Longitudinal In Vivo Imagerie du Cerebrovasculature: Pertinence pour les maladies du système nerveux central
December 6th, 2016
Ce manuscrit décrit une procédure pour suivre le remodelage de la cerebrovasculature pendant amyloïde accumulation de plaque in vivo en utilisant longitudinale microscopie à deux photons. Préparation-crâne aminci permet la visualisation des colorants fluorescents pour évaluer la progression des lésions vasculaires cérébrales dans un modèle de souris de la maladie d'Alzheimer.
L’objectif global de cette procédure est de suivre le remodelage du système vasculaire dans le cerveau de la souris au cours de la progression d’une maladie chronique sur de longues périodes. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des neurosciences, telles que le rôle du remodelage vasculaire cérébral dans les maladies du système nerveux central. Le principal avantage de cette technique est qu’elle est peu invasive et sans inflammation neurale, ce qui la rend idéale pour étudier les pathologies où l’inflammation est réellement impliquée.
Cette technique permet de visualiser les vaisseaux piaux et corticaux pénétrants, en complément des techniques histologiques directes à la visualisation des microcapillaires dans le parenchyme de la barrière hémato-encéphalique. La démonstration de la procédure sera assurée par Margarita Arango-Lievano. C’est une post-doc de mon laboratoire.
Pour commencer cette procédure, nettoyez le banc d’opération et la plaque du microscope avec de l’éthanol à 70 % et couvrez-les d’un chiffon propre et absorbant. Ensuite, vérifiez le niveau d’anesthésie approprié avec des pincements de patte ou de queue. Appliquez ensuite une pommade ophtalmique stérile sur les yeux et rasez la fourrure du nez aux oreilles avec une lame de rasoir.
Ensuite, stérilisez la peau avec une solution antiseptique de povidone iodée. Placez la souris sous le microscope binoculaire et faites une incision cutanée des oreilles au nez. Tirez la peau sur le côté pour exposer le crâne.
Ensuite, déchirez le périoste et rincez à plusieurs reprises le crâne avec de l’ACSF stérile pour arrêter un éventuel saignement. Dans cette procédure, retirez la pommade oculaire à l’aide d’un coton-tige. Appliquez ensuite une goutte d’anesthésique ophtalmique topique.
Appuyez doucement sur la peau autour de l’orbite pour obtenir une saillie. Après cela, injectez du FITC conjugué au dextran dans le sinus rétro-orbitaire. Par la suite, appliquez une pommade ophtalmique stérile sur les yeux.
Assurez-vous que la peau est rétractée et que le crâne est propre et sec autour de la zone d’imagerie sélectionnée. Appliquez ensuite une petite quantité de colle cyanoacrylique autour de la fenêtre du dispositif de montage sur la tête et collez le dispositif de montage sur la tête autour de la région cible. Ensuite, appliquez une légère pression sur le support de tête pendant plusieurs secondes.
Tirez les extrémités de la peau vers le bord de la fenêtre du dispositif de montage sur la tête, en vous assurant que la zone est sèche. Fixez la peau et le bord de la fenêtre avec une petite quantité de colle cyanoacrylique et attendez qu’ils soient secs. Ensuite, fixez l’animal à la scène à l’aide du dispositif de montage sur la tête.
Rincez l’os dans la zone cible avec de l’ACSF stérile et assurez-vous que le puits entre la peau et le dispositif de montage sur la tête est parfaitement scellé. Ensuite, enveloppez la souris dans une couverture de survie pour maintenir la normothermie. Effectuez maintenant l’amincissement du crâne en solution ACSF pour atténuer les vibrations créées par le forage.
Et n’oubliez pas de changer régulièrement l’ACSF pour éliminer les débris osseux et éviter la surchauffe des tissus. À l’aide d’une perceuse dentaire, commencez à amincir la surface du crâne dans une zone d’un diamètre d’un millimètre en utilisant un mouvement vertical régulier parallèle au crâne, et retirez la majeure partie de l’os spongieux. Notez que l’os près des sutures est fortement vascularisé.
En cas de saignement, appliquez de la mousse de gel pré-imbibée d’ACSF pour l’arrêter. Nous gardons donc l’os pour limiter l’inflammation, mais une pression ou un chauffage excessif pendant la procédure d’amincissement peut également entraîner une inflammation. Utilisez une lame microchirurgicale ophtalmique tranchante et jetable pour poursuivre l’amincissement du crâne afin d’obtenir une région finale d’environ 0,5 millimètre de diamètre avec une épaisseur de 20 à 35 micromètres, en prenant soin de ne pas appliquer de pression excessive.
En raison de la repousse osseuse et de la cicatrisation, il est nécessaire d’amincir davantage la fenêtre à chaque séance d’imagerie. Dans cette étape, transférez la souris avec la platine de montage sur la tête sous le microscope laser à deux photons. À l’aide d’un objectif à immersion dans l’eau 20X avec une ouverture numérique de 1,0, localisez la fine fenêtre crânienne au centre du champ optique à l’aide de la lampe épifluorescente.
Assurez-vous que l’objectif est toujours immergé dans ACSF. Ensuite, démarrez le balayage laser avec un laser à impulsions à verrouillage de mode. Réglez la longueur d’onde d’excitation à 750 nanomètres pour détecter la fluorescence émise du méthoxy-X04 dans le canal bleu et du FITC-dextran dans le canal vert.
Acquérez une pile à faible grossissement avec un zoom numérique de 0,7X afin de créer une carte 3D pour la relocalisation précise du retour sur investissement à des points temporels ultérieurs. Ensuite, acquérez une mosaïque de quatre images à fort grossissement numérique avec un zoom numérique deux X. À l’aide du logiciel d’imagerie, déplacez la fenêtre par pas de 200 micromètres pour capturer toutes les régions.
La profondeur des piles est généralement de 250 micromètres à partir de la surface piale dans chaque image de la mosaïque. Avant de retirer la souris du microscope, prenez une photo ou faites une carte 2D dessinée à la main du système vasculaire pial pour une relocalisation future du champ d’imagerie. On voit ici la comparaison de deux images reconstruites de la microvascularisation et des dépôts amyloïdes sur une souris FAD cinq X à l’âge de quatre et cinq mois.
Les plaques amyloïdes sont indiquées par des astérisques blancs, et les nouvelles plaques apparaissant à cinq mois sont indiquées par des astérisques jaunes. Un rare cas de réduction de la plaque est indiqué par un astérisque orange. Les microvaisseaux nouvellement formés sont indiqués par des flèches jaunes, tandis que l’occlusion vasculaire est indiquée par une flèche rouge.
Cette figure montre que les dépôts vasculaires amyloïdes sur des vaisseaux de gros calibre. Dans le même temps, des plaques amyloïdes peuvent également être observées sur des vaisseaux de petit calibre. Les flèches rouges indiquent les vaisseaux occlus, tandis que les astérisques blancs indiquent la croissance de plaques amyloïdes.
Ainsi, une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en 1 heure et demie, y compris les étapes de chirurgie et d’imagerie. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de prévoir le nombre de séances d’imagerie afin de limiter l’amincissement excessif lors de la première séance. Dans l’ensemble, ces procédures permettent de suivre les changements dans le système vasculaire cérébral au cours de la progression de la maladie.
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Aperçu
Ce manuscrit décrit une procédure pour suivre le remodelage de la cérébrovasculaire lors de l'accumulation de plaques amyloïdes in vivo en utilisant la microscopie biphotonique longitudinale. Cette méthode est minimalement invasive et permet la visualisation des changements vasculaires dans un modèle murin de la maladie d'Alzheimer.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neuroscience
- Biologie vasculaire
- Recherche sur la maladie d'Alzheimer
Contexte
- Comprendre le remodelage cérébrovasculaire est crucial dans les maladies chroniques.
- L'inflammation joue un rôle important dans les pathologies du système nerveux central.
- Les techniques d'imagerie longitudinale améliorent l'étude de la dynamique vasculaire.
- La microscopie biphotonique permet l'observation en temps réel des changements vasculaires.
Objectif de l'étude
- Suivre le remodelage cérébrovasculaire lors de l'accumulation de plaques amyloïdes.
- Évaluer la progression des dommages cérébrovasculaires dans la maladie d'Alzheimer.
- Fournir des indications sur le rôle du système vasculaire dans les maladies neurodégénératives.
Méthodes utilisées
- Microscopie biphotonique longitudinale.
- Préparation de crâne aminci pour l'imagerie in vivo.
- Visualisation de colorants fluorescents pour évaluer les changements vasculaires.
- Modèle murin de maladie d'Alzheimer pour l'expérimentation.
Principaux résultats
- Suivi réussi du remodelage cérébrovasculaire au fil du temps.
- Identification des dommages vasculaires associés à l'accumulation de plaques amyloïdes.
- Démonstration de l'efficacité de la technique sur un modèle animal vivant.
- Contribution à la compréhension de l'interaction entre le système vasculaire et la neurodégénérescence.
Conclusions
- La méthode fournit un outil précieux pour étudier les changements cérébrovasculaires dans les maladies neurodégénératives.
- Les techniques minimalement invasives peuvent apporter des indications significatives sur les mécanismes des maladies.
- Les recherches futures peuvent s'appuyer sur ces résultats pour explorer des interventions thérapeutiques.
Questions fréquemment posées
Executive Industry Relevance
Longitudinal in vivo imaging of cerebrovascular remodeling provides critical insights into disease mechanisms in neurodegenerative disorders, enabling early detection of vascular pathology linked to amyloid burden. This approach supports target validation by linking structural vascular changes to disease progression, informing mechanistic de-risking in CNS drug discovery. The technique enhances predictive confidence in preclinical models by allowing repeated, non-invasive monitoring of vascular and amyloid dynamics over time.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of vascular hypothesis in Alzheimer's disease by correlating amyloid deposition with cerebrovascular remodeling over time.
- Operational Value: Provides a minimally invasive platform for repeated imaging sessions, reducing animal use and inflammation-related confounders.
- Translational Value: Supports target confidence by visualizing vascular pathology in a disease-relevant system that mirrors human CNS pathology.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Facilitates assay standardization through quantitative imaging of vascular density, permeability, and amyloid co-localization in defined cortical regions.
- Operational Value: Enables reproducible, high-resolution readouts for screening compounds that modulate vascular integrity or amyloid-associated vasculopathy.
- Translational Value: Generates disease-relevant imaging biomarkers suitable for preclinical validation and cross-platform translation.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Tracks vascular dysfunction and amyloid deposition longitudinally, supporting de-risking of targets involved in neurovascular unit integrity.
- Operational Value: Provides continuity from discovery to preclinical validation by allowing serial monitoring of therapeutic intervention effects on vasculature.
- Translational Value: Aligns with biomarker-driven strategies by enabling correlation of vascular imaging endpoints with cognitive and pathological outcomes.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target validation through preclinical evaluation, offering a longitudinal readout for vascular mechanisms in neurodegenerative disease models.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on the role of cerebrovascular remodeling in amyloid-induced neurotoxicity and blood-brain barrier dysfunction.
- Screening: Enables assay-ready vascular imaging with quantitative outputs on vessel diameter, occlusion, and permeability changes over time.
- Analytics: Delivers spatial and temporal data on vascular networks and amyloid burden, facilitating comparative analysis across treatment groups.
- Translational Research: Connects vascular imaging to preclinical continuity by allowing correlation of imaging biomarkers with histopathological and behavioral endpoints.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging platform applicable across multiple CNS disease models involving vascular pathology, including stroke, traumatic brain injury, and vascular dementia.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in neurovascular contributions to neurodegeneration.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization through standardized surgical preparation and imaging protocols.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing early vascular phenotype data that predicts downstream neurodegenerative risk.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on vascular safety and efficacy profiles in disease-relevant models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microsurgical techniques, two-photon microscopy, and fluorescent probe handling.
- Dependent on specialized instrumentation including tunable lasers, high-NA water immersion objectives, and environmental control systems.
- Necessitates cross-team standardization between surgery, imaging, and analysis teams to ensure longitudinal consistency.
- Involves adaptation considerations for different mouse strains, cranial window sizes, and depth of imaging based on target vascular beds.
- Limited by the need for repeated thinning sessions due to bone regrowth, which must be managed to avoid cumulative tissue damage.
