td>Dalle PVC 6 mm</td><td>Maertin ; Fribourg, Allemagne</td><td>690020.006</td><td></td></tr><tr><td>Bloc PVC 50 mm</td><td>Maertin ; Fribourg, Allemagne</td><td>690020.050</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Invitrogen, Life Technologies ; Darmstadt, Allemagne</td><td>61870-010</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>EMD ; Allemagne</td><td>805740</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>PAN Biotech ; Aidenbach, Allemagne</td><td>P30-3302</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline/Strptomycine (10 000 U/mL)</td><td>Invitrogen, Life Technologies ; Darmstadt, Allemagne</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Colle plexiglas Acrifix</td><td>Evonic industries, Essen, Allemagne</td><td>1R0192</td><td></td></tr><tr><td>Tangit Colle PVC-U</td><td>Henkel, D&uuml ; sseldorf, Allemagne</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

led thermo flow - optogenetics combinant avec cytométrie de flux

LED Thermo Flow &#8212; Combining Optogenetics with Flow Cytometry

Les outils optogénétiques permettent des investigations fonctionnelles isolées de presque toutes les molécules de signalisation dans des voies de signalisation complexes. Un obstacle majeur est l’apport contrôlé de lumière à l’échantillon cellulaire et, par conséquent, les outils les plus populaires pour les études optogénétiques sont les analyses cellulaires basées sur la microscopie et les expériences in vitro. Le cytomètre en flux présente des avantages majeurs par rapport à un microscope, notamment la capacité de mesurer rapidement des milliers de cellules à une résolution de cellule unique. Cependant, il n’est pas encore largement utilisé en optogénétique. Nous vous présentons ici un appareil qui combine la puissance de l’optogénétique et de la cytométrie en flux : la LED Thermo Flow. Cet appareil éclaire les cellules à des longueurs d’onde, des intensités lumineuses et des températures spécifiques lors de mesures cytométriques en flux. Il peut être construit à faible coût et être utilisé avec les cytomètres en flux les plus courants. Pour démontrer son utilité, nous avons caractérisé la cinétique de photocommutation des protéines Dronpa in vivo et en temps réel. Ce protocole peut être adapté à presque toutes les substances optiquement contrôlées et élargit considérablement l’ensemble des expériences possibles. Plus important encore, il simplifiera considérablement la découverte et le développement de nouveaux outils optogénétiques.

Utilisation de la Thermo flux LED avec un cytomètre de flux Le noyau fonctionnel du dispositif est une chambre cylindrique dans laquelle les lumières LED sont disposées de manière circulaire pointant vers l'intérieur. Cette chambre peut être reliée à une alimentation et une pompe d'eau, ce qui permet de contrôler la température des diodes électroluminescentes, ainsi que de l'échantillon de cellules. Les DEL sont connectées à un ...

Les substances optiquement contrôlées sont des outils puissants pour étudier les voies de signalisation. Pour élargir le spectre des expériences possibles, nous avons développé un appareil permettant d’étudier en temps réel des substances optiquement contrôlées à l’aide de la cytométrie en flux : la LED Thermo Flow.

LED Thermo Flow - Optogenetics Combinant avec cytométrie de flux

Optogenetic tools allow isolated, functional investigations of almost any signaling molecule within complex signaling pathways. A major obstacle is the ...

L’objectif global de cette méthode est de stimuler des substances optiquement contrôlées lors de mesures cytométriques en flux. Ce nouveau dispositif peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la signalisation cellulaire en combinant la puissance des substances contrôlées optiquement avec la cytométrie en flux. Pour la première fois, les outils optogénétiques peuvent être caractérisés et analysés à l’aide de la cytométrie en flux.Aucune méthode comparable n’existait jusqu’à aujourd’hui. Pour commencer, suspendez les lymphocytes Ramos B transduits à une concentration d’un million de cellules par millilitre et transférez-les dans un tube FACS en verre. Ensuite, remplacez le joint torique noir du cytomètre en flux par un joint torique en caoutchouc et appliquez de la graisse silicone pour créer une meilleure étanchéité.Insérez le tube de verre dans un cytomètre en flux et placez le prototype de LED autour du tube avec les lumières éteintes. Mesurez l’intensité de fluorescence de Dronpa dans le canal GFP. L’étape la plus critique de la procédure est la manipulation des tubes en verre.Les tubes FACS en verre sont très fragiles et, par conséquent, il est recommandé de pratiquer l’insertion des tubes en verre dans le cytomètre avant de faire des expériences. Ensuite, allumez la lumière LED de 500 nanomètres à l’extérieur du tube et continuez à mesurer l’intensité de fluorescence de Dronpa. Augmentez l’intensité des lumières LED jusqu’à ce que l’intensité de fluorescence de Dronpa diminue, afin d’estimer l’intensité lumineuse minimale nécessaire, afin de mesurer la photocommutation de la protéine Dronpa-Linker-Dronpa.Ensuite, allumez la lumière LED de 400 nanomètres du prototype à l’extérieur du tube et continuez à mesurer l’intensité de fluorescence de Dronpa. Augmentez l’intensité lumineuse des lumières LED de 400 nanomètres jusqu’à ce que l’intensité de fluorescence de Dronpa augmente. Commencez par suivre les instructions de conception et de fabrication dans le protocole de texte d’accompagnement pour fabriquer les couches intérieures et extérieures du dispositif LED de photocommutation.Insérez les LED de longueur d’onde de 400 et 500 nanomètres dans les canaux de l’appareil. Collez-les en place et câblez-les comme indiqué. Ces longueurs d’onde spécifiques seront utilisées pour commuter les protéines de fusion Dronpa-Linker-Dronpa entre leurs états sombres et lumineux.Ensuite, assemblez l’appareil et assurez-vous qu’il est étanche afin d’éviter les fuites avant d’allumer le transformateur. Après l’assemblage du dispositif, récoltez les lymphocytes Ramos B et mettez-les en suspension dans une densité de trois à dix millions de cellules par millilitre. Transférez 600 microlitres de cellules dans un tube en verre FACS.Placez-les sur de la glace et protégez les cellules de la lumière jusqu’à ce qu’elles soient mesurées. Connectez l’appareil assemblé à une pompe à eau chauffée et ajustez la température à 37 degrés Celsius. Ensuite, insérez soigneusement le tube FACS en verre dans l’appareil et connectez-le au cytomètre en flux.Enregistrez l’intensité de la fluorescence Dronpa dans le canal GFP. La conception de ces dispositifs optogénétiques comprend une chambre qui peut être connectée à une alimentation en eau circulante pour maintenir la température de l’échantillon à une valeur constante. Alors que l’appareil émettait trois longueurs d’onde différentes, seule une augmentation marginale de la température a été observée dans l’échantillon FACS, lors de l’écoulement d’eau à 37 degrés Celsius à travers l’appareil.La construction de fusion Dronpa-Linker-Dronpa a été clonée et transduite dans les cellules B de Ramos. Lorsqu’elle est dirigée vers l’état monomère par une source lumineuse de 500 nanomètres, l’intensité de l’émission diminue. Ensuite, une fois que la source lumineuse est commutée sur la lumière de 400 nanomètres, le monomère Dronpa est rapidement transformé en état dimère, et l’intensité augmente rapidement.À l’aide de ce dispositif, la protéine de fusion cytosolique Dronpa-Linker-Dronpa a pu être photocommutée plusieurs fois. Le passage à l’état sombre se fait lentement, tandis que le passage à l’état lumineux se fait presque instantanément. La récupération spontanée de la fluorescence de Dronpa dans l’obscurité montre qu’une photocommutation efficace vers la forme brillante nécessite un éclairage spécifique et ne se produit que lentement et spontanément.L’analyse cinétique montre que la vitesse de photocommutation est globalement très reproductible et que même après une longue incubation dans l’obscurité, seulement environ dix pour cent de la fluorescence est récupérée sans photocommutation. À la suite de cette procédure, toute analyse cytométrique en flux, y compris les mesures de flux calcique, peut être effectuée afin d’explorer la fonctionnalité de l’outil optogénétique que vous avez choisi. Après son développement, cette technique ouvrira la voie aux chercheurs dans le domaine de l’optogénétique pour explorer le câblage des voies de signalisation cellulaire.Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’établir un protocole de photocommutation pour votre outil optogénétique spécifique. N’oubliez pas que la lumière UV peut être extrêmement dangereuse et que des précautions, telles que des lunettes de protection, doivent toujours être portées lors de cette procédure.

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Cette vidéo présente un test de cytométrie en flux permettant de quantifier les niveaux de ROS dans des organoïdes intestinaux 3D obtenus à partir de souris transgéniques exprimant la GFP. Cette méthode fournit un modèle expérimental in vitro pour étudier l’efficacité des composés testés sur la production de ROS.

Dosage par cytométrie en flux pour quantifier le stress oxydatif : un dosage pour quantifier les espèces réactives de l’oxygène dans les organoïdes intestinaux à l’aide de sondes fluorogènes

Cette vidéo montre la cytométrie en flux pour mesurer l’absorption microgliale de bioparticules fluorescentes après administration intravitréenne dans un œil de souris. La cytométrie en flux détecte les cellules vivantes exprimant CD11b et distingue les cellules microgliales phagocytaires présentant une fluorescence verte des autres cellules myéloïdes, y compris les monocytes exprimant Ly6C et les neutrophiles exprimant Ly6G.

Mesure de l’absorption microgliale de particules fluorescentes administrées par voie intravitréenne à l’aide de la cytométrie en flux

La vidéo fait la démonstration d’un test de cytométrie en flux par transfert d’énergie par résonance de fluorescence (FRET) pour détecter l’activité d’ensemencement d’agrégats de protéines isolés d’échantillons biologiques. Les cellules de mammifères exprimant des protéines rapporteures tau sont incubées avec des complexes de transduction de liposomes contenant des graines de tau. Ces graines médient l’agrégation des protéines rapporteures, ce qui conduit à la génération d’un signal positif...

Technique de cytométrie en flux FRET pour détecter l’agrégation de protéines rapporteures induite par la graine de protéine tau

L'analyse par cytométrie de complémentation de fluorescence bimoléculaire fournit une méthode quantitative à haut débit pour étudier l'interaction protéine-protéine. Cette méthode peut être appliquée à des sites de liaison aux protéines de cartographie et de criblage de facteurs qui régulent l'interaction protéine-protéine.

L&#39;analyse par cytométrie de flux par fluorescence bimoléculaire complémentation: une méthode quantitative à haut débit pour étudier l&#39;interaction protéine-protéine

Nous présentons les méthodes pour étudier l'effet du PSM et d'autres toxines sécrétées...

L&#39;étude des interactions de<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; Avec des neutrophiles par cytométrie en flux et microscopie Time Lapse

Alors que les macrophages infiltrés sont continuellement recrutés sur les tissus adultes à partir de précurseurs circulants, les macrophages résidents sement leurs tissus pendant le développement, où ils sont maintenus sans autre contribution des progéniteurs. Les ancêtres des macrophages résidents ont récemment été identifiés. Ici, nous présentons des méthodes pour la cartographie du devenir génétique des progéniteurs résidents de macrophages.

Identification des progéniteurs érythromyélidiens et de leur descendance dans l&#39;embryon de souris par cytométrie de flux

Ce protocole décrit la mise en place d'un système de microscopie optique à étirage temporel de détection asymétrique pour l'imagerie monocellulaire dans un flux microfluidique ultra-rapide et ses applications dans la cytométrie de flux d'imagerie.

Cytométrie de flux d&#39;imagerie microfluidique par détection asymétrique Microscopie optique à temps-étirement (ATOM)

Nous présentons ici un protocole visant à analyser le transfert de cellule à cellule de renseignements oscillatoires par optogenetic contrôle et suivi de l’expression génique en direct. Cette approche constitue une plate-forme unique pour tester une importance fonctionnelle des programmes d’expression de gène dynamique dans les systèmes multicellulaires.

Une méthode Optogenetic pour contrôler et analyser les profils d’Expression génique dans les Interactions cellule-cellule

Nous présentons ici une méthode basée sur la cytométrie en flux pour la visualisation et la quantification de plusieurs marqueurs associés à la sénescence dans des cellules individuelles.

Imagerie simultanée et détection par cytométrie en flux de plusieurs marqueurs de sénescence fluorescents dans les cellules cancéreuses sénescentes induites par le traitement

La biochimie visuelle à molécule unique étudiée à travers des chambres microfluidiques est grandement facilitée à l’aide d’un baril en verre, de seringues étanches aux gaz, de connexions stables de tubes aux cellules d’écoulement et d’élimination des bulles en plaçant des vannes de commutation entre les seringues et les tubes. Le protocole décrit deux pièges optiques qui permettent de visualiser les transactions d’ADN et les interactions intermoléculaires.

Utilisation de pincettes optiques doubles et de microfluidique pour les études sur une seule molécule

Cette étude décrit une méthode pour des expériences à haut débit utilisant un réseau de LED imprimées en 3D pour optimiser l’expression génique inductible par la lumière dans HEK293T cellules.

Optimisation rapide d’un système inductible par la lumière pour contrôler l’expression génique de mammifères

Découvrez une méthode innovante d'optogénétique combinée à la cytométrie de flux pour étudier en temps réel les voies de signalisation cellulaire. Cette technique permet la caractérisation d'outils optogénétiques avec des lymphocytes B Ramos.

LED Thermo Flow - Optogenetics Combinant avec cytométrie de flux

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