Name: 3D quantitative In Silico Modélisation (q3DISM) de Cerebral bêta-amyloïde phagocytose dans les modèles rongeurs de la maladie dAlzheimer (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 33 s
Description: Découvrez la technique q3DISM pour modéliser la phagocytose de l'amyloïde-bêta par les phagocytes mononucléés dans les modèles rongeurs de la maladie d'Alzheimer. Cette méthode permet une reconstruction 3D quantitative in vivo.

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M-V. G-S. est soutenu par une bourse de recherche sur la maladie d’Alzheimer de la Fondation BrightFocus (A2015309F) et une bourse de jeune chercheur de l’Alzheimer’s Association, California Southland Chapter. T.M.W. est soutenu par une fondation ARCS et une bourse postdoctorale commémorative Maggie McKnight Russell-JDFAF de la Fondation John Douglas French Alzheimer’s. Ce travail a été soutenu par le National Institute on Neurologic Disorders and Stroke (1R01NS076794-01, à T.T.), un prix Zenith Fellows de l’Alzheimer’s Association (ZEN-10-174633, à T.T.) et un prix de mi-carrière Julie Martin de l’American Federation of Aging Research/Ellison Medical Foundation pour la recherche sur le vieillissement (M11472, à T.T.). Nous sommes reconnaissants des fonds de démarrage de l’Institut de neurogénétique Zilkha, qui ont contribué à rendre ce travail possible.

Déclaration d&#39;éthique de la recherche: Toutes les expériences impliquant des animaux détaillés ici ont été approuvés par l&#39;Université de Californie du Sud Institutional Animal Care et utilisation Commission (IACUC) et réalisée en stricte conformité avec les instituts nationaux de lignes directrices de santé et des recommandations de l&#39;Association pour l&#39; évaluation et l&#39; accréditation des laboratoires animal Care international. 1. Rongeur Isolement du cerveau et préparation pour immunocoloration JOUR 1: <ol><li> Placez rats TgF344-AD âgés (14-month-old) ou APP / PS1 souris (12-month-old) sous anesthésie isoflurane profonde continue (4%). Évaluer la profondeur de l&#39;anesthésie par pincement de l&#39;orteil et l&#39;absence de réflexe de retrait. </li><li> Couper à travers les deux côtés de la cage thoracique et soulever pour exposer le cœur. Insérez une aiguille 23 G dans le ventricule gauche du cœur et de faire une petite incision dans l&#39;oreillette droite. Passez à l&#39;exsanguination par perfusion transcardial avec un tampon phosphate salin glacé(PBS) en utilisant une pompe péristaltique (30 ml pour les souris; 150-200 ml pour les rats). </li><li> Faire une incision médiane caudale dans la peau et déplacer la peau et le muscle de côté. Couper à travers le sommet du crâne, le long de la ligne médiane et entre les yeux. Retirez les plaques osseuses et d&#39;isoler l&#39;ensemble du cerveau du crâne. </li><li> Placez le cerveau dans une matrice rongeur du cerveau coronal et couper en quartiers. Incuber quarts postérieurs O / N (16 h) dans paraformaldehyde fixateur (4% PFA dans du PBS) à 4 ° C. Laver 3x dans du PBS, puis transfert à l&#39;éthanol à 70%. Attention: PFA est toxique et doit être manipulé sous une hotte chimique avec des équipements de protection individuelle approprié. </li></ol> JOUR 2: <ol start="5"><li> Placer quarts du cerveau dans des cassettes d&#39;enrobage et déshydrater progressivement dans les tissus successivement plus concentrées, 1 h bains d&#39;éthanol (70%, 80%, 95% et 100% x 3). </li><li> Effacer l&#39;éthanol à partir du tissu avec trois successifs bains de xylène 100% (1 h chacun). Attention: Xylène est toxique et should être traitées sous une hotte chimique avec des équipements de protection individuelle approprié. </li><li> Incluez tissu dans des blocs de paraffine après deux bains fondus de cire de paraffine (56-58 ° C, 90 min chacun). </li></ol> JOUR 3: <ol start="8"><li> Couper 10 sections um d&#39;épaisseur de cerveaux de paraffine en utilisant un microtome. sections Tremper dans un bain d&#39;eau (50 ° C pendant 1 min) et d&#39;appliquer des lames de microscope. Laissez les diapositives sécher O / N, assurant l&#39;adhérence des tissus à la diapositive. </li></ol> 2. immunocoloration Remarque: Les différentes combinaisons d&#39;anticorps peuvent être utilisés pour la procédure de coloration décrit ci-dessous. Un cocktail d&#39; anticorps compatibles avec les tissus cérébraux provenant de rats et de souris sont indiquées dans le tableau 1. JOUR 4: <ol><li> sections Déparaffiner du cerveau en utilisant 2x 100% bains de xylène (12 min chacun). </li><li> Réhydrater les coupes de cerveau dans des bains successifs d&#39;éthanol - 100% pendant 10 minutes, 95% pendant 5 minutes, 80% pendant 10 min, et enfin 70% pendant 15 min - followed par des lavages 3x PBS [5 min à température ambiante, avec une légère agitation]. Pendant ce temps, la solution de récupération d&#39;antigène de chaleur à 95-97 ° C sur une plaque chauffante avec barreau magnétique d&#39;agitation. </li><li> Incuber des coupes de cerveau dans une solution de récupération d&#39;antigène à 95-97 ° C pendant 30 min. Ensuite, lavez 3x dans du PBS (5 min à température ambiante, avec une légère agitation). </li><li> Rapidement diapositives sèches à l&#39;aide des essuie-tâche délicate pour éviter le séchage des tissus, et d&#39;en tirer une barrière hydrophobe autour de la zone de tissu avec un stylo à barrière hydrophobe. Remplir la région de tissu entouré d&#39;un tampon de blocage [PBS contenant 0,3% de Triton X-100 et 10% de sérum d&#39;âne normal (PDN)] et incuber à température ambiante pendant 1 heure dans une chambre humidifiée. </li><li> Remplacer le tampon de blocage avec l&#39;anticorps primaire Iba1 (dilué dans du tampon de blocage) pour marquer phagocytes mononucléés, et laisser incuber O / N à 4 ° C dans une chambre humidifiée. Pour les hôtes d&#39;anticorps et des dilutions de travail, voir le tableau 1 et la Table des matières. </li></ol> JOUR 5: <ol start="6"><li> Rinceranticorps primaire avec des bains 3x PBS (5 min à température ambiante avec une légère agitation). Incuber avec l&#39;anticorps fluorescent secondaire (conjugué à un fluorophore émission 594 nm) pendant 1 h (dans un tampon de blocage à température ambiante dans l&#39;obscurité), suivie par des bains 3x PBS (5 min à température ambiante avec une légère agitation). A ce moment, de maintenir des sections dans l&#39;obscurité pour éviter fluorescent signal de blanchiment. </li></ol> JOUR 6 - 7: <ol start="7"><li> Répéter les étapes 2.5 et 2.6 avec CD68 (cerveaux de rats) ou LAMPE1 (tissu de souris) et des anticorps secondaires appropriés (couplé à un fluorophore émission 488 nm) pour étiqueter les phagolysosomes. </li></ol> Jour 7 - 8: <ol start="8"><li> Répéter les étapes 2.5 et 2.6 avec OC (tissu de rat) ou 4G8 (Les cerveaux de souris) et des anticorps secondaires appropriés (couplé à un fluorophore 647 nm) pour marquer des dépôts de Aß. NOTE: En variante, l&#39;anticorps 6E10 peut être utilisé avec succès à la fois sur les tissus de la souris et le rat. Pour les combinaisons appropriées d&#39; anticorps, voir la Table des Matières </strong&gt;. </li><li> Autoriser les sections à complètement O sec / N à la température ambiante dans l&#39;obscurité. Ensuite, la couverture des spécimens avec une lamelle scellée par un milieu de montage de fluorescence contenant DAPI. </li></ol> 3. Acquisition de Grande Z-stack confocale datasets Remarque: Ce protocole nécessite un microscope à balayage laser confocal entièrement automatique équipée d&#39;un objectif 60X et 405 nm, 488 nm, 594 nm et 647 nm lasers. Tout le matériel est contrôlé par imagerie et contrôle laser de logiciels. Avant de commencer le protocole d&#39;imagerie, la puissance sur l&#39;ordinateur, lampe épifluorescence, microscope, les lasers et la caméra. JOUR 9: <ol><li> Sélectionnez l&#39;objectif du microscope 60X. Ajouter l&#39;huile d&#39;immersion à la lentille, et placer l&#39;échantillon sur le porte-lame de platine du microscope. Soulever l&#39;objectif jusqu&#39;à ce que l&#39;huile est en contact avec la lame. Ajuster le plan focal pour localiser les plaques d&#39;amyloïde dans l&#39;hippocampe ou du cortex cérébral en utilisant un éclairage à épifluorescence à travers les oculaires. </li><li> Acquérir im confocalâges des phagocytes mononucléaires activées autour de dépôts d&#39;amyloïde dans l&#39;hippocampe ou du cortex de rongeurs par microscopie confocale (grossissement 60X, les étapes z pile: 0,25 um &lt;z &lt;0,40 um, le nombre d&#39;étapes 25 &lt;n &lt;35). </li></ol> 4. q3DISM Remarque: Afin d&#39;obtenir des résultats significatifs, nous vous suggérons de l&#39;analyse d&#39;un minimum de 3 images par animal / région d&#39;intérêt. Pour chaque image, l&#39;abondance des cellules à analyser peut varier en fonction des paradigmes expérimentaux. Dans les résultats représentatifs indiqués dans le présent rapport, nous avons analysé 3 cellules / état (par exemple, les phagocytes mononucléaires éloignés ou associés à des plaques; voir les figures 1C - D et 2C - D). JOUR 10: <ol><li> Analyser les ensembles de données confocale avec colocalisation traitement de l&#39;image 3D et analyses scientifiques logiciels (coloc) module pour la proximité spatiale des Iba1 / CD68 (de tissu de rat) ou Iba1 / LAMP1 (tissu de la souris) coloration dans tous les z-plans simultanément.Créer Iba + / CD68 + ou + Iba / LAMPE1 + colocalisation canaux qui correspondent à phagolysosomes dans les phagocytes mononucléaires activées. <ol><li> Sélectionnez TRITC pour le canal A (correspondant à Iba1 coloration couplée à 594 nm fluorophore) et FITC pour le canal B (correspondant à CD68 ou LAMP1 coloration couplée à 488 nm fluorophore). Sur le côté droit de la fenêtre du logiciel pour &#39;vérification de mode,&#39; &#39;seuil &quot;, sélectionnez et pour&#39; intensités de Coloc&quot;, sélectionnez &quot;canaux de source». </li><li> Cliquez sur &quot;Modifier&quot; pour sélectionner &quot;la couleur de coloc &#39;sur le côté droit de la fenêtre du logiciel. </li><li> Pour chaque canal indépendamment, ajuster les seuils d&#39;inclure une coloration spécifique et d&#39;exclure / signaux non spécifiques fond. Une fois ajusté, ne modifiez pas les seuils entre les images pour assurer une analyse impartiale. Les voxels colocalisés (pixels de tous les z-piles) apparaîtront dans la couleur sélectionnée dans l&#39;étape 4.1.2 dans tous les z-piles SIMultaneously. </li><li> Cliquez sur &quot;construire le canal coloc &#39;. Le canal de colocalisation créé apparaîtra dans la fenêtre de réglage de l&#39;affichage. </li><li> Cliquez sur le canal coloc pour ouvrir les statistiques de canal. Le «% du volume / matériau A au dessus du seuil colocalisés &#39;représente le% de signaux (Iba1 voxels correspondant au fluorophore 594 nm) colocalisés avec LAMPE1 ou un signal de CD68 (voxels correspondant à la fluorophore 488 nm). Plus simplement, cela est le volume de monocytes occupé par phagolysosomes (voir les figures 1C et 2C). NOTE: &#39;% du volume / matériau B-dessus du seuil colocalisés&#39; correspond à% du signal de LAMP1 ou CD68 colocalisés avec Iba1. Cela devrait être proche de 100%, comme phagolysosomes sont des structures intracellulaires. Les valeurs sont basées sur le ratio des signaux de tous les z-dessus du seuil des piles colocalisés. </li></ol></li><li> En utilisant le module de coloc, analyser le canal coloc créé à l&#39;étape 4.1 pour la proximité spatiale avec OC (ti ratssu) ou 4G8 (tissu de souris) signaux Aß. Ceci permet une quantification de Aß encapsulé dans phagolysosomes. <ol><li> Sélectionnez le canal Un ensemble de données de coloc (correspondant à la Iba1 / CD68 ou d&#39;un canal Iba1 / LAMPE1 de coloc créé à l&#39;étape 4.1) et Cy5 pour le canal B (correspondant à OC ou 4G8 coloration couplée à 647 nm fluorophore). </li><li> Construire un canal de coloc comme décrit dans les étapes 4.1.2 à 4.1.5. </li><li> Cliquez sur le canal coloc pour ouvrir les statistiques de canal. Le «% du volume / matériau A au dessus du seuil colocalisés &#39;représente le% de Iba1 / ou LAMPE1 Iba1 / CD68 (voxels correspondant à la chaîne construite à l&#39;étape coloc 4.1.5.) Colocalisés avec OC 4G8 ou d&#39;un signal (voxels correspondant à la 647 nm fluorophore). Ceci est le volume occupé par phagolysosomique Aß (voir les figures 1D et 2D). NOTE: &#39;% du volume / matériau B-dessus du seuil colocalisés&#39; correspond% du signal de Aß totale colocalisés avec phagolysosomes.Ceci peut être utilisé pour évaluer la fraction de dépôts de Aß totaux encapsulées dans les phagolysosomes (non représentés dans les présents résultats représentatifs). </li></ol></li><li> Utilisez le module surpasser pour reconstruire les piles d&#39;images confocale et de générer des modèles 3D de Aß encapsulées dans phagolysosomes monocytes. <ol><li> Dans la fenêtre &#39;de réglage de l&#39;affichage &quot;, sélectionnez TRITC (pour montrer que la coloration Iba1). Dans la fenêtre &#39;propriétés de volume », cliquez sur« ajouter une nouvelle surface. </li><li> Dans l&#39;étape «1/5 algorithme», dans les «paramètres», sélectionnez «surface». En outre, dans &quot; la couleur&quot; , sélectionnez le type de couleur dans la palette ou RGB et ajuster la transparence (rouge est fixé à 60% de transparence dans les figures 1B et 2B). Cochez la case &#39;select région d&#39;intérêt ». Cliquez sur Suivant. </li><li> Dans l&#39; étape &#39;2/5 région d&#39;intérêt, «dessiner une fenêtre autour de la cellule d&#39;intérêt en ajustant x, y et z les coordonnées (voir cases blanches dans les figures 1A </strong&gt; et 2A). Cliquez sur Suivant. </li><li> Dans l&#39;étape &#39;3/5 source de canal », sélectionnez le canal source TRITC. Cochez la case «lisse» et régler le niveau de détail de la zone de surface à 0,4 um. Pour &#39;seuillage &quot;, sélectionnez l&#39;intensité absolue. Cliquez sur Suivant. </li><li> Dans l&#39;étape «seuil 4/5, &#39;ajuster seuil de sorte que le volume créé recouvre parfaitement avec le signal de canal TRITC. Cliquez sur Suivant. </li><li> Dans l&#39;étape &#39;5/5 classer surfaces,&#39; dans la section «type de filtre&quot;, sélectionnez les objets en fonction de leur taille à inclure ou à exclure des volumes à créer. Cliquez sur Terminer, exécuter toutes les étapes de création, et quitter l&#39;assistant. </li><li> Répétez les étapes 4.3.1 à 4.3.6 pour créer une surface 3D pour le canal FITC (LAMP1 + ou CD68 + phagolysosomes). </li><li> Répétez les étapes 4.3.1 à 4.3.6 pour créer une surface 3D pour le canal Cy5 (OC + ou dépôts 4G8 + Aß). </li></ol></li></ol>

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</ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à dévoiler.

Le protocole que nous décrivons dans ce rapport pour une véritable quantification 3D de Aß phagocytose in vivo par des phagocytes mononucléaires repose sur un étiquetage spécifique des compartiments cellulaires et intracellulaires ainsi que les dépôts Aß. Plus précisément, on utilise Iba1 (ionisée calcium Binding molécule adaptatrice 1), une protéine qui est impliquée dans fronçage de la membrane et une phagocytose lors de l&#39; activation des cellules 18, 19, pour colorer phag...

Maladie d&#39;Alzheimer (AD), la démence liée à l&#39;âge le plus courant 1, est caractérisée par amyloïde cérébrale-β (Aß) accumulation sous forme de plaques &quot;séniles&quot; ß-amyloïde, chronique neuroinflammation de bas niveau, tauopathie, perte neuronale, et la perturbation cognitive 2 . Dans AD cerveaux de patients, neuroinflammation est affecté par les astrocytes et les phagocytes mononucléaires réactif (appelé microglie, bien que leurs centrales vs. origine périphérique reste incertaine) entourant les dépôts Aß 3. Comme les sentinelles immunitaires innées du SNC, les microglies sont positionnés centralement pour effacer le cerveau Aß. Cependant, le recrutement microglie aux plaques de Aß est accompagnée de très peu, le cas échéant, la phagocytose de Aß 4,5. Une hypothèse est que les microglies sont initialement neuroprotecteur par phagocytozing petits ensembles de Aß. Cependant, par la suite ces cellules deviennent neurotoxiques comme fardeau écrasant Aß et / ou d fonctionnelle liée à l&#39;âgeECLINE, provoque la microglie dans un phénotype proinflammatoire dysfonctionnel, ce qui contribue à la neurotoxicité et déclin cognitif 6. Association récentes Études de génome entier (GWAS) ont identifié un groupe d&#39;allèles à risque AD appartenant aux principaux voies immunitaires innées 7 qui modulent la phagocytose 8-11. Par conséquent, la réponse immunitaire à un dépôt amyloïde cérébrale est devenue un domaine d&#39;intérêt majeur, tant en termes de compréhension AD étiologie et pour développer de nouvelles approches thérapeutiques 12-14. Pourtant, il y a un besoin vital de méthodologie pour évaluer la phagocytose Aß in vivo. Pour répondre à ce besoin non satisfait, nous avons développé 3D quantitative dans la modélisation de silico (q3DISM) pour permettre vrai quantification 3D de phagocytose Aß cérébrale par les phagocytes mononucléaires dans des modèles de rongeurs de la maladie d&#39; Alzheimer-like. Limitée seulement par la mesure dans laquelle elles récapituler les maladies, les modèles animaux ontprouvé une valeur inestimable pour la compréhension de AD pathoetiology et pour évaluer les traitements expérimentaux. Compte tenu du fait que des mutations dans les présénilines (PS) et Amyloid Precursor Protein (APP), des gènes provoquent indépendamment AD autosomique dominante, ces transgènes mutants ont été largement utilisées pour produire des modèles de rongeurs transgéniques. Les souris transgéniques APP / PS1 coexpression simultanément &quot;suédois&quot; APP humaine mutante (APP SWE) et Δ exon 9 mutant de la préséniline 1 humaine (PS1ΔE9) présente avec l&#39; amylose cérébrale accélérée et neuroinflammation 15,16. En outre, nous avons généré des rats bi-transgéniques APP avec co - injectés swe et constructions PS1ΔE9 (ligne TgF344-AD, sur un fond Fischer 344). Contrairement aux modèles de souris transgéniques de l&#39; amylose cérébrale, rats TgF344-AD développent amyloïde cérébrale qui précède tauopathie, perte apoptotique des neurones, et les troubles du comportement 17. Dans ce rapport, nous décrivons un protocole pour immunostaining microglie, phagolysosomes et dépôts de Aß dans des coupes de cerveau de souris APP / PS1 et rats TgF344-AD, et l&#39;acquisition de grandes images confocale z-dimensionnelle. Nous détaillons dans la production et l&#39; analyse des véritables reconstructions 3D à partir des ensembles de données confocale permettant la quantification de Aß absorption dans phagolysosomes microgliales silico. Plus largement, la méthodologie que nous détaillons ici peut être utilisé pour quantifier pratiquement toute forme de phagocytose in vivo.

<table><tbody><tr><td>Isoflurane</td><td>Abbott</td><td>NDC 0044-5260-05</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux de dissection</td><td>VWR</td><td>82027-582</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux de dissection Pointe émoussée</td><td>VWR</td><td>82027-588</td><td></td></tr><tr><td>Pince à épiler</td><td>VWR</td><td>94024-408</td><td></td></tr><tr><td>Aiguille 23 G</td><td>VWR</td><td>BD305145</td><td></td></tr><tr><td>pompe péristaltique FH10</td><td>Thermo Scientific</td><td>72-310-010</td><td></td></tr><tr><td>PBS 10x</td><td>Bioland Scientific</td><td>PBS01-02</td><td>Saline tamponnée au phosphate ; Concentration de travail 1x</td></tr><tr><td>Matrice cérébrale de souris adulte, Coupes coronales, Acier inoxydable 1 mm&nbsp ;</td><td>Kent Scientific</td><td>RBMS-200C</td><td></td></tr><tr><td>Matrice cérébrale de rat adulte, tranches coronales, acier inoxydable 1 mm&nbsp ;</td><td>Kent Scientific</td><td>RBMS-305C&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Solution aqueuse de paraformaldéhyde (PFA) à 32 %</td><td>EMS</td><td>15714-S</td><td>Attention : Toxique. Concentration de travail : 4 % dans PBS</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>VWR</td><td>89125-188</td><td>Concentrations diverses, voir protocole</td></tr><tr><td>Tissue-Tek Uni-cassettes Sakura</td><td>VWR</td><td>25608-774</td><td></td></tr><tr><td>Paraffine d’enrobage et d’infiltration</td><td>VWR</td><td>15147-839</td><td></td></tr><tr><td>Microtome Leica RM2125</td><td>Leica Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lames de microtome jetables&nbsp ;</td><td>VWR</td><td>25608-964</td><td></td></tr><tr><td>Bain-marie Leica HI 1210</td><td>Leica Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micro slide Superfrost plus</td><td>VWR</td><td>48311-703</td><td></td></tr><tr><td>Xylene</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>534056-4X4L</td><td>Attention : Toxique&nbsp ;</td></tr><tr><td>Solution de récupération de cible 10x</td><td>DAKO</td><td>S1699</td><td>Concentration de travail 1x</td></tr><tr><td>KimWipes</td><td>VWR</td><td>21905-026</td><td></td></tr><tr><td>Stylo PAP hydrophobe</td><td>VWR</td><td>95025-252</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>VWR</td><td>97062-208</td><td></td></tr><tr><td>Sérum d’âne normal (NDS)</td><td>Jackson Immuno</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td>Lamelles VWR</td><td></td><td>48393081</td><td></td></tr><tr><td>Réactif anti-décoloration Prolong Gold avec DAPI</td><td>Life Technologies</td><td>P36935</td><td></td></tr><tr><td>Glass Slide Rack</td><td>VWR</td><td>100492-942</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps Iba1 (polyclonal, lapin)</td><td>Wako</td><td>019-19741&nbsp ;</td><td>Concentration de travail 1:200</td></tr><tr><td>Anticorps Iba1 (polyclonal, chèvre)</td><td>LifeSpan Bioscience</td><td>LS-B2645</td><td>Concentration de travail 1:200</td></tr><tr><td>Anticorps CD68 [KP1] de rat (monoclonal, souris)</td><td>Abcam</td><td>ab955</td><td>Concentration de travail 1:200</td></tr><tr><td>souris CD68 [FA-11] anticorps (monoclonal, rat)</td><td>Abcam</td><td>ab53444</td><td>Concentration de travail 1:200</td></tr><tr><td>souris CD107a (LAMP1) anticorps (monoclonal, rat)</td><td>Affymetrix</td><td>14-1071</td><td>Concentration de travail 1:100</td></tr><tr><td>Anticorps bêta-amyloïde, 17 - 24 (4G8) (monoclonal, souris)</td><td>Covance</td><td>SIG-39220</td><td>Concentration de travail 1:200</td></tr><tr><td>Bêta-amyloïde, 1 - 16 (6E10) anticorps (monoclonal, souris)</td><td>Covance</td><td>SIG-39320</td><td>Concentration de travail 1:200</td></tr><tr><td>Anticorps OC (polyclonal, lapin)</td><td>Offert par D. H. Cribbs et C. G. Glabe (UC Irvine)</td><td>Concentration de travail 1:200</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 souris anticorps secondaire</td><td>Invitrogen</td><td>A-11001</td><td>Concentration de travail 1:1 000</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 rat Anticorps secondaire</td><td>Invitrogen</td><td>A-11006</td><td>Concentration de travail 1:1 000</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 lapin anticorps secondaire</td><td>Invitrogen</td><td>A-11037</td><td>Concentration de travail 1:1 000</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 chèvre anticorps secondaire</td><td>Invitrogen</td><td>A-11080</td><td>Concentration de travail 1:1 000</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 Anticorps secondaire</td><td>de souris Invitrogen</td><td>A-21235</td><td>Concentration de travail 1:1 000</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 Anticorps secondaire de lapin</td><td>Invitrogen</td><td>A-21443</td><td>Concentration de travail 1:1 000</td></tr><tr><td>Huile d’immersion</td><td>Nikon&nbsp ;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscope confocal A1</td><td>Nikon²</td> ;<td></td><td></td></tr><tr><td>NIS Elements Advanced Research software</td><td>Nikon·s</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Imaris :Bitplane version 7.6</td> Les modules <td>Bitplane</td><td></td><td>"coloc » et « supass » sont utilisés.&nbsp ; Alternativement, le freeware open-source&nbsp ; ImageJ peut être utilisé pour la colocalisation&nbsp ; Analyse d’ensembles de données confocales Z-Stacks.</td></tr></tbody></table>

3d quantitative in silico modélisation (q3dism) de cerebral bêta-amyloïde phagocytose dans les modèles rongeurs de la maladie d'alzheimer

Quantitative 3D In Silico Modeling (q3DISM) of Cerebral Amyloid-beta Phagocytosis in Rodent Models of Alzheimer's Disease

Neuroinflammation est maintenant reconnu comme un facteur étiologique majeur dans les maladies neurodégénératives. Les phagocytes mononucléaires sont des cellules immunitaires innées responsables de la phagocytose et l&#39;élimination des débris et de détritus. Ces cellules comprennent les macrophages CNS-résidents appelés microglie et phagocytes mononucléaires infiltrant de la périphérie. La microscopie optique a généralement été utilisé pour visualiser la phagocytose des rongeurs ou des échantillons de cerveau humain. Cependant, les méthodes qualitatives ont pas fourni la preuve définitive de la phagocytose in vivo. Ici, nous décrivons 3D quantitative dans la modélisation de silico (de q3DISM), une méthode robuste permettant la vraie quantification 3D de l&#39; amyloïde-β (Aß) phagocytose par les phagocytes mononucléaires dans rongeurs maladie d&#39;Alzheimer (AD) modèles. Le procédé consiste à visualiser fluorescence Aß encapsulé dans phagolysosomes dans les sections rongeur du cerveau. Les grands ensembles de données confocale z-dimensionnelle sont ensuite reconstruits 3D pour la quantification de A &amp;# 946; colocalisés dans l&#39;espace à l&#39;intérieur du phagolysosome. Nous démontrons l&#39;application réussie de q3DISM à la souris et le rat des cerveaux, mais cette méthode peut être étendue à pratiquement tous les cas phagocytaire dans les tissus.

En utilisant la méthodologie multi-scène pour q3DISM détaillée ci - dessus, nous sommes en mesure de quantifier Aß absorption dans phagolysosomes de monocytes dans le cerveau des APP / PS1 souris (figure 1) et les rats TgF344-AD (Figure 2). Par conséquent, la méthodologie de q3DISM a permis l'analyse des phagocytes mononucléaires dans des modèles de souris et de rat de la MA. Fait intéressant, le volume occupé par CD68 + phagolysosomes est sig...

Nous avons développé une méthodologie pour la 3D quantitative dans la modélisation de silico (q3DISM) de amyloïde cérébrale-β (Aß) phagocytose par les phagocytes mononucléaires dans des modèles de rongeurs de la maladie d&#39;Alzheimer. Cette méthode peut être généralisée pour la quantification de pratiquement tous les cas de phagocytose in vivo.

3D quantitative In Silico Modélisation (q3DISM) de Cerebral bêta-amyloïde phagocytose dans les modèles rongeurs de la maladie d'Alzheimer

Neuroinflammation is now recognized as a major etiological factor in neurodegenerative disease. Mononuclear phagocytes are innate immune cells responsible ...

L’objectif global de cette modélisation quantitative 3D in silico, ou technique q3DISM, est de quantifier l’absorption de la bêta-amyloïde par les phagocytes mononucléaires dans le cerveau de modèles de rongeurs de la maladie d’Alzheimer. Cette méthode répond à un besoin pressant dans le domaine de la recherche sur la maladie d’Alzheimer de quantifier la clairance de la bêta-amyloïde qui se dépose dans le cerveau des patients atteints de la maladie d’Alzheimer et qui forme des plaques séniles. Pour la première fois, cette technique permet une véritable reconstruction 3D et une quantification de la bêta-amyloïde par les macrophages in vivo. Nous avons commencé à utiliser le 3Disme inspiré pour étudier le dépôt de bêta-amyloïde parce que nous avions besoin d’un outil robuste pour visualiser et quantifier la phagocytose des microphages in vivo.Cette technique pourrait s’avérer utile pour tester des traitements expérimentaux de la maladie d’Alzheimer afin d’évaluer quels médicaments stimulent les macrophages pour l’élimination efficace de la bêta-amyloïde. Lorsque les échantillons de tissus sont prêts pour l’immunomarquage, remplissez la région tissulaire entourée d’un stylo de barrièr

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Une des caractéristiques pathologiques de la MA est la formation de plaques amyloïdes β protéines neuritique positif. Dans ce protocole, nous décrivons deux méthodes pour détecter les plaques séniles dans le modèle de souris transgéniques AD: détection immunohistochimique utilisant la méthode ABC et DAB et détection par fluorescence en utilisant la méthode de coloration thioflavine S.

La détection de plaques séniles dans le modèle d&#39;Alzheimer La maladie de la souris

Cette vidéo démontre l'infusion stéréotaxique précise de bêta-amyloïde dans le gyrus denté pour établir un modèle murin de la maladie d'Alzheimer. La détermination précise des coordonnées et l'administration contrôlée des protéines bêta-amyloïdes entraînent une dégradation neuronale, perturbent le traitement de la mémoire et contribuent au développement de la maladie d'Alzheimer.

Perfusion cérébrale stéréotaxique directe de protéines bêta-amyloïdes pour un modèle de maladie d’Alzheimer

Source : Arango-Lievano, M. et. al., Imagerie longitudinale in vivo de la cerebrovasculature : pertinence pour les maladies du SNC. J. Vis. Exp. (2016)Cette vidéo montre l’imagerie in vivo à deux photons pour visualiser des plaques amyloïdes marquées par fluorescence et un système vasculaire cérébral. La fluorescence bleue marque les plaques, tandis que la fluorescence verte met en évidence les vaisseaux sanguins cérébraux. Une carte 3D de la région d’intérêt et une imagerie en mosaïque à haute...

Imagerie in vivo de vaisseaux cérébraux et de plaques amyloïdes dans un modèle murin de la maladie d’Alzheimer

Ici, nous présentons un protocole pour la perfusion cérébrale stéréotaxique directe de bêta-amyloïde. Cette méthodologie fournit un modèle murin vivo alternatif pour aborder les effets à court terme de la bêta-amyloïde sur les neurones cérébraux.

Infusion stéréotaxique des oligomères bêta-amyloïde dans les Hippocampus souris

Le amyloïde-β (Aß) -injected modèle animal permet à l'administration d'une quantité et d'espèces de fragments Aß défini et réduit les différences individuelles au sein de chaque groupe d'étude. Ce protocole décrit l'injection intracérébroventriculaire (ICV) de Aß sans instrument stéréotaxique, ce qui permet la production d'anomalies du comportement de type Alzheimer chez les souris normales.

Injection intracérébroventriculaire de Peptides amyloïde-ß chez les souris normales à Provoquer Pleinement Déficits cognitifs de type Alzheimer

Cet article décrit un protocole pour la visualisation de plaques amyloïdes Aß dans les modèles de souris de la maladie d'Alzheimer en utilisant méthoxy-X04, qui traverse la barrière hémato-encéphalique et se lie à la ß-plissés feuilles trouvées dans noyau dense plaques Aß sélectivement. Il permet la présélection des coupes de tissus contenant la plaque-avant immunocoloration et de traitement pour la microscopie électronique.

Corrélative microscopie optique et électronique pour l&#39;étude microgliales Interactions avec plaques ß-amyloïde

Ce protocole illustre une méthode d'encapsulation cellulaire par la gélation physique rapide de l'alginate pour immobiliser des cellules. Les microbilles obtenues permettent une sécrétion contrôlée et soutenue de l'amyloïde au fil du temps et peuvent être utilisées pour étudier les effets de l'amyloïde sécrété dans les modèles in vitro et in vivo.

Fabrication de microbilles d'amyloïde-Sécrétion d'alginate pour l'utilisation dans la modélisation de la maladie d'Alzheimer

Le présent protocole décrit et compare la procédure permettant d’effectuer une analyse complète de région ou de sous-région d’intérêt de sections cérébrales de souris sagittales afin de quantifier la charge bêta-amyloïde dans le modèle murin transgénique APP/PS1 de la maladie d’Alzheimer.

Quantification complète ou sous-régionale de la charge bêta-amyloïde sur les sections cérébrales de souris

Ici, nous décrivons la mesure du taux de transport axonal des stabilisateurs constitutifs des membranes du réticulum endoplasmique (RE) associées aux mitochondries (MAM) en augmentant ou en maintenant la génération de β-amyloïde (Aβ) neurotoxiques à partir des neurones de la maladie d’Alzheimer (MA) en temps réel pour servir de mesure directe et quantitative pour mesurer la stabilisation de la MAM et aider au développement de traitements contre la MA.

Analyse quantitative de la stabilisation de la membrane endoplasmique du réticulum (MAM) associée aux mitochondries dans un modèle neuronal de la maladie d’Alzheimer (MA) 

La méthode de collecte de haute densité liées à l'événement de données potentielles tandis que les patients atteints de la maladie d'Alzheimer effectuer une tâche de mémoire de reconnaissance est revu. Ce protocole comprend la préparation du sujet, l'assurance qualité, l'acquisition de données et l'analyse des données.

Examinant les caractéristiques de la mémoire épisodique à l&#39;aide d&#39;événements liés à des potentiels chez les patients atteints de la maladie d&#39;Alzheimer

Découvrez la technique q3DISM pour modéliser la phagocytose de l'amyloïde-bêta par les phagocytes mononucléés dans les modèles rongeurs de la maladie d'Alzheimer. Cette méthode permet une reconstruction 3D quantitative in vivo.

3D quantitative In Silico Modélisation (q3DISM) de Cerebral bêta-amyloïde phagocytose dans les modèles rongeurs de la maladie dAlzheimer (Vidéo) | JoVE Journal

3D quantitative In Silico Modélisation (q3DISM) de Cerebral bêta-amyloïde phagocytose dans les modèles rongeurs de la maladie d'Alzheimer

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