En utilisant l'ARN-séquençage pour détecter de nouveaux variants d'épissage associés à la résistance aux médicaments dans In vitro Modèles de cancer

L’objectif général de ce protocole est d’étudier l’association de l’épissage aberrant avec des profils de résistance aux médicaments dans des modèles in vitro de tumeurs solides et d’hémopathies malignes. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la pharmacologie moléculaire et de la résistance à la chimiothérapie, telles que : quel est le mécanisme sous-jacent à la résistance aux médicaments au niveau post-transcriptionnel ? Le principal avantage de cette technique est qu’elle combine un protocole de dépistage de cytotoxicité bien établi avec une puissante analyse transcriptomique basée sur le séquençage de nouvelle génération.

Cette technique pourrait permettre de mieux comprendre les mécanismes moléculaires sous-jacents à l’échec de la chimiothérapie et d’améliorer la détection précoce de la résistance aux médicaments. Cette méthode peut donner un aperçu des déterminants de la résistance aux médicaments à l’échelle du génome dans des modèles de lignées cellulaires. Mais il peut également être appliqué à d’autres systèmes tels que les échantillons primaires de patients et la xénogreffe.

La démonstration de cette procédure sera assurée par Johan Fomirno, un technicien de notre laboratoire au Centre de cancérologie d’Amsterdam. Pour effectuer le test MTT pour les cellules leucémiques, préparez une plaque expérimentale à fond plat à 96 puits. Consacrez des puits à des concentrations de médicaments pour contrôler les cellules et pour contrôler les milieux sans cellules.

Préparez une gamme de dilution de médicament de dexaméthasone ou de dex. Ajoutez 30 microlitres de chaque dilution de dex dans un puits approprié de la plaque à 96 puits. Assurez-vous d’inclure chaque concentration en trois exemplaires.

Récoltez les cellules leucémiques à croissance exponentielle et remettez-les en suspension à leur concentration optimale d’ensemencement. Ajoutez 120 microlitres de suspension cellulaire dans chaque puits contenant soit la solution médicamenteuse, soit le milieu de croissance, et incubez à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone pendant 72 heures. Après l’étape d’incubation, ajoutez 15 microlitres de réactif MTT dans chaque puits à l’aide d’une pipette répétitive.

Secouez la plaque pendant cinq minutes avec un agitateur d’assiette jusqu’à un maximum de 900 secousses par minute. Remettez les plaques à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone dans un incubateur de culture cellulaire et incubez pendant quatre à six heures supplémentaires. Après l’incubation, assurez-vous de bien remettre en suspension les cristaux de formazan car les valeurs d’absorbance dépendent d’une bonne solubilisation du composé.

Ajoutez 150 microlitres d’isopropanol acidifié dans chaque puits et mélangez bien avec une pipette multicanaux pour remettre complètement en suspension tous les cristaux de formazan. À l’aide d’un lecteur de microplaques, déterminer la densité optique ou DO à 540 et 720 nanomètres pour assurer une mesure précise en corrigeant le bruit de fond OD.To effectuer un test SRB pour les cellules de carcinome pancréatique, préparer une plaque expérimentale à fond plat de 96 puits. Ensemencez des cellules de carcinome pancréatique en phase exponentielle en trois exemplaires dans des plaques à fond plat de 96 puits à la densité appropriée dans 100 microlitres de milieu à l’aide d’une pipette multicanaux.

Ajoutez 100 microlitres de puits moyens à moyens et incubez toute la nuit à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone pour assurer une bonne adhérence des cellules à la plaque. Ajouter 100 microlitres de chaque dilution dans un puits approprié de la plaque de 96 puits à l’aide d’une pipette multicanaux. Assurez-vous d’avoir chaque concentration en trois exemplaires.

Incuber à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone pendant 72 heures. Ensuite, ajoutez 25 microlitres de solution froide de TCA dans les puits à l’aide d’une pipette multicanaux. Incuber les plaques pendant au moins 60 minutes à quatre degrés Celsius pour précipiter et fixer les protéines au fond des puits.

Videz la plaque en retirant le milieu et séchez brièvement sur un mouchoir en papier. Lavez cinq fois à l’eau du robinet avant de vider l’assiette et de la sécher à température ambiante. Ajouter 50 microlitres de solution SRB par puits à l’aide d’une pipette répétitive et colorer pendant 15 minutes à température ambiante.

Ensuite, videz la plaque en enlevant la tache SRB. Après avoir lavé la plaque quatre fois avec de l’acide acétique à 1 %, videz la plaque et laissez-la sécher à température ambiante. Ajouter 150 microlitres de solution Tris par puits à l’aide d’une pipette multicanaux et mélanger pendant trois minutes sur un agitateur à plaques jusqu’à un maximum de 900 secousses par minute.

Lire la densité optique à 540 nanomètres. Faites tourner les échantillons à 300 fois g pendant trois minutes. Après avoir retiré le surnageant, extrayez l’ARNm total à l’aide de colonnes de spin à membrane de silice disponibles dans le commerce.

Déterminez la concentration et la pureté de l’ARN total à l’aide d’un spectrophotomètre UV-Vis. Pour préparer la banque de séquençage, utilisez deux microgrammes d’ARNm total par échantillon. Suivez le protocole de préparation de la banque d’ARNm selon les instructions du fabricant.

Après avoir regroupé les banques dans un seul échantillon jusqu’à une concentration finale de 10 nanomoles par litre à l’aide d’un bioanalyseur, utilisez un système de séquençage à haut débit avec un mode de paire de 100 bases à lecture unique. Concevez toutes les amorces comme décrit dans le protocole de texte. Pour la synthèse de l’ADNc du premier brin, configurez la transcription inverse d’un microgramme de l’ARN isolé en ADNc en utilisant 200 unités par microlitre de transcriptase inverse du virus de la leucémie murine Moloney dans son tampon de réaction dilué de un à cinq avec de l’eau stérile.

Pour effectuer la réaction RT-PCR, ajoutez un microlitre d’ADNc au mélange de réaction PCR et placez les tubes dans le thermocycleur. Exécutez le programme comme décrit dans le protocole texte. Après la PCR, chargez les échantillons dans un gel d’agarose à 1 % et analysez le gel dans un tampon TBE à 100 volts pendant environ 30 minutes dans un système d’électrophorèse.

Pour éviter la contamination croisée, utilisez des pointes filtrantes lors de l’exécution du test qRT-PCR. Pour effectuer une qRT-PCR, préparez un mélange de réaction PCR vert cyanine pour chaque variante d’épissage spécifique à détecter ainsi que pour le gène d’entretien. Chargez le mixage maître sur une plaque blanche à 96 puits et préparez des doublons pour chaque échantillon.

Ajoutez cinq microlitres d’ADNc dilués 10 fois dans de l’eau à chaque mélange avant de placer la plaque dans le thermocycleur. Les courbes d’inhibition de la croissance déterminées par le dosage MTT pour les cellules leucémiques et le dosage SRB pour les cellules de carcinome pancréatique sont décrites ici. Les courbes des cellules résistantes à la dexaméthasone et à la gemcitabine sont décalées vers la droite, ce qui indique une inhibition de la croissance par rapport aux cellules sensibles parentales.

La concentration et la qualité des banques d’ADNc pour toutes les lignées cellulaires sont déterminées à l’aide d’une puce à ADN de bioanalyseur. Les électrophérogrammes montrent des pics de fluorescence à environ 300 paires de bases, ce qui indique une bonne qualité pour la procédure de séquençage de l’ARN ultérieure. De courtes lectures du gène candidat DDX5 peuvent être visualisées sous forme de diagrammes de Sashimi où les lignes de connexion représentent des jonctions d’épissage.

Le transcrit DDX5 montre une utilisation différentielle de l’exon 12 et des cellules CEM de type sauvage et CEM/R30dm par rapport aux lignées cellulaires résistantes aux glucocorticoïdes, CEM-C3 et CEM-R5. Les résultats du séquençage de l’ARN sont validés en effectuant une RT-PCR sur des gènes sélectionnés pour lesquels les paires d’amorces et cèdent aux exons situés en amont et en aval de l’exon épissé alternativement. L’épissage différentiel du gène DDX5 est montré ici.

La quantification des transcrits épissés différentiellement par test qRT-PCR à l’aide d’amorces inverses spécifiques à l’isoforme confirme la régulation descendante spécifique de la variante d’épissage de l’exon 12 delta de DDX5 et d’une sous-lignée spécifique résistante aux glucocorticoïdes. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en trois à quatre semaines. Lors de cette procédure, il est important de ne pas oublier de conserver les échantillons d’ARN sur de la glace afin d’éviter la dégradation.

Suite à cette procédure, d’autres méthodes telles que la surexpression ectopique d’une nouvelle variante d’épissage peuvent être effectuées. Cela permettra de répondre à d’autres questions telles que l’impact fonctionnel d’un profil d’épissage alternatif sur la résistance aux médicaments. Cette technique peut ouvrir la voie à des recherches dans le domaine de la pharmacologie moléculaire pour explorer les déterminants de la résistance aux médicaments à l’échelle du génome.