Name: Souris microchirurgie Infusion Technique pour ciblée Substance Livraison dans le SNC via Lartère carotide interne (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 41 s
Description: Apprenez une technique de microchirurgie chez la souris pour administrer des substances dans le cerveau via l'artère carotide interne. Cette méthode minimise le traumatisme et préserve l'intégrité neuronale tout en atteignant des concentrations élevées.

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Nous tenons à remercier le Dr Lei Chen (Icahn School of Medicine at Mount Sinai, NY) qui a été le premier à établir l’utilisation de ce modèle dans notre laboratoire, et le Dr Gretchen Wolff (Centre allemand de recherche sur le cancer, Heidelberg, Allemagne) pour avoir diffusé la technique dans notre laboratoire. Soutenu en partie par HL126559, DA039576, MH098891, MH63022, MH072567, DA027569 et NSC 2015/17/B/NZ7/02985.

Les procédures impliquées dans le protocole suivant ont été approuvés par l&#39;Université de Miami Institutional Animal Care et utilisation Commission (IACUC). En outre, toutes les procédures sont menées dans des installations agréées par l&#39;Association pour l&#39;évaluation et l&#39;accréditation des animaux de laboratoire Care International (AAALAC). 1. Préparation de la souris pour la chirurgie <ol><li> Anesthésier souris avec de l&#39;isoflurane mélangé avec de l&#39;oxygène, en utilisant un système de laboratoire de l&#39;anesthésie. Utilisez isoflurane à mettre entre 4-5% et le débit d&#39;oxygène à 2 L / min sur la machine commerciale (voir tableau Matériaux). Transférer l&#39;animal à la surface de la chirurgie, sous un stéréomicroscope, et maintenir l&#39;anesthésie en utilisant un cône de nez (utiliser le paramètre 1,5 isoflurane - 2,5 et de l&#39;oxygène au débit de 2 L / min). <ol><li> Assurez-vous que la fréquence respiratoire de la souris est d&#39;environ 1 - 2 respiration / sec sans haleter. En outre, veiller à ce que l&#39;animal ne présente pas de réaction de stimulation des moustaches et de la pédale reFlex (pincement de l&#39;orteil). Surveiller le taux de respiration et d&#39; efforts au cours de la chirurgie, au moins tous les 5 min. Suivez spécifique Institutional Animal Care et utilisation Comité et directives vétérinaires pour la surveillance des rongeurs d&#39;anesthésie. </li></ol></li><li> Appliquer une goutte de lubrifiant ophtalmique sur chaque œil à l&#39;aide d&#39;un écouvillon stérile afin de prévenir la sécheresse. L&#39;administration de l&#39;anti-inflammatoire et analgésique pour soulager l&#39;inconfort est recommandée. </li><li> Avec l&#39;animal couché sur le dos, maintenir l&#39;anesthésie à l&#39;aide d&#39;un cône de nez. </li><li> Nettoyer la zone du cou de l&#39;animal en essuyant la zone trois fois avec de l&#39;éthanol à 70% et la chlorhexidine. Rasez la zone de chirurgie de l&#39;animal à l&#39;aide d&#39;un rasoir (détaillé ci-dessous). </li></ol> 2. Dissection de l&#39;artère carotide commune (CCA) <ol><li> Effectuez la procédure de microchirurgie entière sous un stéréomicroscope. Avec des ciseaux chirurgicaux et des pinces effectuer une incision médiane peu profonde dans le cou, au-dessus du sternum au-dessous de til mâchoire (environ 3 à 4 cm). </li><li> En utilisant une pince grasse soigneusement séparée et du tissu conjonctif pour exposer la trachée. </li><li> Placer un oreiller (objet rond, d&#39;environ 0,5 cm de diamètre) au dos du col de la souris pour s&#39;étendre du col, ce qui expose en outre la région. </li><li> Séparer le tissu en utilisant soit un écarteur de tissus ou des crochets. </li><li> Sur le côté gauche de la trachée de l&#39;animal, tweeze avec précaution le tissu conjonctif pour exposer le CCA gauche. </li><li> Utiliser une pince retirer délicatement tous les tissus conjonctifs pour exposer la bifurcation CCA, et le début des deux artères carotides internes et externes. </li></ol> 3. Préparation de la CCA pour perfusion des substances <ol><li> Insérez deux segments de suture en nylon (environ 1 cm chacun) sous l&#39;artère carotide externe (ECA), en utilisant une pince. </li><li> Placez un nœud permanent au point possible de la CEA le plus élevé. </li><li> Au point le plus bas possible de la CEA, immédiatement au-dessus de la bifurcation CCA, le lieuun noeud amovible. Ce nœud doit être lâche par rapport au nœud supérieur. </li><li> Fermez le CCA en utilisant un clip de navire, au point le plus bas possible. </li><li> Fermez l&#39;artère carotide interne (ICA) à l&#39;aide d&#39;un clip navire. </li><li> Utilisation de microdissection ciseaux à ressort effectuer une petite incision dans l&#39;ECA (environ 2 mm), entre les deux nœuds. </li></ol> 4. Substance Infusion via ICA <ol><li> Assembler un système de perfusion. Fixer 6 pouces de tube capillaire (dimensions idéales: 2,5 mm x 1,2 mm) à une seringue tuberculine contenant 250 ul de la substance à infuser (médicaments, des agents pathogènes, des vésicules extracellulaires, entre autres) et insérez la pointe capillaire doucement dans l&#39;incision réalisée à l&#39;étape 3.6. </li><li> Continuez à glisser vers le bas le capillaire jusqu&#39;à ce qu&#39;il atteigne un point médian entre la bifurcation et le clip de fermeture du CCA. </li><li> Attachez le nœud de la CEA inférieure. Vérifiez que le noeud est suffisant pour permettre la fluidité capillaire lâche et assez serré pour empêcher leaking. </li><li> Retirer l&#39;attache de l&#39;ICA. </li><li> Appuyez doucement sur la substance perfusion seringue piston permettant à environ 10 pi par seconde. </li></ol> 5. Procédures de perfusion post <ol><li> Placez dos clip sur la CIA. </li><li> Retirez délicatement le tube capillaire. </li><li> Attachez le nœud ECA inférieure complètement. </li><li> Retirer les clips de l&#39;ICA et le CCA. </li></ol> 6. Incision clôture et des soins post-opératoires <ol><li> Retirer écarteur ou de tissus crochets et oreiller. </li><li> zone de suture Nettoyer avec une solution saline stérile. </li><li> Fermer l&#39;incision en utilisant suture en nylon / aiguille et pince. </li><li> Administrer anti-inflammatoire et analgésique pour soulager l&#39;inconfort post-opératoire. </li><li> Placez l&#39;animal dans une cage placée sur un coussin chauffant pendant au moins 1 h et la récupération du moniteur. </li></ol>

<ol><li>Chen, L., Swartz, K. R., Toborek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vessel+microport+technique+for+applications+in+cerebrovascular+research%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Vessel microport technique for applications in cerebrovascular research.</a> J Neurosci Res. 87 (7), 1718-1727 (2009).</li>
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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

La microchirurgie de perfusion décrit ici a été prouvé être très efficace dans la prestation de substances exogènes de diverses caractéristiques biologiques dans le SNC, ce qui empêche la diffusion non désirée dans tout le corps 1, 12. Rupture de la barrière hémato-encéphalique est une caractéristique pathologique de plusieurs maladies liées au système nerveux central; Par conséquent évaluer la relation entre les substances exogènes à la barrière hémato-encéphal...

Dans les modèles in vivo du système nerveux central (SNC) ont besoin d&#39; une prestation efficace des substances exogènes, tels que les médicaments, les agents pathogènes, ou exosomes, dans le cerveau. Par conséquent, une méthode de distribution idéale devrait provoquer un traumatisme minimal à l&#39;animal, de préserver l&#39;intégrité du réseau neuronal, et d&#39; atteindre des concentrations élevées de la substance dans le cerveau 1. Plusieurs méthodes chirurgicales de distribution de substance locale ont été décrites, y compris intra-gaine, intracérébrale, et les injections intraventriculaire ou implants 2, 3, 4, 5. Ces approches, cependant, sont considérés comme traumatique du système nerveux central, et permettent l&#39;administration des seuls volumes faibles de la substance d&#39;intérêt. En outre, il a été suggéré que les substances exogènes peuvent être éliminées rapidement par le liquide céphalo - 6 </sup&gt;, et une faible gamme de pénétration du parenchyme cérébral a été observée 7 lorsque les techniques mentionnées ci-dessus sont utilisées. Méthodes de libération systémique, comme par voie orale, pulmonaire, sous - cutanée et intraveineuse, sont plus couramment utilisés dans des modèles animaux, bien qu&#39;ils présentent une faible efficacité dans la livraison des substances au système nerveux central, en raison de l&#39; absorption par les autres organes 8, 9. Par conséquent, ces voies d&#39;administration nécessitent des doses élevées de substances administrées, ce qui augmente le risque d&#39;effets secondaires et de toxicité 10, 11. Ici, nous décrivons une technique de microchirurgie d&#39;infusion de souris, ce qui crée effectivement des substances directement dans le cerveau par l&#39;intermédiaire de l&#39;artère carotide interne. En plus de cibler la livraison au CNS, cette technique ne contourne pas les barrières physiologiques normales et est donc très pertinente pour biological processus impliqués dans les passages des agents thérapeutiques ou des agents pathogènes dans le cerveau.

<table><tbody><tr><td>Instrument d’anesthésie</td><td>Vetequip</td><td>901806</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux chirurgicaux</td><td>Fine Science Tool</td><td>14558-09</td><td></td></tr><tr><td>Pince chirurgicale à pointe droite</td><td>Fine Science</td><td>Tool 00108-11</td><td></td></tr><tr><td>Pince chirurgicale à pointe coudée</td><td>Fine Science Tool</td><td>00109-11</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux à ressort</td><td>Fine Science Tool</td><td>15000-08</td><td></td></tr><tr><td>Suture en nylon</td><td>Braintree Scientific</td><td>SUT-S 104</td><td></td></tr><tr><td>Tube capillaire (Micro-Renathane 0,010 » x 0,005 » par pi)&nbsp ;</td><td>Braintree Scientific</td><td>MRE01050</td><td></td></tr><tr><td>Suture fermante</td><td>VWR</td><td>95057-036</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Piramal</td> Chlorure de <td></td><td></td></tr><tr><td>2,3,5-triphényltétrazolium</td><td>FisherScientific</td><td>50-121-8005</td><td></td></tr></tbody></table>

souris microchirurgie infusion technique pour ciblée substance livraison dans le snc via l'artère carotide interne

Mouse Microsurgery Infusion Technique for Targeted Substance Delivery into the CNS via the Internal Carotid Artery

Les modèles animaux de maladies du système nerveux central (SNC) et, par conséquent, de maladies de rupture de la barrière hémato-encéphalique, nécessitent l’administration de substances exogènes dans le cerveau. Ces substances exogènes peuvent induire un impact préjudiciable ou constituer une stratégie thérapeutique. Les méthodes d’administration les plus courantes de substances exogènes dans le cerveau sont basées sur des accouchements systémiques, tels que les voies sous-cutanées ou intraveineuses. Bien que couramment utilisées, ces approches présentent plusieurs limites, notamment une faible efficacité d’administration dans le cerveau. En revanche, les méthodes chirurgicales qui délivrent localement des substances dans le SNC sont plus spécifiques et empêchent l’absorption des substances exogènes par d’autres organes. Plusieurs méthodes chirurgicales pour l’accouchement du SNC sont disponibles ; Cependant, ils ont tendance à être très traumatisants. Ici, nous décrivons une technique de microchirurgie par perfusion de souris, qui délivre efficacement des substances dans le cerveau via l’artère carotide interne, avec un traumatisme minimal et sans interférence avec le fonctionnement normal du SNC.

La technique de microchirurgie d'infusion de souris décrit ici est très polyvalent et a été utilisé pour délivrer différentes substances directement dans le cerveau, y compris la fourniture des cellules tumorales dans un modèle représentatif de la formation de métastases cérébrales 1, 12. Cette technique est également adaptée pour évaluer les aspects pathologiques de d...

Le présent protocole décrit une technique de perfusion de microchirurgie chez la souris, qui délivre efficacement des substances directement dans le cerveau via l’artère carotide interne.

Souris microchirurgie Infusion Technique pour ciblée Substance Livraison dans le SNC via L'artère carotide interne

Animal models of central nervous system (CNS) diseases and, consequently, blood-brain barrier disruption diseases, require the delivery of exogenous ...

L’objectif global de cette technique chirurgicale est d’administrer des substances exogènes dans le cerveau de la souris sans pénétrer dans le crâne. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés en neurosciences concernant l’action des médicaments, des agents pathogènes et des exosomes dans le cerveau. Le principal avantage de cette technique est qu’elle cause un traumatisme minimal à l’animal, préserve l’intégrité du réseau neuronal et atteint des concentrations élevées de la substance dans le cerveau.Commencez par administrer de l’isoflurane mélangé à de l’oxygène pour anesthésier la souris dans une chambre d’induction. Après l’induction de l’anesthésie, transférez l’animal sur la surface chirurgicale sous un stéréomicroscope et placez le cône nasal pour maintenir un plan chirurgical d’anesthésie. Assurez-vous que la fréquence respiratoire est d’environ une à deux respirations par seconde sans haleter.De plus, assurez-vous que l’animal ne réagit pas à la stimulation des moustaches ou à un pincement des orteils. À l’aide d’un écouvillon stérile, appliquez une goutte de lubrifiant ophtalmique sur chaque œil pour prévenir la sécheresse. Après avoir rasé le site chirurgical avec un rasoir, préparez la zone avec de l’éthanol à 70 % et de la chlorhexidine.Tout en regardant au microscope stéréoscopique, utilisez des ciseaux chirurgicaux et des pinces pour créer une incision médiane dans le cou, du haut du sternum jusqu’en dessous de la mâchoire. Utilisez des pinces pour séparer soigneusement le tissu adipeux et conjonctif afin d’exposer la trachée. Placez ensuite un objet mou et rond d’environ cinq centimètres de diamètre sous l’arrière du cou pour étendre le cou et exposer davantage la zone.Ensuite, séparez le tissu autour de la trachée à l’aide de crochets ou d’un écarteur de tissu. Sur le côté gauche de la trachée, épilez soigneusement le tissu conjonctif pour exposer l’artère carotide commune gauche, ou ACC. À l’aide d’une pince, retirez soigneusement tout le tissu conjonctif pour exposer la bifurcation de l’ACC au début des artères carotides externe et interne.Une fois que l’ECA et l’ICA sont exposés, utilisez des pinces pour placer un segment de suture en nylon d’un centimètre sous l’artère carotide externe. Placez ensuite un deuxième segment d’un centimètre. Faites ensuite un nœud permanent au point le plus haut possible de l’ECA.Au point le plus bas possible de l’ECA, immédiatement au-dessus de la bifurcation de l’ACC, faites un nœud amovible plus lâche. Ensuite, utilisez des clips de récipient pour fermer le CCA au point le plus bas possible et pour fermer l’ICA. Fermer correctement l’artère carotide interne avant de faire une petite incision dans l’artère carotide externe empêchera les saignements.Maintenant, à l’aide de ciseaux à ressort de microdissection, faites une coupe de deux millimètres dans l’ECA entre les deux nœuds. Il est important de garder les coupures petites, car une grande coupure provoquera une fuite de la substance à perfuser. Assemblez le système de perfusion en fixant six pouces de tube capillaire à une seringue à tuberculine contenant 250 microlitres de la substance à perfuser.Ensuite, insérez doucement l’extrémité du tube capillaire dans l’incision de l’ECA. Continuez à avancer la pointe jusqu’à ce qu’elle atteigne la moitié entre la bifurcation et le clip sur le CCA. Attachez le nœud ECA inférieur.Vérifiez que le nœud est suffisamment lâche pour permettre la fluidité capillaire et suffisamment serré pour éviter les fuites. Ensuite, retirez le clip de l’ICA. Appliquez doucement une pression sur le piston de la seringue, permettant une perfusion de la substance à environ 10 microlitres par seconde.Après la perfusion de la substance d’essai, remettez le clip sur l’ICA. Retirez délicatement le tube capillaire. Ensuite, attachez complètement le nœud ECA inférieur.Retirez le clip de l’ICA et du CCA. Retirez ensuite l’écarteur ou les crochets en tissu et l’oreiller. Nettoyez la zone à suturer avec une solution saline stérile, puis fermez l’incision à l’aide de sutures en nylon.Après avoir administré un agent anti-inflammatoire et un analgésique approuvés pour soulager l’inconfort postopératoire, placez l’animal dans une cage sur un coussin chauffant pendant au moins une heure et surveillez la récupération. Cet histogramme démontre la détection du VIH par PCR en temps réel sept jours après la perfusion virale via l’artère carotide interne gauche. Comme prévu, les niveaux du virus sont plus élevés dans l’hémisphère gauche.Cette image d’immunofluorescence montre une coupe du cerveau d’une souris représentant l’étiquette GFP CD63, un marqueur d’exosome, après perfusion de vésicules extracellulaires via l’artère carotide interne. Les vésicules extracellulaires exprimant CD63, en vert, sont associées au microvaisseau cérébral de la souris. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en 20 minutes si elle est exécutée correctement.Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine des maladies neurodégénératives pour explorer les interactions entre les médicaments, les agents pathogènes et les exosomes chez la souris.

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Comme neurosciences enquête devient plus sophistiquée, l'enquête sur les structures du cerveau et des circuits exige des niveaux améliorés de précision et une résolution plus élevée. Nous avons développé une méthode pour la préparation et l'implantation d'un système de perfusion chronique dans le cerveau en utilisant un microcanule borosilicate avec un diamètre de pointe de 50 microns.

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Source : Zamboni, M., et al., Induction de la modification des cellules leptoméningées par injection intracisternale. J. Vis. Exp. (2020)Cette vidéo montre la procédure d’administration d’un médicament inducteur dans la citerne magna d’une souris anesthésiée. L’injection induit sélectivement l’expression de marqueurs fluorescents dans les cellules de surface du cerveau accessibles via le liquide céphalo-rachidien, confirmée par l’imagerie par fluorescence.

Administration ciblée de médicament dans un modèle murin par injection de citerne magna

Source : Lim, M.,  et al. Modélisation des métastases cérébrales par injection de cellules cancéreuses dans l’artère carotide interne. J. Vis. Exp. (2022)Dans cette vidéo, une souris anesthésiée subit une intervention chirurgicale au cours de laquelle des cellules cancéreuses sont injectées dans l’artère carotide commune (ACC) pour faciliter l’administration ciblée au cerveau. La procédure implique une suture précise et une manipulation des artères carotides pour diriger les cellules injectées...

Modélisation des métastases tumorales cérébrales par injection interne de cellules cancéreuses dans l’artère carotide

Source : Leda, A. R., et al. Technique de perfusion de microchirurgie chez la souris pour l’administration ciblée de substances dans le SNC via l’artère carotide interne. J. Vis. Exp. (2017)Cette vidéo présente une procédure microchirurgicale conçue pour faciliter la perfusion ciblée d’une substance testée dans le cerveau via l’artère carotide interne (ICA). La procédure implique une suture précise et une manipulation vasculaire pour restreindre temporairement le flux sanguin, assurant ainsi...

Administration ciblée de substances au cerveau de la souris par perfusion dans l’artère carotide interne

Rupture de la barrière hémato-encéphalique facilite la prestation de certains médicaments vers le cerveau. Mannitol livré intra-artérielle se rétrécit cellules entourant les vaisseaux sanguins afin de perturber physiquement la barrière.

Modèle Rat de rupture de la barrière hémato-encéphalique pour permettre ciblée Therapeutics neurovasculaire

métastases cérébrales est devenu un besoin médical non satisfait urgent que son incidence a augmenté tandis que les options thérapeutiques sont restés palliatifs. La création de modèles animaux expérimentaux de métastases cérébrales par injection artérielle intracarotidienne des cellules cancéreuses facilite les études mécanistiques de la biologie de la maladie et l' évaluation de nouveaux schémas d'intervention.

Intracarotidienne Cancer Cell Injection pour produire des modèles de souris de Brain Métastase

Une méthode pour fournir des cellules souches neurales, adaptable pour injecter des solutions ou des suspensions, par l’artère carotide commune (souris) ou l’artère carotide externe (rat) après un AVC ischémique est rapporté. Les cellules injectées sont réparties largement dans tout le parenchyme cérébral et peuvent être détectées jusqu’à 30 d après l’accouchement.

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Les métastases cérébrales sont une cause de morbidité et de mortalité sévères chez les patients atteints de cancer. La plupart des modèles murins de métastases cérébrales sont compliqués par des métastases systémiques confondant l’analyse de la mortalité et des résultats des interventions thérapeutiques. Présenté ici est un protocole pour l’injection carotidienne interne de cellules cancéreuses qui produit des tumeurs intracrâniennes cohérentes avec des tumeurs systémiques minimales.

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La réparation de l’artère intracarotide dans un modèle murin après injection ramène le flux sanguin vers l’artère sans affecter négativement la distribution du matériau injecté. La réparation du site d’injection facilite les injections ultérieures par la même artère et prévient l’ischémie cérébrale chez les souches de souris qui n’ont pas un cercle complet de Willis.

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Ici, nous présentons un protocole pour évaluer la fonction des cellules immunitaires après un AVC ischémique à l’aide de l’analyse cytométrique en flux dans un modèle de mini-AVC. Cette méthode permet un examen détaillé des interactions neuro-immunes et peut être adaptée à l’étude d’autres maladies neurodégénératives, améliorant ainsi notre compréhension des réponses immunitaires dans la pathologie de l’AVC.

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