Une approche alternative pour la préparation de l'échantillon avec une faible Nombre de cellules d'analyse TEM

L'objectif général de cette procédure est de préparer des échantillons contenant un faible nombre de cellules afin d'effectuer une analyse en microscopie électronique en transmission (TEM) de manière efficace et reproductible. Cette méthode permet de révéler toutes les structures des cellules réelles ainsi qu'un meilleur contexte physiologique dans le domaine biomédical. Le principal avantage de cette technique est qu'elle permet d'obtenir des résultats à la fois qualitatifs et quantitatifs à partir d'un faible nombre de cellules, de façon reproductible.

Pour commencer, utilisez un trieur à cellules pour isoler 10 000 cellules souches hématopoïétiques, ou HSC, dans un tube microcentrifuge de 1,5 mL contenant 600 microlitres de milieu Isocove modifié de Dulbecco avec 10 % de FBS. À l’aide d’une centrifugeuse équipée de godets oscillants, centrifugez les HSC triées à 1 000 × g pendant 10 minutes.

Utilisez une aspiration douce pour éliminer tout le milieu sauf 200 microlitres. Pour fixer les cellules, ajoutez 0,2 mL de solution fixative fraîchement préparée deux X, puis incubez à température ambiante pendant une heure. Ensuite, ajoutez 600 microlitres de tampon cacodylate 0,1 molaire pour laver les cellules.

Centrifuger à nouveau les cellules, cette fois à 30 degrés Celsius. Ensuite, après la centrifugation, et après avoir éliminé tout le tampon sauf 200 microlitres, ajouter 200 microlitres d’un mélange contenant deux milligrammes par millilitre de bleu d’Evans dans un tampon cacodylate, puis incuber à température ambiante pendant 20 minutes afin de colorer les cellules. Utiliser 600 microlitres de tampon cacodylate 0,1 molaire pour laver les cellules trois fois.

Ensuite, resuspendre les cellules dans les 200 microlitres restants de tampon avant de transférer la suspension cellulaire dans un tube de 0,5 mL. À cette étape, le culot doit être visible dans le tube. À l’aide d’une centrifugeuse de table, centrifuger les cellules à 1 000 ×g pendant 10 minutes.

Ensuite, retirez délicatement le tampon sans perturber le petit culot cellulaire désormais visible, en laissant 50 microlitres de tampon dans le tube. Préparez une solution d'agarose à 4 % en ajoutant 200 milligrammes d'agarose à bas point de fusion à cinq millilitres de tampon cacodylate 0,1 molaire dans un tube de 15 mL. Faites fondre l'agarose en plaçant le tube dans de l'eau bouillante contenue dans un flacon en verre de 100 mL.

Ajouter 200 microlitres de la solution d'agarose au tube contenant la suspension cellulaire. Centrifuger immédiatement à 1 000 × g et à 30 degrés Celsius pendant 10 minutes. Après avoir confirmé que les cellules se sont déposées dans l'agarose semi-solide au fond du tube, transférer immédiatement le tube à 4 degrés Celsius, ou sur de la glace, pendant 20 minutes afin de solidifier l'agarose.

À l’aide d’une aiguille de calibre 27, transférer délicatement l’agarose solidifiée contenant le culot cellulaire vers une boîte de Pétri en plastique de 35 mL contenant du tampon cacodylate 0,1 molaire. Avec un scalpel, tailler l’agarose solidifiée contenant le culot cellulaire en un seul morceau d’environ un à deux millimètres. Puis le transférer dans un nouveau tube de 1,5 mL.

Ajouter 600 microlitres de tampon cacodylate 0,1 molaire et laver le culot cellulaire en agarose en utilisant une pipette pour ajouter et retirer le tampon. Éliminer le tampon du culot cellulaire en agarose et, sous une hotte aspirante, en portant des vêtements de protection et des gants, ajouter un millilitre de solution d'osmium tétraoxyde à 1 %. Incuber le culot cellulaire à quatre degrés Celsius pendant une heure.

Après l'incubation, laver l'échantillon trois fois. Le transférer dans un flacon en verre de 20 mL avec bouchon. Ensuite, déshydrater l'échantillon à l'aide d'une série d'éthanol.

Ensuite, imbibez l'échantillon avec des concentrations croissantes de résine LX 112 dans l'éthanol, puis incubez-le deux fois dans de la résine à 100 %, pendant 60 minutes à chaque fois. À l'aide de pinces, transférez soigneusement l'échantillon au fond d'un moule en caoutchouc en forme de pyramide, puis ajoutez de la résine pure par-dessus l'échantillon afin de remplir le moule. Incubez l'échantillon à 60 degrés Celsius pendant 72 heures afin de polymériser la résine.

Lorsque la résine est polymérisée, retirez-la des moules en tordant le moule en caoutchouc. Un petit groupe noir de cellules doit être visible dans la pyramide de résine polymérisée. Utilisez du cyanoacrylate pour fixer la pyramide de résine polymérisée sur un cylindre de montage destiné à la sectionnement.

Après avoir fixé le bloc sur un ultramicrotome, utilisez une lame de rasoir et un couteau en diamant pour tailler le bloc pyramidal en une forme trapézoïdale courte et large, dont le haut et le bas sont parallèles l'un à l'autre, avec des côtés régulièrement inclinés. Ensuite, utilisez le couteau en diamant pour tailler le bloc autour du culot cellulaire et retirer les sections de plastique entourant le morceau d'agarose contenant le culot cellulaire. À l’aide de l’ultramicrotome, découpez des sections d’un micromètre d’épaisseur et utilisez un outil en poil de cil et une anse métallique pour transférer les sections du bain d’eau vers une lame de verre.

Ensuite, placer les lames sur un bloc chauffant à 37 degrés Celsius pour les faire sécher. À l’aide d’une seringue munie d’un filtre de 0,22 micromètre, ajouter une goutte de solution de bleu de toluidine sur les sections et incuber pendant trois minutes. Puis rincer les lames avec de l’eau distillée et laisser les sections sécher.

Après séchage, examiner les sections au microscope optique afin d'identifier la position des cellules. Ensuite, utiliser un couteau en diamant pour couper des sections ultraminces. Puis, à l'aide d'un outil en poil de cil, transférer deux à trois sections sur des grilles de 200 mailles depuis le bain d'eau et les placer dans une boîte de Pétri en verre.

Transférez la boîte avec les grilles sur une plaque chauffante à 30 degrés Celsius pendant 30 minutes pour sécher les sections. Ajoutez des gouttes d'acétate d'urane à 1 % et incubez à température ambiante pendant 10 minutes pour colorer les grilles. Ensuite, rincez six à huit fois à l'eau distillée.

Colorer avec du citrate de plomb de Reynolds à température ambiante pendant cinq minutes, puis rincer de six à huit fois. Transférer la boîte de Pétri en verre contenant les grilles sur un bloc chauffant à 37 degrés Celsius pour sécher les sections. Enfin, analyser les sections au microscope électronique à 87 kilovolts.

On observe ici, en faible grossissement, des coupes semi-minces colorées au bleu de toluidine provenant de blocs contenant un petit culot cellulaire, confirmant un regroupement de cellules. Cette image, à plus fort grossissement, montre la morphologie intacte des cellules. Cette figure représente un champ d'ensemble du regroupement cellulaire obtenu à partir de coupes ultra-minces, colorées à l'acétate d'uranyle et au citrate de plomb, puis analysées par microscopie électronique.

On observe ici une seule CSH, ce qui démontre que la morphologie et l'ultrastructure des cellules ont été bien préservées. Une micrographie électronique à plus fort grossissement d'une CSH individuelle montre les ultrastructures intracellulaires. De plus, des images à fort grossissement ont permis de capturer la structure et l'intégrité bien préservées d'organites subcellulaires tels que les mitochondries.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en cinq à six heures, et pour la coloration bleue avancée, l'incorporation dans l'agarose, puis le traitement normal en microscopie électronique en transmission prendra cinq à six jours si elle est effectuée correctement. Ainsi, après avoir visionné cette vidéo, vous avez une bonne compréhension de la préparation d'échantillons à partir de cellules réelles pour une analyse en MET.