Méthode de Direct segmentaire livraison intra-hépatique L'utilisation d'un modèle hilaire de foie de rat Clamp

L’objectif global de ce modèle unique de clamp hilaire hépatique de rat est de permettre l’étude de l’impact des molécules pharmacologiques d’intérêt dans l’amélioration des lésions d’ischémie-reperfusion. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la transplantation hépatique sur les molécules qui peuvent être directement perfusées dans le foie pour aider à médier les lésions d’ischémie-reperfusion. Le principal avantage de cette technique est que la molécule d’intérêt est directement injectée dans la veine porte, réduisant ainsi le volume de distribution.

Les implications de cette technique s’étendent à la transplantation de tous les organes, car elle permet de tester des molécules qui pourraient être ajoutées aux perfusats d’organes pour réduire les lésions d’ischémie et de reperfusion. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle en raison de la petite taille de la branche de la veine porte utilisée pour la canulation. Commencez par confirmer le niveau de sédation approprié par pincement des orteils, puis placez le rat sur un coussin chauffant sous un microscope à dissection et retenez les membres.

Ensuite, faites une incision cutanée abdominale médiane du pubis au xiphoïde, suivie d’une incision similaire dans le péritoine le long de la ligne blanche. Entrez dans l’abdomen, en prenant soin de ne pas endommager la vessie ou l’intestin, et libérez le foie du péritoine vers l’avant près du processus xiphoïde. Faites une incision transversale à travers la peau et le péritoine au bord inférieur du lobe droit du foie, et utilisez une pince anti-moustique incurvée pour rétracter le processus xiphoïde.

Utilisez des écarteurs de côtes pour ouvrir les côtes aussi loin que possible de la ligne médiane et coupez les ligaments falciforme, phrénique et gastrique. Ensuite, utilisez des cotons-tiges stériles humidifiés pour retourner le foie vers le haut et coupez des ligaments supplémentaires si nécessaire pour accéder à la porta. À l’aide d’une gaze humidifiée d’une solution saline, faites pivoter viscéralement le foie, puis retirez le tissu conjonctif lâche recouvrant le hile porte et le tissu conjonctif lâche recouvrant la longueur de la veine porte.

À l’aide d’une pince, poussez à travers le tissu conjonctif lâche situé en arrière de la veine porte gauche, de l’artère et du canal biliaire pour créer une fenêtre et entourez lâchement les vaisseaux avec une suture de Potts 4-0. Ensuite, dégagez le tissu conjonctif lâche recouvrant la branche postérieure de la veine porte au niveau du rein droit. Ensuite, à l’aide d’une seringue à insuline, prélevez 0,5 millilitre de sang de la veine cave inférieure et transférez le sang dans un petit flacon.

Centrifugez l’échantillon et recueillez le sérum dans un nouveau flacon pour une congélation instantanée dans de l’azote liquide. Coupez deux morceaux de suture 7-0. Placez la première boucle 7-0 autour de la veine porte gauche aussi loin que possible et utilisez une pince anti-moustique incurvée pour rétracter la veine.

Placez une deuxième boucle 7-0 lâchement attachée sur la branche postérieure de la veine porte près de son intersection avec la veine porte. Maintenant, chargez la pompe à perfusion avec une seringue de cinq millilitres contenant trois millilitres de réactif dans une solution saline à 0,9 %, et amorcez la tubulure. Utilisez une pince microchirurgicale pour saisir la veine porte distale afin de réduire les saignements pendant la canulation, et utilisez de petits ciseaux microchirurgicaux pour percer un trou de 0,5 millimètre dans la veine entre la suture de maintien 7-0 et son intersection avec la veine porte.

À l’aide d’un cathéter 27-0, canulez le système veineux porte gauche, en insérant le cathéter au-delà de la bifurcation des veines portes gauche et droite. Perférez un millilitre de solution saline normale pour confirmer l’emplacement de la canule et surveillez le blanchiment des lobes latéraux et médians gauches du foie. Évaluez manuellement que le cathéter a dépassé le décollage de la veine porte droite, mais pas au-delà du décollage de la veine porte alimentant le lobe médian, puis serrez la suture de Potts, fixez le cathéter avec la suture 7-0 et retirez la pince de la veine porte distale.

Commencer immédiatement la perfusion de deux millilitres du réactif d’intérêt sur une période de 15 minutes, avec une surveillance continue des signes vitaux de l’animal tout au long de la perfusion. Une heure après le début de la période ischémique, retirez la suture de Potts et le cathéter, puis serrez la suture 7-0 sur la branche postérieure jusqu’à la veine porte. Deux heures après le début de la reperfusion, prélevez lentement 0,5 millilitre de sang de la veine cave inférieure, puis transférez lentement le sang dans un nouveau flacon.

Appliquez une légère pression pour arrêter le saignement de la veine si nécessaire. Ensuite, centrifugez le sang et congelez instantanément la moitié du sérum pour le traitement en aval, comme nous venons de le démontrer. Au point final de l’expérience, inciser le diaphragme en cercle et sectionner tout tissu conjonctif supplémentaire qui relie le foie à la cavité péritonéale.

Prélevez le foie et obtenez quatre gros échantillons des lobes gauche et médian, et quatre gros échantillons du lobe droit. Ensuite, placez les échantillons dans des flacons étiquetés individuellement et congelez les tissus dans de l’azote liquide pour un traitement en aval. La mesure sérique de l’alanine aminotransférase chez des animaux normaux traités à une solution saline et à l’oreille avec persfusion de PEG-SOD démontre une différence significative entre les niveaux d’expression des enzymes hépatiques chez les animaux témoins et les animaux expérimentaux à 120 minutes après la reperfusion.

L’expression tissulaire du malondialdéhyde dans le lobe droit de la pince non hilaire ne présente pas de différence significative entre le groupe témoin et le groupe expérimental. Cependant, le clamp post-hilaire gauche et le lobe de reperfusion présentent un niveau significativement plus élevé d’expression tissulaire du malondialdéhyde par rapport au lobe témoin non reperfusé et non perfusé, ainsi qu’au lobe droit perfusé de PEG-SOD. Le même schéma est également observé pour l’expression tissulaire du glutathion.

L’analyse par transfert Western indique une augmentation du niveau d’expression de la caspase-3 clivée dans le lobe gauche après clamp hilaire et reperfusion, qui diminue chez les animaux traités par perfusion de PEG-SOD, différences qui sont confirmées comme étant significatives par densitométrie. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en trois heures et 30 minutes si elle est exécutée correctement. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler d’obtenir une traction substantielle sur la branche de la veine porte pour la canulation lors de la mise en place de la pince de la veine porte distale.

Une fois cette procédure maîtrisée, elle peut être utilisée pour explorer l’impact d’une variété de substances pharmacologiques. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de canuler le système veineux du portail gauche.