Visualisation de l'IL-22 exprimant Lymphocytes en utilisant des souris Reporter

L’objectif global de cette procédure de modification génétique chez la souris est d’identifier, de purifier et de caractériser les cellules immunitaires productrices d’IL-22. Les cellules du système immunitaire libèrent des médiateurs appelés cytokines qui sont chargés de nous défendre contre les agents étrangers comme les bactéries et de restaurer les tissus endommagés. L’IL-22 est l’une de ces cytokines et s’est vu attribuer de nombreuses activités allant de la réparation tissulaire à la pathologie.

Et un certain nombre de types de cellules différents dans le système immunitaire ont été signalés comme étant capables de le produire. Donc, pour clarifier quelles cellules produisent réellement l’IL-22, nous avons développé une nouvelle souris rapporteure IL-22. Cela nous a permis d’identifier des producteurs d’IL-22 pertinents in vivo chez des souris dans des conditions normales et dans un modèle de maladie inflammatoire de l’intestin.

Nous avons également utilisé des cellules rapporteures pour purifier les expresseurs de l’IL-22 afin de déterminer leurs autres propriétés. La méthode de génération des souris rapporteures est brièvement décrite et les méthodes d’analyse sont décrites. Les méthodes décrites peuvent être appliquées à d’autres gènes dans le but d’identifier les exprimateurs et de purifier des cellules exprimant viables pour une caractérisation plus poussée.

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l’immunologie sur les activités biologiques de l’IL-22 et les propriétés des cellules qui la produisent. Julie Hixon, biologiste, Caroline Andrews, post-doctorante, et Wenqing Li, scientifique du laboratoire, feront la démonstration de la procédure avec moi. Après avoir inséré le gène rapporteur tdTomato dans un vecteur navette, en remplaçant le gène GFP dans le même site, utilisez le chromosome artificiel bactérien approprié ou la matrice BAC pour amplifier les boîtes d’homologie A et B du premier exon traduit de l’IL-22 dans un système de réaction PCR de 50 microlitres.

Transformez ensuite les vecteurs purifiés en cellules bactériennes compétentes BAC sur des plaques de gélose Luria-Bertani ou LB contenant du chloramphénicol et de l’ampicilline à 37 degrés Celsius. À la fin de l’incubation, inoculez deux à trois colonies dans un millilitre de bouillon LB, complété par du chloramphénicol à 37 degrés Celsius et 225 tr/min. Après une heure, étalez 100 microlitres de chaque mélange sur une plaque de gélose LB complétée par du chloramphénicol et du saccharose pour une culture de nuit à 37 degrés Celsius.

Le lendemain matin, replaquez les grandes colonies sur une nouvelle plaque de gélose LB avec du chloramphénicol et les petites colonies sur une autre plaque de gélose LB et exposez les plaques à la lumière UV pendant 30 secondes. Sélectionnez ensuite une colonie sensible aux UV et utilisez une amorce hétérozygote tdTomato IL-22 pour confirmer la présence de l’ADN BAC modifié par PCR. Après avoir enlevé la rate et le thymus, utilisez une pince à dissection dentelée à pointe fine pour prélever les ganglions lymphatiques mésentériques blanc nacré près de la paroi de l’intestin grêle.

Ensuite, retirez tout l’intestin grêle et le côlon et utilisez des ciseaux pour extraire les plaques de Peyer ovales étendues le long de l’intestin. Lorsque tous les tissus lymphatiques ont été prélevés, broyez les ganglions lymphatiques mésentériques et les plaques de Peyer ensemble entre deux lames givrées dans PBS complétées par FBS sur glace. Après avoir généré des suspensions individuelles de cellules uniques de la rate et du thymus de la même manière, la centrifugeuse des cellules de la rate a suivi la lyse des globules rouges spléniques avec un millilitre de tampons de lyse ACK de la rate.

Au bout d’une minute, rétablissez l’isotonicité avec neuf millilitres de PBS et centrifugez à nouveau les cellules. Remettez la pastille en suspension dans cinq millilitres de PBS et filtrez les cellules à travers une passoire de cellules de 100 microns. Ensuite, collectez les cellules par une autre centrifugation, en remettant la pastille en suspension dans cinq millilitres de milieu RPI pour le dénombrement par exclusion du bleu de trypan.

Après avoir prélevé l’intestin grêle du duodénum à l’iléon ainsi que l’ensemble du côlon, utilisez une pince pour retirer le tissu adipeux et mésentérique supplémentaire de l’intestin et placez immédiatement le tissu intestinal dans du PBS glacé. À l’aide d’une pince, prélevez les plaques de Peyer le long de la région distale de l’intestin grêle. Ensuite, utilisez des ciseaux pour ouvrir l’intestin dans le sens de la longueur et rincez soigneusement le tissu avec 10 millilitres de PBS glacé.

Transférez l’échantillon dans 20 millilitres de tampon de prédigestion pour deux incubations de 30 minutes à 37 degrés Celsius et 50 tr/min dans un agitateur, en faisant tourbillonner le tissu pendant 30 secondes à 12 000 tr/min et en pressant tous les fragments à travers une passoire cellulaire de 100 microns à la fin de chaque incubation pour recueillir la couche de cellules épithéliales. Ensuite, ajoutez 20 millilitres de solution EDTA fraîche à la suspension cellulaire pour une autre incubation de 30 minutes avec agitation à 37 degrés Celsius, en filtrant et en refroidissant les cellules épithéliales intestinales à la fin de l’incubation, comme nous venons de le démontrer. Placez les fragments d’intestin restants sur de la glace et collectez les cellules épithéliales intestinales regroupées par centrifugation, suivie d’un lavage dans 10 millilitres de HBSS complété par FBS.

Remettez en suspension la pastille lavée dans huit millilitres de milieu de silice colloïdale à 44 % et recouvrez la suspension cellulaire avec cinq millilitres de milieu de silice colloïdale à 67 %. Séparez les cellules par centrifugation et utilisez une pipette d’un millilitre pour prélever les cinq millilitres supérieurs de milieu de séparation cellulaire. Ensuite, collectez les cellules à l’interface et lavez les cellules épithéliales intestinales dans 10 millilitres de milieu RPMI, en remettant la pastille en suspension dans cinq millilitres de RPMI frais.

Après avoir préparé des suspensions de cellules uniques de la rate à partir de souris IL-22 td-Tomate, comme cela vient d’être démontré. Remettez les cellules en suspension à une concentration de 10 à sept cellules par millilitre dans du PBS stérile et utilisez la méthode d’isolement des cellules CD4 négatives de souris pour purifier les cellules T CD4 positives. Ensuite, étiquetez les lymphocytes T avec des anticorps anti-CD4 et anti-CD45RB pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius.

A la fin de l’incubation, prélever les cellules par centrifugation suivie d’un lavage dans deux millilitres de PBS complété par du FBS. Remettez en suspension la pastille lavée dans un millilitre de PBS et de FBS frais et triez les lymphocytes T marqués par cytométrie en flux selon leur coexpression CD4 et CD45RB. Lorsque toutes les cellules ont été triées, collectez-les par centrifugation et remettez la pastille en suspension à une concentration de 10 à six cellules par millilitre dans du PBS stérile pour l’injection des cellules dans des souris knock-out RAG1.

Pour créer le rapporteur murin de l’IL-22, la recombinaison du transgène a été utilisée pour modifier un chromosome artificiel bactérien porteur du criquet IL-22 qui contient également un marqueur de sélection positif et un gène de résistance aux antibiotiques chloramphénicol. Après l’introduction de tdTomato dans l’exon1, la séquence peptidique signal a été perturbée, piégeant le rapporteur tdTomato à l’intérieur des cellules exprimant l’IL-22 et permettant leur détection et leur isolement par cytométrie en flux. Pour tester la fidélité des rapporteurs de l’IL-22, les splénocytes générés in vitro peuvent être cultivés dans des conditions Th22 ou neutres, l’expression de l’IL-22 tdTomato étant apparente à la fois par cytométrie en flux et par microscopie fluorescente.

In vivo, les rapporteurs de l’IL-22 ont été détectés dans différents tissus de souris dans des conditions homéostatiques, la plupart du signal étant observé dans les cellules de la lamina propria de l’intestin, mais pas dans le ganglion lymphatique axillaire, la rate ou le thymus. Dans un modèle de colite murine induite par le transfert de cellules T CD45RB CD4 positives dans des souris knock-out RAG1, les rapporteurs tdTomato sont d’abord visualisés dans les ganglions lymphatiques mésentériques, mais leur accumulation éventuelle avec dans la lamina propria des tissus distaux de l’intestin grêle et du côlon. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de ne pas oublier de choisir le bon clone BAC.

Suite à cette procédure, d’autres méthodes, comme l’établissement de modèles d’infection pulmonaire ou cutanée, peuvent être effectuées à l’aide de cette souris rapporteure pour répondre à des questions supplémentaires sur le rôle de l’IL-22 dans la défense de l’hôte et la réparation des tissus. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de l’immunologie pour explorer la fonction des protéines sécrétées qui présentent une faible expression en utilisant un modèle murin comme celui-ci. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de générer une souris rapporteure transgénique et d’identifier les gènes rapporteurs de l’IL-22 in vitro et in vivo.