Analyse de la Aberrations chromosomiques Ambient particules induite par l'aide d'un In vitro système

L’objectif global de cette expérience est de détecter les dommages chromosomiques induits par l’exposition des cellules à des particules extraites de l’air ambiant. Cette méthode peut aider à répondre à une question clé dans le domaine des particules, à savoir si l’exposition aux particules induit-elle des lésions chromosomiques ? Le principal avantage de cette technique, c’est qu’elle permet de visualiser directement les dommages induits dans le matériel génétique.

Après avoir collecté et analysé les particules conformément au protocole de texte, effectuez l’exposition des particules en réchauffant un milieu de croissance complet, 0,25 % de trypsine et du PBS dans un bain d’eau à 37 degrés Celsius, pendant au moins 30 minutes avant de commencer la culture. Après avoir lavé les cellules brutes de 264,7 litres, ajoutez un millilitre de la solution chaude de trypsine dans la boîte et délogez les cellules du fond du récipient de culture tissulaire en grattant. Ensuite, collectez les cellules et fabriquez une suspension unicellulaire par pipetage répété.

Avec du bleu trypan, comptez le nombre de cellules, puis utilisez un milieu complet préchauffé pour les plaquer à une densité de 8000 par centimètre carré dans une boîte de culture tissulaire de 100 millimètres. Utilisez ensuite un milieu complet pour ajuster le volume à 10 millilitres pour une concentration finale de 50 000 cellules par millilitre. Incuber les cellules à 37 degrés Celsius et à 5 % de CO2 pendant 24 heures pour leur permettre de se fixer.

Dans une enceinte de biosécurité, utilisez du PBS stérile pour diluer les particules filtrées à une concentration de 0,5 milligramme par millilitre, pour une dose de traitement de 5 microgrammes par millilitre, et à 5 milligrammes par millilitre, pour une dose de traitement de 50 microgrammes par millilitre. Pour traiter les cellules contenant des particules, vérifiez la croissance cellulaire, la morphologie cellulaire, l’état de la culture et la contamination des cellules au microscope avec un grossissement de 10x. Les cellules doivent être confluentes à au moins 30 % à ce stade.

À l’aide d’une pipette stérile, aspirez aseptiquement le milieu et utilisez deux millilitres de 37 degrés Celsius PBS pour laver le récipient de culture deux fois. Ajouter une dose prédéterminée de matières particulaires avec un milieu frais et incuber les cultures à 37 degrés Celsius et 5 % de CO2 pour correspondre à l’exposition utilisée pour l’analyse génotoxique et épigénotoxique simultanée. Pour arrêter les cellules en métaphase, après avoir lavé les cellules, ajoutez deux millilitres de milieu préchauffé avec cinq microlitres par millilitre de solution de colcémide à la culture, et incubez à 37 degrés Celsius et 5 % de CO2 pendant deux heures.

Après l’incubation, retirez complètement le milieu et utilisez du PBS chaud pour laver les cellules deux fois. Ajoutez ensuite la solution de trypsine et incubez les cultures à 37 degrés Celsius pendant une minute. À l’aide d’un grattoir cellulaire, détachez les cellules et ajoutez 10 millilitres de PBS pour inactiver la trypsine.

Ensuite, pipetez les cellules de haut en bas au moins dix fois pour créer une suspension unicellulaire, puis transférez les cellules dans un tube à centrifuger conique de 15 millilitres. Placez les tubes dans une centrifugeuse pivotante et faites tourner la suspension cellulaire à 400 fois g et à température ambiante pendant cinq minutes. Pour effectuer un traitement hypotonique, retirez le surnageant des tubes sans perturber la cule cellulaire et laissez environ 0,5 millilitre de PBS.

Cassez doucement la pastille cellulaire et utilisez une pipette P200 pour fabriquer une suspension unicellulaire. Ajoutez ensuite quatre millilitres de solution de chlorure de potassium préchauffée goutte à goutte avec une légère secousse. Incuber la suspension cellulaire dans un bain-marie à 37 degrés Celsius pendant 20 minutes.

Après le traitement hypotonique, fixez les cellules en ajoutant un volume égal de fixateur dans le tube, et mélangez doucement en inversant le tube. Centrifugez les tubes à 400 fois g à température ambiante pendant cinq minutes et retirez le surnageant. À ce stade, la pastille cellulaire aura augmenté de taille et deviendra de couleur blanchâtre et plus visible.

Retirez le surnageant. Ajoutez quatre millilitres de fixateur frais et incubez les tubes à température ambiante pendant 30 minutes. Ensuite, centrifugez les tubes, retirez le surnageant et utilisez quatre millilitres de fixateur pour laver les cellules deux fois de plus.

Immergez complètement les lames de verre dans un détergent liquide à 10 % pendant 30 minutes. Ensuite, rincez abondamment les lames à l’eau froide du robinet pendant 30 minutes. Utilisez de l’eau distillée pour rincer les lames trois fois afin d’éliminer complètement le détergent.

Ensuite, plongez-les dans de l’eau distillée et conservez les lames au réfrigérateur pendant la nuit. Déposez dix microlitres de suspension cellulaire sur une lame humide réfrigérée et laissez-la sécher toute la nuit à température ambiante. Pour colorer et monter les échantillons, préparez 50 millimètres de solution de coloration giemsa en mélangeant une partie de la solution de coloration giemsa, avec une partie de PBS, et versez dans un bocal coplin.

Plongez les lames dans une solution de coloration pendant 20 minutes, puis rincez les lames à l’eau distillée pour éliminer l’excès de tache, et utilisez immédiatement un sèche-cheveux pour sécher les lames. Laissez les lames à température ambiante pendant la nuit. Le lendemain matin, appliquez une seule goutte de support de montage sur la lame.

Placez délicatement une lamelle de recouvrement sur le dessus et laissez le support de montage s’étaler lentement sur la glissière. Utilisez ensuite une serviette en papier pour enlever l’excès de support. Enfin, utilisez un microscope à champ clair à un grossissement de 100x pour examiner les aberrations chromosomiques structurelles dans les étalements de métaphase.

Cette image montre qu’une métaphase normale de souris se propage, aura 40 chromosomes acentriques. Le traitement par des matières particulaires induit diverses aberrations chromosomiques, telles qu’une rupture chromatidienne, un fragment acentrique, un chromosome annulaire, un chromosome dicentrique, des minutes doubles, une translocation robertsonienne et une endoréduplication. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler que seules des cellules proliférantes doivent être utilisées.

En suivant cette procédure, d’autres méthodes, telles que M-FISH et SKY, peuvent être utilisées pour répondre à des questions supplémentaires. Par exemple, la présence d’aberrations stables interchromosomiques. N’oubliez pas les précautions et les agents cancérigènes, ainsi que les précautions telles que le port de gants, doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.