La perfusé Technique du rein de souris isolé

L’objectif global de ce protocole est d’analyser la fonction rénale isolée dans un rein de souris perfusé ex vivo. À l’exclusion de l’influence de la pression artérielle, des hormones ou du système nerveux autonome. Cette méthode peut aider à répondre aux questions clés de la néfrologie.

Donner l’intérieur à la fonction d’organe isolé et servir d’outil élégant pour étudier les lésions rénales aiguës. Le principal avantage de l’IPK est que la fonction des organes est étudiée en l’absence d’influences systémiques. Après avoir préparé la souris à la chirurgie, à l’aide de ciseaux, effectuez une laparotomie moyenne de la crête pubienne au sternum.

Ouvrez d’abord la peau, puis les muscles abdominaux. Ensuite, retirez les intestins et placez-les sur le côté gauche de la souris, latéralement à l’abdomen. Maintenant, libérez la vessie du tissu conjonctif et exposez les uretères et l’urètre.

Pour ces procédures, placez toutes les ligatures à l’aide de sutures 5-0. La première ligature à placer se trouve autour de l’uretère gauche. Fermez-le hermétiquement avec un double nœud chirurgical.

Ensuite, placez une ligature autour de l’urètre en utilisant la même technique. Ensuite, placez une ligature au lasso autour de toute la vessie, mais laissez-la dénouée. Une fois les trois premières sutures en place, utilisez des ciseaux pour les yeux pour faire une incision d’un millimètre de long dans la vessie.

Dans cette incision, placez une canule faite de deux centimètres de tube PE-50. Fermez maintenant la ligature qui lasso la vessie, fixant la canule. Avec la vessie canulée, coupez maintenant l’uretère gauche et l’urètre distal des ligatures.

La vessie ne doit maintenant être attachée qu’à l’uretère droit et doit bouger librement. Ensuite, retirez les tissus conjonctifs et la graisse entourant l’aorte abdominale. Placez ensuite des ligatures autour du milieu de l’aorte exposée et juste en dessous du diaphragme entre l’artère mésentérique supérieure et le tronc cœliaque.

Gardez également chacun d’entre eux lâche. Ensuite, placez une ligature autour de l’artère mésentérique supérieure. Maintenant, placez une troisième ligature autour de l’aorte directement sous l’artère rénale droite et au-dessus de l’artère rénale gauche.

Il s’agit de la ligature numéro sept. Enfin, mettez une ligature autour de l’ensemble de la veine caudale. Placez maintenant une pince entre la ligature numéro sept et la ramification de l’artère rénale gauche.

Ensuite, faites une petite incision dans l’aorte, caudale à la ligature sept, en prenant soin de ne pas couper la paroi dorsale et d’étirer l’ouverture avec un dilatateur vasculaire. Dans l’ouverture, insérez une canule en PE-50 tirée de deux centimètres, en poussant l’extrémité juste dans la pince. Ensuite, ouvrez la pince.

Ensuite, poussez la pointe de l’aiguille vers le crâne jusqu’à ce qu’elle atteigne la jonction de l’artère rénale droite et de l’aorte. Fermez maintenant la ligature sept, puis fermez la ligature au milieu de l’aorte abdominale. Procédez en ouvrant la poitrine avec des ciseaux en disséquant le diaphragme.

Ensuite, d’une seule coupe, séparez l’aorte, la veine cave, le cœur et les nerfs végétatifs. Maintenant, commencez le contrôle de la pression de la pompe de perfusion et maintenez la pression moyenne entre 80 et 100 millimètres de mercure. Maintenant, fermez les trois ligatures non liées restantes autour de l’aorte et de la veine caudale.

À l’aide de ciseaux, libérez le rein droit du tissu conjonctif environnant et libérez-le de la capsule adipeuse. Coupez l’aorte en proximal à la ligature entre l’artère mésentérique supérieure et le tronc cœliaque. Ensuite, coupez l’artère mésentérique supérieure distalement à la ligature autour de l’artère mésentérique supérieure.

Maintenant, retirez le faisceau de vaisseaux de soutien du rein, en prenant soin de ne pas couper les vaisseaux eux-mêmes. Ensuite, coupez le foie à la connexion avec le rein, mais laissez une petite partie du foie attachée à celui-ci, de sorte que la veine cave soit maintenue ouverte par celui-ci. L’étape suivante consiste à retirer le faisceau rénal de la souris.

Maintenant, laissez le rein dans la chambre et retirez la souris. À la jonction entre le foie et les reins, placez une ligature lasso. Ensuite, canulez la veine cave avec une ligne veineuse et fermez la ligature du lasso.

Le rein doit maintenant reposer de manière stable dans la boîte. L’écoulement veineux à travers la ligne veineuse doit commencer immédiatement. L’écoulement de l’urine commencera après environ trois minutes.

Le péristaltisme de l’uretère doit commencer immédiatement et rester stable pendant au moins une heure. Fermez la boîte. La préparation est maintenant terminée et devrait rester viable pendant au moins une heure.

Après avoir utilisé la méthode décrite sur des souris C57 noires 6, la viabilité tissulaire de quatre reins a été testée après une heure de perfusion continue. La pression a été maintenue à une pression continue de 100 millimètres de mercure. Le débit perfusatif et la résistance vasculaire sont restés stables dans les quatre reins.

Le débit de filtration glomérulaire a été évalué à l’aide de la clairance de l’inuline FITC destinée à augmenter avec le temps, mais pas de manière significative. L’excrétion fractionnée de sodium et de potassium a été évaluée après 55 minutes de perfusion. Ces paramètres ont augmenté par rapport à la situation in vivo.

Après 55 minutes, la molalité des urinoirs n’a pas dépassé l’osmolalité de l’écoulement veineux. Les reins ont ensuite été fixés et leur ultrastructure a été évaluée par TEM. Les glomérules dans les segments S1 des tubules proximaux semblaient largement inaltérés.

Certains segments S2, mais pas tous les segments S2, S3 des tubules proximaux des membres ascendants épais qui n’étaient pas proches des faisceaux vasculaires présentaient des signes de lésions organiques. En y regardant de plus près, les tubules distaux alvéolés et les canaux collecteurs n’ont pas montré de signes de nécrose. Dans l’ensemble, les reins ont reflété ce qui est rapporté pour les reins perfusés isolés chez le rat.

À la suite de cette procédure, des méthodes d’analyse telles que l’imagerie ou les faits suivis d’une analyse de protéines ou d’ARN peuvent être effectuées sur le tissu pour obtenir des informations supplémentaires.