3D quantitative In Silico Modélisation (q3DISM) de Cerebral bêta-amyloïde phagocytose dans les modèles rongeurs de la maladie d'Alzheimer

L’objectif global de cette modélisation quantitative 3D in silico, ou technique q3DISM, est de quantifier l’absorption de la bêta-amyloïde par les phagocytes mononucléaires dans le cerveau de modèles de rongeurs de la maladie d’Alzheimer. Cette méthode répond à un besoin pressant dans le domaine de la recherche sur la maladie d’Alzheimer de quantifier la clairance de la bêta-amyloïde qui se dépose dans le cerveau des patients atteints de la maladie d’Alzheimer et qui forme des plaques séniles. Pour la première fois, cette technique permet une véritable reconstruction 3D et une quantification de la bêta-amyloïde par les macrophages in vivo. Nous avons commencé à utiliser le 3Disme inspiré pour étudier le dépôt de bêta-amyloïde parce que nous avions besoin d’un outil robuste pour visualiser et quantifier la phagocytose des microphages in vivo.

Cette technique pourrait s’avérer utile pour tester des traitements expérimentaux de la maladie d’Alzheimer afin d’évaluer quels médicaments stimulent les macrophages pour l’élimination efficace de la bêta-amyloïde. Lorsque les échantillons de tissus sont prêts pour l’immunomarquage, remplissez la région tissulaire entourée d’un stylo de barrière hydrophobe avec un tampon de blocage pour une incubation d’une heure à température ambiante dans une chambre humidifiée. À la fin de l’incubation, remplacez le tampon de blocage par le premier anticorps primaire d’intérêt pendant la nuit à 4 degrés Celsius dans la chambre humidifiée.

Le lendemain matin, lavez les échantillons dans trois bains PBS de cinq minutes à température ambiante avec une légère agitation. Après le troisième lavage, incubez les lames avec l’anticorps secondaire fluorescent approprié à température ambiante à l’abri de la lumière. Au bout d’une heure, lavez les sections trois fois de plus dans du PBS à l’abri de la lumière.

Ensuite, marquez les cellules avec les autres anticorps primaires et secondaires d’intérêt appropriés aux tissus au cours des deux à quatre prochains jours, comme nous venons de le démontrer. Pour colorer efficacement les compartiments cellulaires et supercellulaires et les dépôts de bêta-amyloïde, il est crucial de marquer avec un seul anticorps primaire à la fois suivi de l’anticorps secondaire correspondant. Un processus chronophage mais qui permet d’optimiser les résultats.

Après le dernier lavage de la coloration secondaire des anticorps, laissez les sections sécher complètement pendant la nuit à température ambiante dans l’obscurité. Ensuite, recouvrez les échantillons séchés d’une lamelle scellée par un support de montage fluorescent contenant du DAPI. Pour imager les échantillons par microscopie confocale, sélectionnez l’objectif du microscope 60x et ajoutez de l’huile d’immersion dans l’objectif.

Placez l’échantillon sur le support de lame de la platine du microscope et soulevez l’objectif jusqu’à ce que l’huile entre en contact avec la lame. À l’aide d’un éclairage épifluorescent, ajustez le plan focal pour localiser les plaques amyloïdes dans l’hippocampe ou le cortex cérébral. Ensuite, acquérez des images confocales des phagocytes mononucléaires activés entourant les dépôts amyloïdes dans l’hippocampe ou le cortex.

Pour une modélisation qualitative 3D in silico, analysez d’abord les ensembles de données confocales avec un traitement d’image 3D scientifique dans un module de colocalisation de logiciel d’analyse pour la proximité spatiale de la coloration du marqueur de macrophage activé dans tous les plans Z simultanément. Créer des canaux de colocalisation qui correspondent à la coloration des phagolysosomes dans les phagocytes mononucléaires activés. Sélectionnez TRITC pour le canal A et FITC pour le canal B.In la fenêtre de vérification de mode, sélectionnez Seuil.

Pour les intensités de colocalisation, sélectionnez Canaux source. Cliquez sur Modifier pour sélectionner la couleur de colocalisation. Ajustez ensuite les seuils de chaque canal indépendamment pour inclure la coloration spécifique et exclure les signaux d’arrière-plan et non spécifiques.

Les voxels colocalisés apparaîtront dans la couleur de colocalisation sélectionnée dans toutes les piles z simultanément. Ensuite, cliquez sur Créer un canal de colocalisation. Le canal de colocalisation créé apparaîtra dans la fenêtre de réglage de l’affichage.

Cliquez sur le canal de colocalisation pour ouvrir les statistiques du canal. Le pourcentage de matériel volumique A au-dessus du seuil colocalisé représente le volume monocytaire occupé par les phagolysosomes. À l’aide du module de colocalisation, analysez la proximité spatiale du canal de colocalisation avec les signaux bêta-amyloïdes afin de quantifier le bêta-amyloïde encapsulé dans les phagolysosomes.

Sélectionnez l’ensemble de données de colocalisation du canal A et Cy5 pour le canal B et créez un canal de colocalisation comme illustré ci-dessus. Cliquez sur le canal de colocalisation pour ouvrir à nouveau les statistiques du canal. Le pourcentage de matériel volumique A au-dessus du seuil colocalisé représente le volume phagolysosomal occupé par la bêta-amyloïde.

À l’aide du module Surpass, reconstruisez les piles d’images confocales et générez des modèles 3D de la bêta-amyloïde encapsulée dans les phagolysosomes monocytaires. Dans la fenêtre Réglage de l’affichage, sélectionnez TRITC pour afficher uniquement la coloration des macrophages, puis cliquez sur Ajouter une nouvelle surface" dans les propriétés du volume. Sous Paramètres, à la première étape sur cinq, algorithme, sélectionnez Surface.

Dans Couleur, sélectionnez le type de couleur qui vous intéresse et ajustez la transparence comme il convient. Cochez ensuite la case Sélectionner la région d’intérêt et cliquez sur Suivant. À l’étape deux sur cinq, région d’intérêt, ajustez les coordonnées X, Y et Z pour dessiner une fenêtre autour de la cellule d’intérêt et cliquez sur suivant.

À l’étape trois sur cinq, Canal source, sélectionnez le canal source TRITC et cochez la case Lisser. Réglez le niveau de détail de la surface sur 0,4 micron et cliquez sur Suivant. À l’étape quatre sur cinq, seuil, ajustez le seuil de sorte que le volume créé chevauche parfaitement le signal du canal TRITC et cliquez sur suivant.

Enfin, à l’étape cinq sur cinq, classer les surfaces, dans la section Types de filtres, sélectionnez les objets en fonction de leur taille à inclure ou à exclure des volumes à créer. Répétez les mêmes étapes pour créer des surfaces 3D pour les phagolysosomes avec le canal FITC et la bêta-amyloïde avec le canal Cy5. Après une modélisation qualitative 3D in silico, comme cela vient d’être démontré, l’absorption de la bêta-amyloïde dans les phagolysosomes monocytaires dans le cerveau de souris et de rats transgéniques peut être analysée.

Il est intéressant de noter que le volume occupé par les phagolysosomes CD68 positifs est significativement augmenté dans les phagocytes mononucléaires positifs à Iba1, associés à des souris et des rats par rapport aux plaques éloignées, démontrant que les phagocytes mononucléaires près des plaques sont prêts pour la phagocytose, par rapport aux cellules situées loin des plaques. Il convient également de noter que les phagocytes mononucléaires associés aux plaques présentent une augmentation de l’absorption de la bêta-amyloïde chez les souris transgéniques par rapport aux cellules éloignées des plaques, tandis que chez les rats transgéniques, une absorption très modeste des fibrilles bêta-amyloïdes est observée dans l’ensemble, sans changement apparent de la phagocytose des fibrilles bêta-amyloïdes en fonction de la distance des plaques. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler que la qualité des images confocales est cruciale et que des seuils similaires doivent être appliqués pour tous les canaux lors de l’analyse de colocalisation.

Depuis son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la neuroinflammation pour explorer les événements phagocytaires dans le cerveau de modèles de rongeurs de la maladie d’Alzheimer. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’étiqueter les sections de cerveau des rongeurs pour les phagocytes mononucléaires, le phagolysosome et la bêta-amyloïde. Quantifier la phagocytose de la bêta-amyloïde cérébrale en 3D in vivo.