Une approche alternative pour la préparation de l'échantillon avec une faible Nombre de cellules d'analyse TEM

L’objectif global de cette procédure est de préparer des échantillons avec un faible nombre de cellules pour effectuer une analyse TEM de manière efficace et reproductible. Cette méthode peut aider à révéler toutes les structures des cellules réelles et un meilleur cadre physiologique dans le domaine biomédical. Le principal avantage de cette technique est qu’il est possible d’obtenir des résultats qualitatifs et quantitatifs à partir d’un faible nombre de cellules de manière reproductible.

Pour commencer, utilisez des faits pour trier 10 000 cellules souches hématopoïétiques, ou CSH, dans un tube de microcentrifugation de 1,5 ml. Contenant 600 microlitres de milieu dulbecco modifié isocoves avec 10 % de FBS. À l’aide d’une centrifugeuse avec des godets pivotants, faites tourner les HSC triés à 1 000 fois G pendant 10 minutes.

Utilisez l’aspiration gentile pour enlever tout sauf 200 microlitres du milieu. Pour fixer les cellules, ajoutez 0,2 ml de solution fixatrice deux X fraîchement préparée et incubez à température ambiante pendant une heure. Ajoutez ensuite 600 microlitres de tampon cacodylate de 0,1 molaire pour laver les cellules.

Centrifugez à nouveau les cellules, cette fois à 30 degrés Celsius. Ensuite, après la centrifugation et l’élimination de tous les tampons sauf 200 microlitres, ajoutez 200 microlitres de deux milligrammes par millilitre de bleu d’evans dans un tampon cacodylate, et incubez à température ambiante pendant 20 minutes pour colorer les cellules. Utilisez 600 microlitres de tampon cacodylate de 0,1 molaire pour laver les cellules trois fois.

Ensuite, mettez à nouveau les cellules en suspension dans les 200 microlitres de tampon restants avant de transférer la suspension de la cellule dans un tube de 0,5 ml. À cette étape, la pastille doit être visible dans le tube. À l’aide d’une centrifugeuse de table, faites tourner les cellules à 1 000 fois G pendant 10 minutes.

Retirez ensuite délicatement le tampon sans déranger la minuscule pastille de cellule maintenant visible, en laissant 50 microlitres de tampon dans le tube. Préparez une solution d’agarose à 4 %, en ajoutant 200 milligrammes d’agarose à bas point de fusion à cinq millilitres de tampon cacodylate à 0,1 molaire dans un tube de 15 ml. Faites fondre l’agarose en transférant le tube dans de l’eau bouillante dans une bouteille en verre de 100 ml.

Ajoutez 200 microlitres de la solution d’agarose dans le tube de la suspension cellulaire. Centrifuger immédiatement à 1 000 fois G et à 30 degrés Celsius pendant 10 minutes. Après avoir confirmé que les cellules ont été granulées dans l’agarose semi-solide au fond du tube, transférez immédiatement le tube à quatre degrés Celsius, ou glace, pendant 20 minutes pour solidifier l’agarose.

À l’aide d’une aiguille de calibre 27, transférez soigneusement l’agarose solidifiée, contenant la pastille de cellule, dans une boîte de Pétri en plastique de 35 ml contenant 0,1 tampon molaire de cacodylate. Avec un scalpel, coupez l’agarose solidifiée contenant la pastille cellulaire en un seul morceau d’environ un à deux millimètres. Transférez-le ensuite dans un nouveau tube de 1,5 ml.

Ajoutez 600 microlitres de tampon cacodylate de 0,1 molaire et lavez la pastille de cellules d’agarose à l’aide d’une pipette pour ajouter et retirer le tampon. Retirez le tampon de la pastille de cellule d’agarose et, dans une hotte, tout en portant des vêtements de protection et des gants, ajoutez un millilitre de solution de tétroxyde d’osmium à 1 %. Incuber la pastille cellulaire à quatre degrés Celsius pendant une heure.

Après l’incubation, lavez l’échantillon trois fois. Transférez-le dans un flacon à scintillation en verre de 20 ml avec un bouchon. Ensuite, déshydratez l’échantillon à l’aide d’une série d’éthanol.

Ensuite, infiltrez l’échantillon dans des concentrations croissantes de résine LX 112 dans de l’éthanol avant de l’incuber dans de la résine à 100 % deux fois pendant 60 minutes à chaque fois. À l’aide d’une pince, transférez soigneusement l’échantillon au bas d’un moule en caoutchouc en forme de pointe pyramidale et ajoutez de la résine pure sur le dessus de l’échantillon pour remplir le moule. Incuber l’échantillon à 60 degrés Celsius pendant 72 heures pour polymériser la résine.

Lorsque la résine est polymérisée, retirez-la des moules en tournant le moule en caoutchouc. Un petit amas noir de cellules devrait être visible dans la pyramide de résine polymérisée. Utilisez du cyanoacrylate pour fixer la pyramide de résine polymérisée sur un cylindre de montage pour le sectionnement.

Après avoir monté le bloc sur un ultramicrotome, utilisez une lame de rasoir et un couteau diamanté pour couper le bloc pyramidal, en créant une forme trapézoïdale courte et large avec le haut et le bas du bloc parallèles l’un à l’autre, et avec des côtés uniformément inclinés. Ensuite, utilisez le couteau diamanté pour couper le bloc autour de la pastille de cellule et retirez les sections de plastique autour de la pièce d’agarose de pastille de cellule. Avec l’ultramicrotome, coupez des sections d’un micromètre et utilisez un outil pour cils et une boucle métallique pour déplacer les sections du bateau à eau à une lame de verre.

Placez ensuite les lames sur une plaque chauffante à 37 degrés Celsius pour les faire sécher. À l’aide d’une seringue avec un filtre de 0,22 micromètre, ajoutez une goutte de solution de bleu de téluatine dans les sections et incubez pendant trois minutes. Ensuite, avec de l’eau distillée, soulevez les toboggans et laissez sécher les sections.

Après séchage, vérifiez les sections au microscope optique pour identifier la position des cellules. Ensuite, utilisez un couteau diamanté pour couper des sections ultra minces. Ensuite, à l’aide d’un outil pour cils, déplacez deux à trois sections sur 200 grilles de mailles depuis le bateau à eau et placez-les dans une boîte de Pétri en verre.

Transférez le plat avec les grilles sur une plaque chauffante à 30 degrés Celsius pendant 30 minutes pour sécher les sections. Ajoutez des gouttes d’acétate d’uranyle à 1 % et laissez incuber à température ambiante pendant 10 minutes pour colorer les grilles. Ensuite, utilisez de l’eau distillée pour rincer six à huit fois.

Colorez avec du citrate de plomb Reynolds à température ambiante pendant cinq minutes avant de rincer six à huit fois. Transférez la boîte de Pétri en verre contenant les grilles sur une plaque chauffante à 37 degrés Celsius pour sécher les sections. Enfin, analysez les coupes avec un microscope électronique à 87 kilovolts.

Montré ici à faible grossissement, des coupes semi-minces colorées au bleu de toluidine provenant de blocs contenant une minuscule pastille cellulaire qui confirment un amas de cellules. Cette image à plus fort grossissement montre la morphologie intacte des cellules. Cette figure représente un champ de vision de l’amas de cellules à partir de coupes ultra-minces qui ont été colorées avec de l’acétate d’uranyle et du citrate de plomb et analysées par microscopie électronique.

On voit ici une seule CSH, démontrant que la morphologie et l’ultrastructure des cellules ont été bien préservées. Une micrographie électronique très détaillée à grossissement plus élevé d’une CSH individuelle montre les ultra-structures intracellulaires. De plus, des images à fort grossissement ont permis de capturer la structure et l’intégrité bien préservées des organites subcellulaires tels que les mitochondries.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en cinq à six heures, et pour la coloration bleue avancée et l’enrobage d’agarose, puis le traitement TEM normal prendra cinq à six jours s’il est effectué correctement. Ainsi, après avoir regardé cette vidéo, vous avez en quelque sorte une bonne compréhension de la façon de préparer des échantillons à partir de la préparation de cellules réelles pour l’analyse TEM.