Un modèle In Vitro pour étudier la Transformation cellulaire par Herpesvirus sarcome de Kaposi

L’objectif global de cette procédure est de préparer une simulation d’âge et de passage dans les cellules endothéliales infectées par le KSHV afin de permettre l’étude des changements associés au KSHV dans l’expression des gènes de la cellule hôte, y compris les altérations entraînant une transformation maligne, dans le contexte de contrôles appropriés. Cette méthode peut aider à définir les principaux changements physiopathologiques de la biologie des cellules hôtes qui conduisent aux cancers associés au KSHV, identifiant ainsi de nouvelles cibles thérapeutiques pour la prévention ou le traitement des maladies. Le principal avantage de ce système est que la transformation maligne des cellules endothéliales suite à une infection par le KSHV se produit rapidement et de manière reproductible, ce qui permet d’étudier les événements précoces du processus oncogénique avec des cellules témoins appariées selon l’âge et le passage.

Bien que ce modèle d’oncogenèse virale puisse donner un aperçu du développement du sarcome de Kaposi, il peut également être appliqué à d’autres types de cancer. Étant donné que le sarcome de Kaposi est une tumeur vasculaire, les implications de ce modèle de culture cellulaire s’étendent à la compréhension d’autres processus pathologiques induits par l’angiogenèse pathologique. Pour commencer, préparez et filtrez le tampon TNE stérilisé comme décrit dans le protocole texte.

Conservez ensuite la solution à quatre degrés Celsius. Cultivez la lignée cellulaire de lymphome à épanchement primaire négatif BCBL-1 dans une fiole T150 remplie de 60 millilitres de milieu RPMI. Maintenez les cellules à 37 degrés Celsius 5 % de dioxyde de carbone pour obtenir une suspension d’environ 1 à 1,2 fois 10 à six cellules par millilitre.

Une fois la densité appropriée atteinte, divisez les cellules une à deux avec un milieu frais et ajoutez du PMA à une concentration finale de 20 nanogrammes par millilitre pour induire la production de KSHV. Ensuite, incubez les cultures pendant cinq jours. Après cinq jours d’incubation, récoltez les particules virales en faisant tourner les suspensions cellulaires à 300 fois g pendant cinq minutes à température ambiante.

Transférez ensuite les surnageants dans un nouveau tube. Centrifugez à nouveau les surnageants à 2 500 fois g à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes pour éliminer les débris cellulaires. Maintenant que cela est clarifié, superposez cinq millilitres de solution de saccharose à 25 % dans du TNE avec environ 30 millilitres de surnageant dans six tubes d’ultracentrifugation.

Centrifugez les tubes équilibrés à 75 000 fois g pendant deux heures à quatre degrés Celsius sous vide. Une fois la centrifugation terminée, décantez le surnageant et épongez le bord de chaque tube pour éliminer autant de liquide que possible. Ensuite, remettez le virus granulé en suspension dans 150 microlitres de tampon TNE et regroupez tous les échantillons.

Mélangez soigneusement la suspension accumulée et divisez-la en 25 aliquotes de microlitres. Stockez le virus à moins 80 degrés Celsius. Cultiver des cellules endothéliales microvasculaires ou lymphatiques primaires du derme humain dans un milieu EGM dans une fiole T75.

Maintenez la culture cellulaire à 37 degrés Celsius 5 % de dioxyde de carbone jusqu’à ce qu’environ 50 % de confluence soit atteinte. Avant la transduction des cellules endothéliales, cultivez les cellules PA317 LXSN 16E6E7 dans un flacon de culture cellulaire T150 rempli de 20 millilitres de DMEM à 37 degrés Celsius 5 % de dioxyde de carbone. Une fois qu’environ 90 % de confluence est atteint, remplacez le milieu de culture cellulaire PA317 par 16 millilitres de milieu frais et incubez les cellules pendant la nuit.

Après une nuit d’incubation, prélever le milieu de la culture cellulaire PA317 et le clarifier par centrifugation à 300 fois g pendant cinq minutes à température ambiante. Remplacez le milieu EGM issu d’une culture de cellules endothéliales confluentes à 50 % par 12 millilitres de milieu PA317 clarifié. Incuber les cellules pendant quatre heures.

Remplacez ensuite six millilitres de milieu PA317 par six millilitres de milieu EGM frais et incubez les cellules pendant la nuit. Ensuite, retirez le milieu de la culture cellulaire endothéliale et nourrissez les cellules avec 12 millilitres d’EGM frais. Continuez à incuber les cellules pendant 48 heures supplémentaires.

Pour sous-cultiver des cellules endothéliales, retirez le milieu et lavez les cellules avec 12 millilitres de PBS sans cations. Ajoutez ensuite trois millilitres d’une solution commerciale de dissociation enzymatique et incubez les cellules à 37 degrés Celsius pendant trois minutes. Transférez la suspension cellulaire dans un tube conique de 15 millilitres et centrifugez les cellules à 300 fois g pendant cinq minutes à température ambiante.

Une fois granulés, remettez les cellules en suspension dans un milieu EGM frais et divisez la suspension uniformément en trois flacons T75. Ajustez le volume des cultures à 12 millilitres d’EGM par flacon. Ajoutez ensuite 200 microgrammes par millilitre de G418 pour sélectionner les cellules endothéliales transduites.

Récoltez les cellules endothéliales traduites par digestion enzymatique comme indiqué précédemment. Remettre en suspension la pastille de cellules endothéliales dans un millilitre de milieu EGM. Mélangez ensuite cinq microlitres de suspension cellulaire avec 45 microlitres de solution de bleu de trypan et comptez les cellules viables à l’aide d’un hémocytomètre.

Grainez 2,5 fois 10 à la cinquième cellules viables dans deux millilitres de milieu EGM par puits d’une plaque à six puits. Le lendemain, retirez le milieu EGM et lavez les cellules de chaque puits avec trois millilitres de PBS avec du calcium et du magnésium. Ajoutez ensuite deux millilitres de milieu EBM dans chaque puits.

Pour infecter les cellules avec le KSHV, ajoutez cinq à 20 microlitres de stock de virus dans chaque puits et faites tourner la plaque pour mélanger les suspensions. Ajoutez un volume égal de tampon TNE à chaque puits contenant des cellules faussement infectées. Après avoir centrifugé la plaque à 400 fois g pendant 30 minutes à température ambiante, incubez-la à 37 degrés Celsius pendant 90 minutes.

Ajoutez ensuite deux millilitres de milieu EGM dans chaque puits et incubez les cultures pendant la nuit. Après l’incubation, retirez le milieu EGM de chaque puits et remplacez-le par deux millilitres d’EGM frais. Lorsque les cellules atteignent une confluence d’environ 90 %, récoltez-les par digestion enzymatique comme indiqué précédemment.

Regroupez les cellules de trois puits dans une fiole T75 étiquetée avec le numéro de passage total dans le passage après l’infection. Avant le test ou la congélation, élargissez les cultures de cellules endothéliales simulées et infectées par le KSHV en les divisant de un à trois pour au moins deux passages supplémentaires. Voici une image microscopique de cellules endothéliales confluentes faussement infectées révélant l’aspect classique des pavés.

La division cellulaire dans ces cellules est inhibée au contact lorsque la culture atteint la confluence. Les cellules endothéliales infectées par le KSHV développent une morphologie allongée en forme de fuseau qui rappelle les cellules fusiformes du sarcome de Kaposi. Contrairement aux cellules infectées par des simulacres, les cellules endothéliales infectées par le KSHV continuent de proliférer même lorsqu’elles atteignent la confluence, ce qui entraîne le développement de foyers cellulaires multicouches.

Lorsqu’elles perdent le contact avec le substrat, les cellules endothéliales faussement infectées subissent une mort cellulaire apoptotique, anoikis, et elles ne forment pas de colonies dans la gélose molle. Au contraire, les cellules infectées par le KSHV sont résistantes à l’anoikis et aux colonies en croissance lorsqu’elles sont cultivées dans une gélose molle. Le développement de la morphologie fusiforme dans les cellules endothéliales infectées par le KSHV s’accompagne de l’expression de la protéine de latence virale ORF73 et, dans une moindre mesure, d’un facteur de processivité virale ORF59.

Lorsqu’elles sont infectées par le KSHV BAC16 marqué d’une protéine fluorescente verte, les cellules endothéliales développent une morphologie en forme de fuseau et démontrent l’expression de la GFP, confirmant la relation fortuite entre l’infection par le KSHV dans le phénotype observé. Après son développement, ce modèle de culture cellulaire a ouvert la voie aux chercheurs pour évaluer les altérations de l’ARNm de la cellule hôte et de l’expression des protéines induites par l’infection par le KSHV. Par conséquent, des mécanismes pathogènes clés sous-jacents à l’oncogenèse médiée par le KSHV représentant des cibles thérapeutiques prometteuses ont été identifiés.

N’oubliez pas que le KSHV est un agent BSL-2 et qu’il doit être manipulé selon les procédures et les pratiques de confinement de biosécurité appropriées.