Name: Une étude comparative des médicaments Méthodes de livraison ciblés à loreille de la souris intérieure: Bullostomy Versus Transtympaniques Injection (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-08T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 18 s
Description: Découvrez deux techniques de microchirurgie pour l'administration de médicaments dans l'oreille interne chez la souris C57BL/6J. Comparez la bullostomie et l'injection transtympanique pour évaluer leur impact sur l'audition et la cytoarchitecture cochléaire.

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Les auteurs tiennent à remercier les Génomique et installations d&#39;évaluation non invasive Neurofonctionnelle (IIBM, CSIC-UAM) pour leur soutien technique. Ce travail a été soutenu par des subventions de l&#39;espagnol &quot;Ministerio de Economia y Competitividad&quot; (FEDER-SAF2014-53979-R) et l&#39;Union européenne (FP7-AFHELO et FP7-PEOPLE-TARGEAR) à IVN.

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</ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Administration locale de médicaments à l&#39;oreille interne peut se faire directement par injection intracochléaire ou indirectement par l&#39; administration intratympanique, plaçant le médicament dans l&#39;oreille moyenne 4, 19, 39. administration intracochléaire fournit le contrôle et l&#39;administration de médicaments précise à la cochlée, en évitant la diffusion à travers les membranes de fenêtre, basal-à-apicale gradients de concentration et la clairance par la trompe d&#39;Eustache. Cependant, il est généralement une procédure très invasive qui nécessite une microchirurgie complexe et délicat 7, 39. Dans ce contexte, l&#39;industrie se développe de nouveaux enrobés, des dispositifs implantables pour la libération prolongée du médicament 40, 41. D&#39;autre part, l&#39;administration intratympanique est une procédure minimalement invasive et facile à réaliser qui permet l&#39;injection de grands volumes de la drug dans l&#39;oreille moyenne, alors que les paramètres pharmacocinétiques ne sont pas faciles à contrôler. La majorité du médicament est autorisé par la trompe d&#39; Eustache et la fraction restante doit diffuser à travers la membrane RW pour atteindre la cochlée 18. RW est le site d&#39;absorption maximale des substances de l&#39;oreille moyenne dans le tympanique conduit de périlymphe rempli de la cochlée 7. Il est une structure à trois couches semi - perméable, bien que sa perméabilité dépend des caractéristiques du médicament ( la taille, la concentration, la solubilité et la charge électrique) et sur les systèmes de transport transmembranaire (diffusion, le transport actif ou phagocytose) 42. La fenêtre ovale et capsules otiques sont entrées alternatives mais moins efficaces à cochlée 43, 44. Ici, nous démontrons et comparer les deux méthodes de microchirurgie pour la délivrance ciblée de médicaments dans l&#39;oreille moyenne de la souris: bullostomy et transtympales procédures d&#39;injection nic. étapes critiques communes à ces procédures comprennent: i) une évaluation de l&#39;audition avant et après la microchirurgie, ii) la préparation d&#39;une solution homogène du véhicule dans des conditions stériles, iii) une surveillance attentive de la procédure et le suivi des animaux température du corps et constantes anesthésie, iv ) lente mise en place du volume approprié de véhicule ciblant le RW, et iv) la prise d&#39;échantillons cochléaires pour compléter l&#39;analyse moléculaire et morphologique. Approches rétroauriculaires et ventrales pour bullostomy ont été décrits 7, 45. Nous avons utilisé l&#39;approximation ventrale parce que dans notre expérience , il a donné lieu à moins de morbidité et a fourni un meilleur accès à la RW 46. Injections transtympaniques sont généralement effectuées par les pairs TENSA de la membrane tympanique, antérieures ou postérieures à la manubrium du marteau 12. Dansce travail nous a effectué une modification de la technique, une injection à travers la pars flaccida au - delà du marteau avec une ponction supplémentaire précédente du tensa pars pour permettre l&#39; évacuation de l&#39; air lors de l&#39; injection. L&#39;injection transtympaniques était moins invasive que la bullostomy, bien que les deux microchirurgies étaient rapides (20 et 5 min par oreille pour bullostomy et approche transtympaniques respectivement), avec des temps de récupération post-opératoires et aucune morbidité. Plus important encore, les deux procédures maintenus audience et les paramètres ABR étaient identiques à celles déterminées avant la microchirurgie. L&#39;approche transtympaniques prend moins de temps que le bullostomy et peut être réalisée dans les deux oreilles du même animal au cours de la même intervention. Les avantages de l&#39;injection transtympanique sont donc qu&#39;il peut être réalisé de manière bilatérale et répétée, si nécessaire. D&#39;autre part, permet un accès visuel bullostomy direct à la membrane RW et permet filling de la niche RW. En revanche, l&#39;injection transtympaniques ne permet pas le contrôle du placement de véhicule dans le créneau RW. Les procédures présentées dans ce travail décrivent comment effectuer une livraison du véhicule local de la drogue à l&#39;oreille moyenne pour les applications pré-cliniques telles que l&#39;évaluation de l&#39;ototoxicité et de l&#39;évaluation de l&#39;efficacité dans la perte d&#39;audition. Deux procédures de microchirurgie sont décrits qui fournissent des méthodes alternatives avec des avantages et des inconvénients spécifiques. Les deux préserver l&#39;audition et ne provoquent pas de modifications morphologiques. L&#39;inflammation locale est décrite comme une complication potentielle de bullostomy. Un ensemble de techniques complémentaires sont également décrites pour les procédures postopératoires, y compris l&#39;audience, les évaluations d&#39;expression de marqueurs morphologiques et inflammatoires. Les applications futures de ces techniques comprennent l&#39;évaluation préclinique de nouvelles thérapies pour la perte, y compris des approches génétiques, cellulaires et pharmacologiques entendu, dans des modèles animaux. intratympanique administrations assurer la fourniture du traitement dans l&#39;oreille moyenne, en contact avec la membrane de fenêtre ronde, facilitant le passage dans le périlymphe sans dommage cochléaire évidente.

La déficience auditive est le déficit sensoriel humain le plus fréquent et touche 5,3% de la population mondiale, et 30% des personnes âgées de plus de 65 ( <a href="http://www.who.int/topics/deafness/en">http://www.who.int/topics/deafness/en</a> , mise à jour 2016). La perte auditive affecte l&#39;acquisition du langage chez les enfants et accélère le déclin cognitif chez les personnes âgées. Par conséquent, il est un problème de santé important avec un impact socio-économique considérable. Elle peut être provoquée par des défauts génétiques, des facteurs environnementaux , ou une combinaison des deux à 1, ce qui en fin de compte provoquer des dommages et la mort des cellules ciliées et des neurones dans la cochlée. Ces cellules ne se régénèrent pas chez les mammifères, donc la perte cellulaire et concomitante perte auditive ne peuvent pas être inversés. Les options cliniques sont basées sur des dispositifs prothétiques, y compris les aides auditives et cochléaire, l&#39; oreille moyenne et les implants de conduction osseuse 2. Malheureusement, il n&#39;y a pas trea réparatrice médical spécifiquetments pour la déficience auditive et donc plusieurs lignes de recherche se concentrent sur le développement de thérapies préventives et réparatrices. Options thérapeutiques nouveaux incluent la thérapie génique et cellulaire ainsi que le développement de petites molécules pour le traitement pharmacologique 2. L&#39;un des défis les plus importants dans la thérapie pharmacologique cochléaire est la délivrance de médicaments. Les traitements systémiques ont une efficacité dans la cochlée limitée en raison du sang labyrinthe barrière 3, endothélium continu en contact avec les vaisseaux sanguins cochléaire, qui agit comme une barrière physique et biochimique pour maintenir intérieure homéostasie liquide de l&#39; oreille, ce qui limite donc le passage de la drogue à l&#39;oreille interne. Il est seulement perméable aux petites molécules liposolubles, bien que la perméabilité peut être accrue lors de l&#39;inflammation cochléaire, et aussi avec l&#39;utilisation des diurétiques ou des agents osmotiques. Le volume de médicament qui atteint finalement la cochlée après l&#39;administration systémique est réduite;par conséquent, des doses élevées qui pourraient entraîner une toxicité organique sont nécessaires. En outre, le métabolisme hépatique du médicament peut produire des métabolites toxiques ou inactifs 4, 5, 6, 7. En revanche, les interventions locales permettent la mise en place d&#39;une quantité limitée connue du médicament dans l&#39;oreille moyenne ou interne , sans effets secondaires indésirables , 4, 7, 8, 9. Dans la pratique clinique actuelle, les administrations intratympanic sont limitées à certaines pathologies cochléaires, tels que la gentamicine dans la maladie de Ménière 10, les corticostéroïdes dans la surdité soudaine, la maladie de Ménière, à médiation immunitaire et le bruit perte d&#39;audition induite, 11, 12, 13, 14, 15 et de l&#39; insuline-like growth factor 1 (IGF1) dans la surdité soudaine 4, 16, 17. Les formulations pour l&#39;administration locale devraient préserver l&#39;homéostasie délicate (pH et osmolarité) des fluides cochléaires. En outre, il est très important de maintenir la stérilité au cours du processus afin d&#39;éviter la contamination bactérienne du liquide céphalorachidien. L&#39;excipient utilisé pour la délivrance de médicaments doit être biocompatible, nonototoxic et de la consistance appropriée. Les solutions liquides sont recommandés pour les injections intracochléaire, mais ne conviennent pas pour la route intratympanique en raison du jeu à travers la trompe d&#39;Eustache. Dans ce cas, les médicaments sont généralement effectuées par des gels semi-solides pour augmenter leur permanence dans l&#39;oreille moyenne 4, 18, 19. livraison alternatif systems utilisées comme supports pour augmenter le passage du médicament à l&#39;oreille interne sont des nanoparticules 20 et adénovirus 21 Ici nous avons comparé deux véhicules: CGP et une solution de RL. CGP est un hydrogel formé par le chitosane, un polysaccharide linéaire constitué de D-glucosamine et la N-acétyl-D-glucosamine obtenu à partir de carapaces de crustacés et de β-glycérophosphate, d&#39;un polyol qui forme un bouclier d&#39;eau autour des chaînes de chitosane et le maintient en sous forme liquide. CGP est thermosensible et peut être dégradé par lysozymes, permettant une libération prolongée du médicament dans l&#39;oreille moyenne 22, 23, 24, 25. Hydrogels chitosane-base sont des véhicules appropriés pour des applications cliniques telles que la délivrance de médicaments en raison de leur manque d&#39;immunogénicité et l&#39; absence d&#39;activation des réactions locales inflammatoires 23, 24. Sur la OTHer la main, le tampon RL est une solution isotonique, apyrogène (273 mOsm / L et un pH de 6,5), destinée à être administrée par voie intraveineuse chez l&#39;homme comme source d&#39;eau et d&#39;électrolytes, en particulier dans la perte de sang, d&#39;un traumatisme ou de blessures par brûlures Du fait que les sous-produits du métabolisme du lactate dans le foie contrer l&#39;acidose. Nous décrivons ici et comparer les deux méthodes chirurgicales qui ont été raffinés pour la livraison locale de médicaments à l&#39;oreille interne de la souris. Le profil des deux techniques de sécurité a été évaluée en utilisant des tests fonctionnels, morphologiques et moléculaires. Audition a été évaluée à l&#39; aide de réponse du tronc cérébral (ABR) 26, 27 réalisée avant et après microchirurgie à des moments différents. Procédures de fin points ont été utilisés pour disséquer la cochlée et comparer l&#39;impact anatomique, cellulaire et moléculaire de ces deux procédures de microchirurgie.

<table><tbody><tr><td>Kétamine (Imalgene)</td><td>Merial</td><td># 2529</td><td>ATTENTION : éviter le contact du médicament avec la peau ou les yeux ou les injections auto-infligées accidentelles</td></tr><tr><td>Xylacine (Xilagesic)&nbsp ;</td><td>Calier</td><td># 6200025225</td><td></td></tr><tr><td>Gel lubrifiant pour les yeux (Artific)</td><td>Angelini</td><td># 784710</td><td></td></tr><tr><td>Pompe à eau&nbsp ;</td><td>Gaymar</td><td># TP472</td><td></td></tr><tr><td>Désinfectant de surface</td><td>Jos&eacute ; Collado SA</td><td># CR-36</td><td></td></tr><tr><td>Électrodes à aiguille sous-cutanées&nbsp ;</td><td>Spes Medica</td><td># MN4013D10SM</td><td></td></tr><tr><td>Scène de tête à faible impédance&nbsp ; (RA4LI)</td>Haut-parleurs <td>Tucker-Davis Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(haut-parleur magnétique multi-champs MF1)</td>Station de travail à potentiel évoqué <td>Tucker-Davis Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>System 3</td><td>Tucker-Davis Technologies</td><td></td><td>Le système est composé de : processeur RP2, station de base RA16, atténuateur PA5, amplificateur SA1, amplificateur de microphone MA3, tête d’impédance RA4LI et préamplificateur médusa RA4A.</td></tr><tr><td>Logiciel SigGenRP</td><td>Tucker-Davis Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coussins chauffants (coussinets TP)</td><td>Gaymar</td><td># TP3E</td><td></td></tr><tr><td>Logiciel de statistiques (SPSS)</td><td>IBM</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chitosan (désacétylé)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td># C3646</td><td></td></tr><tr><td>Acide acétique (glacial)</td><td>VWR</td><td># 20103.295</td><td>ATTENTION : liquide inflammable, corrosion cutanée, respiratoire et cutanée sensibilisant</td></tr><tr><td>Glycérophosphate</td><td>Sigma</td><td># SLBG3671V</td><td></td></tr><tr><td>Ringer&acute ; s lactate</td><td>buffer Braun</td><td># 1520-ESP</td><td></td></tr><tr><td>Medetomidine (Domtor)</td><td>Esteve</td><td># 02400190</td><td></td></tr><tr><td>Phentanile (Fentanest)</td><td>Kern Pharma</td><td># 756650.2</td><td>ATTENTION : &nbsp ; &nbsp ; éviter le contact du médicament avec des plaies ouvertes ou des injections auto-infligées accidentelles</td></tr><tr><td>Isoflurane (IsoVet)</td><td>Braun</td><td># 469860</td><td>ATTENTION : Éviter les expositions à des concentrations maximales supérieures à 2 ppm de tout agent anesthésique halogéné pendant une période d’échantillonnage ne dépassant pas 1 h.</td></tr><tr><td>Microscope chirurgical (OPMI pico)</td><td>Champ stérile Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(Foliodrape)</td><td>Hartmann</td><td># 277546</td><td></td></tr><tr><td>Stérilisateur&nbsp ;</td><td>Fine Science Tools</td><td># 18000-45</td><td></td></tr><tr><td>Lame de scalpel</td><td>Swann Morton</td><td># 0205</td><td>ATTENTION</td></tr><tr><td>Manche de scalpel</td><td>Fine Science Tools</td><td># 91003-12</td><td></td></tr><tr><td>Antiseptique à base de povidone iodée (Betadine)</td><td>Meda Pharma SAU</td><td># M-12207</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux Adventitia (SAS18-R8)</td><td>S& T</td><td># 12075-12</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux courbés</td><td>CM Instrumente</td><td># AJ023-18</td><td></td></tr><tr><td>Pince</td><td>CM Instrumente</td><td># BB019-18</td><td></td></tr><tr><td>Éponge à gélatine (Spongostan)</td><td>ProNaMAc</td><td># MS0001</td><td></td></tr><tr><td>Microlance 27 G</td><td>Becton Dickinson</td><td># 302200</td><td></td></tr><tr><td>Seringue d’un microlitre (701 RN SYR)</td><td>Hamilton</td><td># 80330</td><td></td></tr><tr><td>Cathéter (Microfil 34 G)</td><td>World Precision Instruments&nbsp ;</td><td># MF34G-5</td><td></td></tr><tr><td>Adhésif tissulaire (Vetbond)</td><td>3M</td><td># 1469SB</td><td></td></tr><tr><td>Porte-aiguille (Porte-aiguille à manche rond)&nbsp ;</td><td>Outils de science fine</td><td># 12075-12</td><td></td></tr><tr><td>Suture chirurgicale en soie (Soie tressée 5/0)</td><td>Arago</td><td># 990011</td><td></td></tr><tr><td>Chlorhexidine (Cristalmina)</td><td>Salvat</td><td># 787341</td><td></td></tr><tr><td>Pentobarbital&nbsp ; (Dolethal)</td><td>Ventoquinol</td><td># VET00040</td><td>ATTENTION : &nbsp ; &nbsp ; éviter le contact du médicament avec des plaies ouvertes ou des injections auto-infligées accidentelles</td></tr><tr><td>Stéréomicroscope (Leica)</td><td>Meyer Instruments</td><td># MZ75</td><td></td></tr><tr><td>Vannas Micro-dissection (œil) Ciseaux Action à ressort</td><td>Harvard Apparatus</td><td># 28483</td><td></td></tr><tr><td>Bijoutier' s forceps (Dumont)</td><td>Fine Science Tools</td><td># 11252-00</td><td></td></tr><tr><td>Solution de décontamination de la RNase&nbsp ; (RNaseZap)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td># R2020</td><td></td></tr><tr><td>Solution de stabilisation de l’ARN&nbsp ; (ARN)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td># R0901</td><td></td></tr><tr><td>Kit de purification de l’ARN (RNeasy)</td><td>Qiagen</td><td># 74104</td><td></td></tr><tr><td>Kit de transcription inverse de l’ADNc</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td># 4368814</td><td></td></tr><tr><td>Test d’expression génique (sondes TaqMan)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Il1b : Mm00446190_m1 Il6 : Mm00446190_m1 Tgfb1 : Mm01178820_m1 Tnfa : Mm99999068_m1 Il10 : Mm00439614_m1 Dusp1 : Mm00457274_g1 Hprt1 : Mm00446968_m1</td><td></td></tr><tr><td>Système de PCR en temps réel (7900HT)</td><td>Applied Biosystems</td><td># 4329001</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde (PFA)</td><td>Merck</td><td># 1040051000</td><td>TOXIQUE : Le PFA est un potentiel cancérogène</td></tr><tr><td>Acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA)</td><td>Merck</td><td># 405491</td><td>ATTENTION :&nbsp ; nocif en cas d’inhalation, peut causer des lésions aux voies respiratoires en cas d<exposition prolongée ou répétée sibr/> inhalé.</td></tr><tr><td>Solution d’hématoxyline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td># HHS16</td><td></td></tr><tr><td>Eosin Y</td><td>Sigma-Aldrich</td><td># E4382</td><td>Dangers : provoque une irritation oculaire grave</td></tr></tbody></table>

une étude comparative des médicaments méthodes de livraison ciblés à l'oreille de la souris intérieure: bullostomy versus transtympaniques injection

A Comparative Study of Drug Delivery Methods Targeted to the Mouse Inner Ear: Bullostomy Versus Transtympanic Injection

Nous présentons deux techniques de microchirurgie minimalement invasives chez les rongeurs pour la délivrance de médicaments spécifiques dans l&#39;oreille moyenne afin qu&#39;elle puisse atteindre l&#39;oreille interne. La première procédure consiste à la perforation de la bulle tympanique, appelée bullostomy; le second est une injection transtympanique. Les deux procédures cliniques émuler intratympanic humaines. Chitosan-glycérophosphate (CGP) et le tampon de Lactate Ringer (RL) ont été utilisés en tant que véhicules biocompatibles pour administration locale de médicaments. CGP est un polymère biodégradable non toxique largement utilisé dans des applications pharmaceutiques. Il est un liquide visqueux à la température ambiante, mais il se solidifie en une phase semi-solide à la température corporelle. RL est une solution isotonique utilisé pour l&#39;administration par voie intraveineuse chez l&#39;homme. Un petit volume de ce véhicule est précisément placé sur la niche de fenêtre ronde (RW) au moyen d&#39;un bullostomy. Une injection transtympaniques remplit l&#39;oreille moyenne et permet moins de contrôle mais un accès plus large à l&#39;oreille interne. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Les profils des deux techniques de sécurité ont été étudiées et comparées en utilisant des tests fonctionnels et morphologiques. Audition a été évaluée en enregistrant la réponse Auditory Brainstem (ABR) avant et plusieurs fois après microchirurgie. Le niveau des structures cochléaires cytoarchitecture et de préservation ont été étudiés par des techniques histologiques classiques dans des échantillons cochléaires paraformaldehyde fixe et décalcifiées. En parallèle, des échantillons non fixés cochléaires ont été prélevés et immédiatement congelés pour analyser les profils d&#39;expression génique des marqueurs de l&#39;inflammation par inverse quantitative réaction en chaîne transcriptase polymerase (qRT-PCR). Les deux procédures sont appropriés comme des méthodes d&#39;administration de médicaments dans l&#39;oreille moyenne de la souris, bien que l&#39;injection transtympaniques avéré être moins invasive par rapport à bullostomy.

Audition a été testé par ABR avant et à plusieurs reprises après microchirurgie pour évaluer l'impact sur la fonction auditive (figure 1A). Registres ABR ont été réalisées sous anesthésie pour éviter tout mouvement et de tension artefacts animaux et donc d' améliorer sa reproductibilité 27. Administré par voie intrapéritonéale combinaisons de kétamine à base ou isoflurane inhalation ont été habituellement utilisé pour anesthésier les animaux lors des tests de ABR. La combinaison kétamine / xylazine fournit un (2-3 min) induction courte durée d'action et une phase d'entretien stable, sûr tout en effectuant des registres de ABR. Il convient de noter que l' isoflurane peut affecter la mesure ABR sensibilité 38. Pour les registres ABR, les électrodes sous - dermiques sont placés dans des endroits spécifiques (figure 1B) et l'impédance électrique est mesurée. Si l'impédance est 3 kohms ou plus, le positionnement de l'électrode doit être contrôlée pour éviter altrations dans ABR amplitude de l'onde. Intratympanique livraison est effectuée chez la souris par deux procédures microchirurgicales (figure 2). L' exposition de la bulle au cours bullostomy implique la rétraction des glandes sous - maxillaires et digastrique. Cette procédure est effectuée avec un soin extrême , car l'artère carotide et le nerf vagal sont très proches (figure 2A). Ensuite, la bulle est percé pour localiser l'artère stapédienne et la membrane RW (figure 2B). Pour éviter la fissuration des os, une petite ouverture de 0,5 mm est faite avec une aiguille 27 G avant de percer. Le 34 G cathéter est dirigé à travers le bullostomy vers la membrane RW et un petit volume de véhicule est livré sur la niche de fenêtre (figure 2C). L'injection transtympaniques est effectuée par une incision dans la pars flaccida de la membrane tympanique avec une aiguille 27 G; un plus grand peut provoquer àl'oreille dans la membrane. Avant l'injection, nous recommandons de faire une incision supplémentaire dans la tensa pars pour permettre l'évacuation de l' air lors de l' injection du véhicule (Figure 2F). Il est essentiel d'éviter les dommages de l'artère stapédienne, une branche de l'artère carotide interne, ce qui conduirait à une hémorragie mortelle. Les souris ayant bullostomy ou transtympaniques chirurgies auditive tout au long de l'expérience, semblable aux contrôles non opérés (figure 3) conservées. seuils ABR en réponse à des clics et des rafales de tonalité n'a pas changé de manière significative après la microchirurgie par rapport aux valeurs de base. Aucune différence significative n'a été observée entre bullostomy et les approches transtympaniques. Des études morphologiques ont été effectuées pour confirmer la livraison du véhicule correct dans l'oreille moyenne et d'évaluer les changements potentiels causés par les procédures en cytoarchitecture cochléaire. Aucun des principaux cochléaires régions saltérations morphologiques howed et les animaux des deux procédures ont présenté une morphologie similaire de toutes les structures cochléaires (Figure 4A). En outre, les profils cochléaires pour l'expression des gènes des cytokines pro- et anti-inflammatoires ont aussi été étudiés. Malgré l' absence de différences fonctionnelles dans les données ABR entre les deux procédures, bullostomy a provoqué une réponse inflammatoire plus forte que l'approche transtympaniques (figure 4B). <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/54951/54951fig1.jpg"> Figure 1. Conception expérimentale et de l' évaluation de l' ouïe. (A) Schéma de la procédure expérimentale. Audition a été évaluée avec ABR avant et après microchirurgie. échantillons cochléaires ont été obtenus 28 jours après microchirurgie. (B) souris anesthésiée en position couchée sur le coussin chauffant dans une chambre insonorisant, avec electrod subdermales placé dans le cuir chevelu entre les oreilles sur le sommet du crâne (actif, positif); dans la région parotide en dessous du pavillon (référence, négatif) et dans le dos (au sol). Le haut-parleur en champ libre est placé à une distance fixe (5 cm) face à l'oreille droite. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54951/54951fig1large.jpg" target="_blank">S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/54951/54951fig2.jpg"> Figure 2. microchirurgie pour l' application du véhicule. (A) Vue ventrale de la bulle tympanique. La bullostomy est effectuée caudale du nerf facial avec une aiguille 27 G. (B) RWN et de l' artère stapédienne peuvent être observées à travers la perforation. (C) 34 G cathéter est dirigé à travers le bullostomy vers le créneau RW. (D) Un mois après la bullostomy, une petite osseusecicatrice est présent dans le site d'ouverture (flèche). (E) Vue latérale de l'oreille, montrant l'incision dans le conduit auditif externe et la membrane tympanique (carré). (F) Détail de la membrane tympanique. Une ponction a été faite au quadrant supérieur caudale de la membrane tympanique en utilisant une aiguille 27 G (astérisque noir, dans la pars flaccida); l'injection a été faite à travers cette perforation au moyen d'un cathéter 34 G. Un trou supplémentaire a été faite dans le quadrant inférieur crânienne de la membrane (astérisque blanc, dans le Tensa SRAP) avant l'injection d'équilibrer la pression tympanique. (G) Vue du 34 G cathéter à travers la ponction de la membrane tympanique. (H) Vue de la cochlée région 24 h après la microchirurgie. RWN rempli de solution de véhicule (astérisque). Lat, latéral; Ro, rostrale; Do, dorsale; Ma, malleus; Co, cochlée; OW, fenêtre ovale; RWN, niche de fenêtre ronde. Les barres d'échelle = 200 pm A, D, F; Barres d'échelle = 100 um B, C, H; Les barres d'échelle = 1000 pm dans E, G. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54951/54951fig2large.jpg" target="_blank">S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="figure 3" src="/files/ftp_upload/54951/54951fig3.jpg"> Figure 3. Évaluation de l' ouïe. Evolution des seuils ABR (moyenne ± SEM, en dB SPL) en réponse à cliquer (A) et le ton salve (B) stimuli, avant et 7, 14 et 28 jours après la micro-chirurgie chez le mâle de huit semaines d'âge C57BL / 6J les souris. Bullostomy (orange, n = 11); injection transtympaniques (bleu; n = 6); non exploité (gris; n = 11), <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54951/54951fig3large.jpg" target="_blank">S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> jpg "/&gt; Figure 4. Cochlear Morphologie et l' analyse de l' expression génétique. (A) Morphologie des principales structures cochléaires à la base de la cochlée. Haematoxilin-éosine des sections à mi-modiolar paraffine (7 pm), des oreilles de souris non-exploités, et les souris un mois après l'intervention de microchirurgie par bullostomy ou injection transtympaniques. Le compartiment des médias scala (a, b, c) présente tous les composants principaux. Les détails de chacune de ces structures (boîtes numérotées) sont présentés dans les images suivantes: ganglion spiral (1), organe de Corti (2), ligament spirale (3) et strie vasculaire (4). cellules ciliées internes (astérisque); cellules ciliées externes (tête de flèche). Les barres d'échelle = 100 um a, b, c; Barres d'échelle = 50 pm dans un 1,2,3,4. (B) d'expression Cochlear de marqueurs inflammatoires 28 d après la microchirurgie. Comparaison entre bullostomy (orange) et injection transtympaniques (bleu) et à des souris non opérés (blanc). *: Vs non-exploitégroupes exploités; ^: Comparaison entre les groupes exploités. Les niveaux d'expression génique sont représentés comme 2 - ΔΔCt, ou n fois la différence par rapport à group.Values non opérés sont présentées comme moyenne ± SEM de triplicats provenant d' échantillons de pool de 3 souris par condition. Signification statistique: ** p ≤0.01; *** P ≤0.001; ^^ P ≤0.01; ^^^ P ≤0.001. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54951/54951fig4large.jpg" target="_blank">S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>

Deux approches de microchirurgie pour l’administration locale de médicament dans l’oreille interne sont décrites ici et comparées en termes d’impact sur les paramètres auditifs, la cytoarchitecture cochléaire et l’expression des marqueurs inflammatoires.

Une étude comparative des médicaments Méthodes de livraison ciblés à l'oreille de la souris intérieure: Bullostomy Versus Transtympaniques Injection

We present two minimally invasive microsurgical techniques in rodents for specific drug delivery into the middle ear so that it may reach the inner ear. ...

L’objectif global de ce travail est de décrire et de comparer deux approches de microchirurgie pour l’administration locale de médicaments dans l’oreille interne en termes d’impact sur les paramètres auditifs et les marqueurs de cytoarchitecture cochléaire. Ces procédures peuvent nous aider à répondre à des questions clés dans le domaine auditif, en particulier dans le développement d’études prochimiques animales. Le principal avantage de ces techniques est qu’elles sont peu invasives.Et cela permet à la substance d’atteindre didactiquement l’oreille interne. L’application de ces techniques s’étend au traitement de la perte auditive, car ses procédures microchirurgicales conviennent à l’administration sèche dans l’oreille moyenne. La démonstration pacifique de cette méthode est essentielle, car la bullostomie et l’injection transtympanique sont difficiles à apprendre et nécessitent des connaissances anatomiques et une formation chirurgicale.Pour commencer, placez un bouchon d’oreille dans l’oreille controlatérale d’une souris anesthésiée pour obtenir des réponses principalement mono-auriculaires. Ensuite, placez la souris en position couchée sur un coussin chauffant à l’intérieur d’une chambre d’atténuation du son. Placez l’électrode de l’aiguille sous-cutanée positive en acier inoxydable dans le cuir chevelu entre les oreilles au-dessus du sommet du crâne.Placez l’électrode de référence dans la région parotide sous le pavillon. Placez ensuite l’électrode de terre dans la région du dos, de la queue ou des membres postérieurs. Vérifiez l’impédance électrique dans les électrodes positive et négative.Assurez-vous que l’impédance est inférieure à trois kiloohms. Placez le haut-parleur prérempli à une distance fixe face à l’oreille sélectionnée, avec le centre du haut-parleur aligné avec le conduit auditif externe. Assurez-vous qu’il n’y a pas d’obstacles entre le haut-parleur et l’oreille et que le pavillon de l’oreille est complètement ouvert.Connectez la sortie numérique-analogique de la station de travail au haut-parleur sélectionné. Des haut-parleurs en champ libre sont utilisés ici. Connectez un amplificateur à faible bruit et avec un bon rapport signal/bruit à l’entrée analogique/numérique.Ensuite, commencez le processus de délivrance de stimuli acoustiques dans le conduit auditif externe à l’aide de stimuli prédéfinis ou de nouveaux signaux conçus avec le logiciel approprié. Présentez les stimuli en commençant par une intensité élevée et en réduisant l’intensité par paliers de niveau de pression acoustique de cinq à 10 décibels. Enregistrez la réponse électrique dans les 10 premières millisecondes après la stimulation, car les réponses ABR évoquées apparaissent entre six et huit millisecondes.Utilisez le logiciel pour déterminer le seuil ABR comme décrit dans la partie écrite du protocole. Après avoir administré l’anesthésie selon les protocoles approuvés, vérifiez qu’un plan chirurgical d’anesthésie a été atteint par l’absence de réaction à un pincement de l’orteil et la présentation d’une respiration régulière. Utilisez une tondeuse pour enlever la fourrure à la surface ventrale du cou et protégez les yeux de la kératite cornéenne avec un gel à base d’hydroxy-propyl-méthylcellulose.Placez la souris dans la zone chirurgicale stérile en position couchée sur le dos. Nettoyez la peau avec une solution antiseptique à base de povidone iodée et recouvrez d’un drap stérile. Après avoir utilisé un scalpel pour faire une incision longitudinale de deux centimètres de la mandibule à la clavicule, regardez au microscope chirurgical et identifiez les glandes sous-maxillaires.Séparez les deux glandes sous-mandibulaires à l’aide d’une pince, rétractez-les et localisez l’origine du muscle digastrique dans le nerf facial. Ensuite, faites une incision à l’origine du muscle digastre avec des ciseaux et rétractez-la ventralement, exposant la face médiale inférieure sous-jacente de la bulle tympanique. Ensuite, utilisez une aiguille de calibre 27 pour percer la bulle et créer une ouverture.Nettoyez le sang de la zone percée avec une éponge de gélatine résorbable. Localisez l’artère stapédiale dans la membrane de fenêtre ronde qui lui est dorlotée. À l’aide d’un cathéter de calibre 34 et d’une micro-seringue en verre, injectez lentement trois à cinq microlitres de solution pour véhicule à travers la bullostomie et directement sur la niche ronde de la fenêtre pour la remplir.Scellez la bullostomie avec une à deux gouttes d’adhésif tissulaire. Remettez les glandes sous-mandibulaires dans leur position initiale et fermez les incisions cutanées avec une suture chirurgicale en soie 5-0. Appliquez un antiseptique à base de povidone iodée ou de chlorhexidine autour de l’incision pour éviter l’infection de la plaie.Gardez la souris sur un coussin chauffant jusqu’à ce qu’elle ait repris une conscience suffisante pour maintenir le décubitus sternal. Ne remettez l’animal dans la cage familiale qu’une fois qu’il est complètement rétabli. Placez la souris en position de décubitus latéral et préparez-la dans une zone chirurgicale septique sous le méat auditif externe, comme indiqué précédemment.Après avoir pratiqué une incision longitudinale de 0,5 centimètre dans la partie verticale du conduit auditif externe, localisez la membrane tympanique à l’aide du microscope chirurgical. Identifiez la pars flaccida supérieure dans la pars tensa inférieure, qui est divisée en sections antérieure et postérieure par la poignée du marteau. Ensuite, faites une petite myringostomie dans la partie caudale de la pars flaccida, et une incision supplémentaire dans la pars tensa de la membrane tympanique pour permettre l’évacuation de l’air pendant l’injection.À l’aide d’une micro-seringue en verre reliée à un cathéter de calibre 34, injectez doucement 10 à 15 microlitres de véhicule à travers la pars flaccida, près de la niche ronde de la fenêtre, jusqu’à ce que l’oreille moyenne soit clairement pleine. Fermez les incisions cutanées avec une suture chirurgicale en soie 5-0 et nettoyez comme décrit précédemment. Ce graphique montre les seuils ABR chez les souris C57BL/6J mâles âgées de 8 semaines en réponse à des stimuli de clic avant la chirurgie et sept, 14 et 28 jours après la microchirurgie.Les données sur les bullostomies sont indiquées en orange, les données sur les injections transtympaniques sont indiquées en bleu et les données sur les animaux non opérés sont indiquées en gris. Ce graphique montre les seuils ABR en réponse à des stimuli de tonalité dans la gamme de huit à 40 kilohertz sur la même période de temps après la microchirurgie. Encore une fois, aucune différence significative n’a été observée entre la bullostomie et les approches transtympaniques.Les études morphologiques démontrent que la rampe médiane ne présente pas d’altérations après l’administration du véhicule par bullostomie ou injection transtympanique, ce qui indique que l’une ou l’autre procédure seule n’entraîne pas de dommages. Lors de la tentative de bullostomie, il est important de se rappeler de revoir la structure critique et anatomique entourant l’oreille moyenne et interne des rongeurs. À la suite de ces procédures, d’autres techniques pourraient être effectuées.Par exemple, l’échantillonnage de Berlin pour des études pharmacocinétiques Après son développement, ces techniques ouvrent la voie aux chercheurs dans le domaine des neurosciences auditives pour explorer des thérapies locales potentielles dans des modèles animaux, principalement chez les rongeurs. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’administrer des médicaments dans l’oreille moyenne et de la façon d’évaluer l’audition chez les rongeurs.

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Cette vidéo montre l’injection intra-ventriculaire médiée par l’ommaya dans un modèle murin. La méthode permet l’administration localisée de candidats médicaments potentiels et échappe à la barrière hémato-encéphalique.

Injection intra-ventriculaire chez la souris : une méthode d’administration directe de médicaments médiée par Ommaya pour administrer des médicaments aux ventricules cérébraux du cerveau de souris

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L&#39;approche de la souris ronde-fenêtre pour ototoxiques Delivery Agent: Un rapide et fiable Technique d&#39;incitation à Cochlear dégénérescence cellulaire

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