LED Thermo Flow - Optogenetics Combinant avec cytométrie de flux

L’objectif global de cette méthode est de stimuler des substances optiquement contrôlées lors de mesures cytométriques en flux. Ce nouveau dispositif peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la signalisation cellulaire en combinant la puissance des substances contrôlées optiquement avec la cytométrie en flux. Pour la première fois, les outils optogénétiques peuvent être caractérisés et analysés à l’aide de la cytométrie en flux.

Aucune méthode comparable n’existait jusqu’à aujourd’hui. Pour commencer, suspendez les lymphocytes Ramos B transduits à une concentration d’un million de cellules par millilitre et transférez-les dans un tube FACS en verre. Ensuite, remplacez le joint torique noir du cytomètre en flux par un joint torique en caoutchouc et appliquez de la graisse silicone pour créer une meilleure étanchéité.

Insérez le tube de verre dans un cytomètre en flux et placez le prototype de LED autour du tube avec les lumières éteintes. Mesurez l’intensité de fluorescence de Dronpa dans le canal GFP. L’étape la plus critique de la procédure est la manipulation des tubes en verre.

tubes FACS en verre sont très fragiles et, par conséquent, il est recommandé de pratiquer l’insertion des tubes en verre dans le cytomètre avant de faire des expériences. Ensuite, allumez la lumière LED de 500 nanomètres à l’extérieur du tube et continuez à mesurer l’intensité de fluorescence de Dronpa. Augmentez l’intensité des lumières LED jusqu’à ce que l’intensité de fluorescence de Dronpa diminue, afin d’estimer l’intensité lumineuse minimale nécessaire, afin de mesurer la photocommutation de la protéine Dronpa-Linker-Dronpa.

Ensuite, allumez la lumière LED de 400 nanomètres du prototype à l’extérieur du tube et continuez à mesurer l’intensité de fluorescence de Dronpa. Augmentez l’intensité lumineuse des lumières LED de 400 nanomètres jusqu’à ce que l’intensité de fluorescence de Dronpa augmente. Commencez par suivre les instructions de conception et de fabrication dans le protocole de texte d’accompagnement pour fabriquer les couches intérieures et extérieures du dispositif LED de photocommutation.

Insérez les LED de longueur d’onde de 400 et 500 nanomètres dans les canaux de l’appareil. Collez-les en place et câblez-les comme indiqué. Ces longueurs d’onde spécifiques seront utilisées pour commuter les protéines de fusion Dronpa-Linker-Dronpa entre leurs états sombres et lumineux.

Ensuite, assemblez l’appareil et assurez-vous qu’il est étanche afin d’éviter les fuites avant d’allumer le transformateur. Après l’assemblage du dispositif, récoltez les lymphocytes Ramos B et mettez-les en suspension dans une densité de trois à dix millions de cellules par millilitre. Transférez 600 microlitres de cellules dans un tube en verre FACS.

Placez-les sur de la glace et protégez les cellules de la lumière jusqu’à ce qu’elles soient mesurées. Connectez l’appareil assemblé à une pompe à eau chauffée et ajustez la température à 37 degrés Celsius. Ensuite, insérez soigneusement le tube FACS en verre dans l’appareil et connectez-le au cytomètre en flux.

Enregistrez l’intensité de la fluorescence Dronpa dans le canal GFP. La conception de ces dispositifs optogénétiques comprend une chambre qui peut être connectée à une alimentation en eau circulante pour maintenir la température de l’échantillon à une valeur constante. Alors que l’appareil émettait trois longueurs d’onde différentes, seule une augmentation marginale de la température a été observée dans l’échantillon FACS, lors de l’écoulement d’eau à 37 degrés Celsius à travers l’appareil.

La construction de fusion Dronpa-Linker-Dronpa a été clonée et transduite dans les cellules B de Ramos. Lorsqu’elle est dirigée vers l’état monomère par une source lumineuse de 500 nanomètres, l’intensité de l’émission diminue. Ensuite, une fois que la source lumineuse est commutée sur la lumière de 400 nanomètres, le monomère Dronpa est rapidement transformé en état dimère, et l’intensité augmente rapidement.

À l’aide de ce dispositif, la protéine de fusion cytosolique Dronpa-Linker-Dronpa a pu être photocommutée plusieurs fois. Le passage à l’état sombre se fait lentement, tandis que le passage à l’état lumineux se fait presque instantanément. La récupération spontanée de la fluorescence de Dronpa dans l’obscurité montre qu’une photocommutation efficace vers la forme brillante nécessite un éclairage spécifique et ne se produit que lentement et spontanément.

L’analyse cinétique montre que la vitesse de photocommutation est globalement très reproductible et que même après une longue incubation dans l’obscurité, seulement environ dix pour cent de la fluorescence est récupérée sans photocommutation. À la suite de cette procédure, toute analyse cytométrique en flux, y compris les mesures de flux calcique, peut être effectuée afin d’explorer la fonctionnalité de l’outil optogénétique que vous avez choisi. Après son développement, cette technique ouvrira la voie aux chercheurs dans le domaine de l’optogénétique pour explorer le câblage des voies de signalisation cellulaire.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’établir un protocole de photocommutation pour votre outil optogénétique spécifique. N’oubliez pas que la lumière UV peut être extrêmement dangereuse et que des précautions, telles que des lunettes de protection, doivent toujours être portées lors de cette procédure.