Name: Peptide dérivé Méthode du transport des gènes et des protéines Across cellulaire et obstacles organites dans les plantes (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 48 s
Description: Découvrez une méthode peptidique innovante pour transporter gènes et protéines à travers les barrières cellulaires et organellaires chez Arabidopsis thaliana. Cette technique simplifie la transformation végétale avec une transfection assistée par seringue.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Les auteurs tiennent à remercier le financement du Japan Science and Technology Agency recherche exploratoire pour la technologie avancée (JST-ERATO), la Nouvelle Energie et Industrial Technology Development Organization (NEDO), et le Programme de promotion de l&#39;innovation stratégique Croix-ministérielle (SIP), le Japon .

1. Préparation de Formulations Peptide-Based <ol><li> Préparer des solutions mères de chaque peptide comme suit: (KH) 9 -BP100 (1 mg / ml ou 800 nM), Cytcox- (KH) 9 (1 mg / ml), BP100 (1 mg / ml) et (BP100) 2 K 8 (70 uM). Peser la quantité requise de chaque peptide dans un tube de 1,5 ml et ajouter de l&#39;eau ultra pure autoclavée pour dissoudre le peptide. Bien mélanger par pipetage répété jusqu&#39;à l&#39;obtention d&#39;une solution limpide. </li><li> Amplifier et purifier l&#39;ADN plasmidique (ADNp), l&#39;ADN double brin (ADNdb), et l&#39;ARN double brin (ARNdb) selon des méthodes moléculaires standards. Dans 1,5 ml microtubes, faire des solutions d&#39;achat d&#39;actions avec une concentration de 1 mg / ml (ADNp et ADNdb) ou 400 nM (ARNdb). </li><li> Préparer la solution de protéine mère avec une concentration de 7 pm, en dissolvant 1 mg de protéine (par ex., L&#39; alcool déshydrogénase, de l&#39; ADH) en poudre dans 1 ml de solution de carbonate de sodium (0,1 M, pH 9). Étiquette de la protéine avec fluorescent sondes telles que la rhodamine B (Rhb) selon des protocoles standards pour permettre la visualisation microscopique de la protéine délivrée dans les cellules. </li><li> Combiner les composants respectifs dans un tube de 1,5 ml. <ol><li> Pour les formulations peptide-ADNp ciblant le cytoplasme, ajouter 6,4 pi de (KH) 9 -BP100 (1 mg / ml) à 20 pi de ADNp (1 mg / ml) et bien mélanger par pipetage. On laisse le mélange se stabiliser pendant 15 min à 25 ° C. Ajouter 773,6 pi d&#39;eau ultra pure autoclavée pour diluer la solution à un volume final de 800 ul. Utiliser la construction d&#39;ADNp conçu pour l&#39; expression nucléaire (P35S-Rluc-TNOS, tableau 1). </li><li> Pour des formulations de peptides ciblant ADNp les mitochondries, ajouter 6,6 ul de Cytcox- (KH) 9 (1 mg / ml) à 20 pi d&#39;ADNp (1 mg / ml) et bien mélanger par pipetage. On laisse le mélange se stabiliser pendant 15 min à 25 ° C, puis on ajoute 2,4 pi de BP100 (1 mg / ml). On laisse le mélange se stabiliser pendant 15 min à 256; C pendant encore 15 min. Ajouter 771 pl d&#39;eau ultrapure à l&#39;autoclave pour diluer la solution à un volume final de 800 ul. Utiliser la construction d&#39;ADNp conçu pour l&#39; expression mitochondrial (pDONR-COX2: Rluc, tableau 1). </li><li> Pour les formulations peptide-ADNdb, ajouter 5,1 pi de (KH) 9 -BP100 (1 mg / ml) à 8 pi de dsDNA (1 mg / ml) et bien mélanger par pipetage. On laisse le mélange se stabiliser pendant 15 min à 25 ° C. Ajouter 786,9 pi d&#39;eau ultra pure autoclavée pour diluer la solution à un volume final de 800 ul. </li><li> Pour les formulations peptide-ARNdb, ajouter 50 pi de (KH) 9 -BP100 (800 nM) à 50 ul de ARNdb (400 nM) et bien mélanger par pipetage. On laisse le mélange se stabiliser pendant 15 min à 25 ° C. Ajouter 700 ul d&#39;eau sans RNase pour diluer la solution à un volume final de 800 ul. </li><li> Pour les formulations peptide-protéine, ajouter 16 pi de (BP100) 2 K 8 (70 uM) à 16 pi d&#39;ADH (7 uM) et mélangerbien par pipetage. On laisse le mélange se stabiliser pendant 15 min à 25 ° C. Ajouter 768 pl d&#39;eau ultrapure à l&#39;autoclave pour diluer la solution à un volume final de 800 ul. </li></ol></li><li> Laisser les formulations se stabiliser pendant 15 min à 25 ° C. </li></ol> 2. Caractérisation des Formulations Peptide-Based <ol><li> Transférer chaque solution (800 pi) dans une cuvette pour la diffusion de la lumière dynamique (DLS) analyse. Déterminer le diamètre et l&#39;indice de polydispersité hydrodynamique des complexes formés avec un nanosizer zêta, en utilisant un 633 nm laser He-Ne à 25 ° C avec un angle de détection de rétrodiffusion de 173 °. </li><li> Après les mesures de taille, transférer chaque solution (800 pi) dans une cellule capillaire plié pour les mesures du potentiel zêta à des paramètres par défaut de la constante diélectrique, l&#39;indice de réfraction et de la viscosité de l&#39;eau à 25 ° C. </li><li> Observer un petit volume d&#39;une solution complexe, utilisé pour l&#39;analyse DLS, par microscopie à force atomique (AFM). Dépôt de 10 pi de solution complexe sur la surface clivée fraîchement exposée d&#39;une feuille de mica et de laisser le mica à l&#39;air sécher pendant la nuit dans une boîte en plastique de Pétri couverte. </li><li> Acquérir une image des complexes dans l&#39; air à 25 ° C en utilisant un cantilever de silicium avec une constante de ressort de 1,3 N / m en mode 27,28 taraudage. </li></ol> 3. Infiltration des feuilles des plantes <ol><li> Utilisez vieilles plantes de sol cultivé 3 semaine (Arabidopsis thaliana 24, Nicotiana benthamiana 24 ou peuplier 26). Transfecter au moins 3 feuilles pour servir trois exemplaires pour la quantification de l&#39;expression du gène ou de la délivrance de protéines. </li><li> Charger une seringue de 1 ml sans aiguille en plastique avec 100 pi de solution complexe pour la transfection d&#39;une feuille. Positionner la pointe de la seringue sur la surface abaxiale de la feuille. </li><li> Appuyez sur la pointe de la seringue contre la feuille légèrement et appuyer sur le piston de la seringue lentement tout en exerçant une contre-pression à l&#39;idoigt ndex d&#39;une main de latex gantée du côté opposé. infiltration réussie peut être observé que la diffusion d&#39;une zone imbibée d&#39;eau dans la feuille. Etiqueter les feuilles infiltrées pour faciliter l&#39;identification. </li><li> Incuber la feuille transfectée pour des durées optimisées suivant l&#39;infiltration avec un peptide ADNp (12 h), le peptide-ADN natif (12 h), le peptide-ARNdb - formulations (9 48 hr) et le peptide à la protéine (6 heures) dans les conditions suivantes: 16 heures de lumière / 8 h obscurité à 22 ° C pour A. thaliana et le peuplier, ou 24 heures de lumière constante à 29 ° C pour N. benthamiana. </li></ol> 4. Évaluation de l&#39;efficacité de transfection <ol><li> Exciser la feuille entière transfectée de petites plantes (par ex., A. thaliana) , ou une partie de la zone infiltrée 1 cm 2 pour les installations plus grandes (par ex., N. benthamiana). </li><li> Pour les expériences de transfection utilisant la luciférase de Renilla (Rluc) vecteur rapporteur, déterminer le transfection efficacité quantitative à l&#39;aide d&#39;un kit Rluc Assay. <ol><li> Placez chaque feuille excisée ou de la section de la feuille dans un tube de microcentrifugation de 1,5 ml. Ajouter 100 pi de 1 × Rluc Assay Lysis Buffer par tube. De la même manière, préparer des lysats des feuilles témoins non transfectées (en triple). </li><li> Moudre la feuille à l&#39;aide d&#39;un pilon d&#39;homogénéisation et incuber le lysat résultant à 25 ° C pendant 6 à 10 h. </li><li> Centrifuger le lysat à 12 470 x g dans une microcentrifugeuse pendant 1 min. Transférer 20 ul du lysat clarifié à un puits dans une microplaque à 96 puits, et utiliser le volume restant pour la quantification de la concentration en protéine totale en utilisant un kit de dosage BCA Protein selon le protocole du fabricant. </li><li> Ajouter 100 pi de 1 × Rluc Assay Substrate (dilué à l&#39;aide du tampon Rluc Assay) dans le puits et mélanger par pipetage lent. Placer la microplaque dans un lecteur de microplaques multimodes et lancer la mesure. </li><li> Soustraire la luminescence de fond (moyenne du pasn-transfectées triple) de la luminescence de chaque échantillon expérimental. Calculer le rapport de photoluminescence (unités de lumière relative, RLU) à la quantité de protéine (mg). </li></ol></li><li> Pour les expériences de transfection en utilisant une protéine fluorescente (GFP) vecteur rapporteur vert ou protéine marquée par fluorescence (par exemple., ADH-RhB), observer la fluorescence en utilisant un confocal à balayage laser microscope. <ol><li> Couper les bords d&#39;une feuille entière (pour faciliter l&#39;élimination des vides d&#39;air), tandis qu&#39;une feuille sectionnée peut être utilisé tel quel. Retirer le piston d&#39;une seringue de 10 ml et placer chaque article de feuille ou une feuille excisée dans la seringue. </li><li> Remplacer le piston et le pousser doucement vers le fond de la seringue sans écraser la feuille. Dessinez l&#39;eau dans la seringue jusqu&#39;à ce qu&#39;il soit à peu près la moitié rempli. </li><li> Pointez la seringue vers le haut et pousser le piston pour éliminer l&#39;air de la seringue à travers la pointe. Couvrir la pointe de la seringue et tirez doucement le piston pour expulser l&#39;air du IcaF. Répétez cette opération plusieurs fois jusqu&#39;à ce que la feuille apparaît translucide. </li><li> Recouvrir la surface d&#39;une lame de microscope avec un ruban adhésif. Couper un carré sur la bande assez grand pour accueillir l&#39;échantillon de feuille en utilisant une lame, et peler la pièce carrée de bande hors avec une pince pour créer une chambre d&#39;échantillon. La bande servira une entretoise entre la lame et lamelle. </li><li> Placez la feuille dans la chambre avec la surface abaxiale vers le haut et remplir la zone de la chambre restante avec de l&#39;eau. Sceller la feuille à l&#39;intérieur de la chambre avec une lamelle de verre et fixer les bords de la lamelle couvre-objet avec du ruban adhésif. </li><li> Examiner l&#39;échantillon de feuille à l&#39;aide du confocale à balayage laser sous un objectif 40X ou 63X objectif à immersion dans l&#39;eau. GFP ou Rhb fluorescence peuvent être visualisées à des longueurs d&#39;onde d&#39;excitation de 488 nm ou 555 nm, respectivement. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Altman, A., Hasegawa, P. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAltman%2C+A+%22Plant+biotechnology+and+agriculture%3A+Prospects+for+the+21st+century%22">Plant biotechnology and agriculture: Prospects for the 21st century</a>. , Academic Press. Cambridge, MA. (2011).</li>
<li>Horn, M. E., Woodard, S. L., Howard, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+molecular+farming%3A+systems+and+products%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Plant molecular farming: systems and products.</a> Plant Cell Rep. 22, 711-720 (2004).</li>
<li>Gelvin, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agrobacterium-mediated+plant+transformation%3A+the+biology+behind+the+%26%2334%3Bgene-jockeying%26%2334%3B+tool%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol.+Mol.+Biol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Agrobacterium-mediated plant transformation: the biology behind the &#34;gene-jockeying&#34; tool.</a> Microbiol. Mol. Biol. Rev. 67, 16-37 (2003).</li>
<li>Klein, T. M., Wolf, E. D., Wu, R., Sanford, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-velocity+microprojectiles+for+delivering+nucleic+acids+into+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">High-velocity microprojectiles for delivering nucleic acids into living cells.</a> Nature. 327, 70-73 (1987).</li>
<li>Fromm, M., Taylor, L. P., Walbot, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+genes+transferred+into+monocot+and+dicot+plant+cells+by+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Expression of genes transferred into monocot and dicot plant cells by electroporation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 82, 5824-5828 (1985).</li>
<li>Krens, F. A., Molendijk, L., Wullems, G. J., Schilperoort, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+transformation+of+plant+protoplasts+with+Ti-plasmid+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vitro transformation of plant protoplasts with Ti-plasmid DNA.</a> Nature. 296, 72-74 (1982).</li>
<li>Birch, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+transformation%3A+problems+and+strategies+for+practical+application%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Plant+Physiol.+Plant+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Plant transformation: problems and strategies for practical application.</a> Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 48, 297-326 (1997).</li>
<li>Newell, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+transformation+technology.+Developments+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Plant transformation technology. Developments and applications.</a> Mol. Biotechnol. 16, 53-65 (2000).</li>
<li>Nielsen, K. M., Bones, A. M., Smalla, K., van Elsas, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Horizontal+gene+transfer+from+transgenic+plants+to+terrestrial+bacteria--a+rare+event%3F%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Horizontal gene transfer from transgenic plants to terrestrial bacteria--a rare event?</a> FEMS Microbiol. Rev. 22, 79-103 (1998).</li>
<li>Chuah, J. A., Kaplan, D., Numata, K. Chapter 25, Engineering peptide-based carriers for drug and gene delivery. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aChuah%2C+JA+%22Engineering+in+Translational+Medicine%22">Engineering in Translational Medicine</a>. Cai, W. , Springer. 667-689 (2014).</li>
<li>Nitta, S., Numata, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biopolymer-based+nanoparticles+for+drug%2Fgene+delivery+and+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Mol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Biopolymer-based nanoparticles for drug/gene delivery and tissue engineering.</a> Int. J. Mol. Sci. 14, 1629-1654 (2013).</li>
<li>Numata, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poly%28amino+acid%29s%2Fpolypeptides+as+potential+functional+and+structural+materials%5BTitle%5D)+AND+%22Polym.+J%22%5BJournal%5D)">Poly(amino acid)s/polypeptides as potential functional and structural materials.</a> Polym. J. 47, 537-545 (2015).</li>
<li>Numata, K., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silk-based+delivery+systems+of+bioactive+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Drug+Deliv.+Rev%22%5BJournal%5D)">Silk-based delivery systems of bioactive molecules.</a> Adv. Drug Deliv. Rev. 62, 1497-1508 (2010).</li>
<li>Numata, K., Subramanian, B., Currie, H. A., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioengineered+silk+protein-based+gene+delivery+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Bioengineered silk protein-based gene delivery systems.</a> Biomaterials. 30, 5775-5784 (2009).</li>
<li>Chugh, A., Eudes, F., Shim, Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-penetrating+peptides%3A+nanocarrier+for+macromolecule+delivery+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22IUBMB+Life%22%5BJournal%5D)">Cell-penetrating peptides: nanocarrier for macromolecule delivery in living cells.</a> IUBMB Life. 62, 183-193 (2010).</li>
<li>Eggenberger, K., Mink, C., Wadhwani, P., Ulrich, A. S., Nick, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+the+peptide+Bp100+as+a+cell-penetrating+tool+for+the+chemical+engineering+of+actin+filaments+within+living+plant+cells%5BTitle%5D)+AND+%22ChemBioChem%22%5BJournal%5D)">Using the peptide Bp100 as a cell-penetrating tool for the chemical engineering of actin filaments within living plant cells.</a> ChemBioChem. 12, 132-137 (2011).</li>
<li>Numata, K., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silk-based+gene+carriers+with+cell+membrane+destabilizing+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Silk-based gene carriers with cell membrane destabilizing peptides.</a> Biomacromolecules. 11, 3189-3195 (2010).</li>
<li>Numata, K., Hamasaki, J., Subramanian, B., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+delivery+mediated+by+recombinant+silk+proteins+containing+cationic+and+cell+binding+motifs%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Control.+Release%22%5BJournal%5D)">Gene delivery mediated by recombinant silk proteins containing cationic and cell binding motifs.</a> J. Control. Release. 146, 136-143 (2010).</li>
<li>Numata, K., Mieszawska-Czajkowska, A. J., Kvenvold, L. A., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silk-based+nanocomplexes+with+tumor-homing+peptides+for+tumor-specific+gene+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Macromol.+Biosci%22%5BJournal%5D)">Silk-based nanocomplexes with tumor-homing peptides for tumor-specific gene delivery.</a> Macromol. Biosci. 12, 75-82 (2012).</li>
<li>Numata, K., Reagan, M. R., Goldstein, R. H., Rosenblatt, M., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spider+silk-based+gene+carriers+for+tumor+cell-specific+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chem%22%5BJournal%5D)">Spider silk-based gene carriers for tumor cell-specific delivery.</a> Bioconjugate Chem. 22, 1605-1610 (2011).</li>
<li>Chuah, J. A., Yoshizumi, T., Kodama, Y., Numata, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+introduction+into+the+mitochondria+of+Arabidopsis+thaliana+via+peptide-based+carriers%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Gene introduction into the mitochondria of Arabidopsis thaliana via peptide-based carriers.</a> Sci. Rep. 5, 7751(2015).</li>
<li>Plant transformation method. Patent. , WO2015133652 A1 (2015).</li>
<li>Ng, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+delivery+of+proteins+in+intact+plants+via+fusion+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Intracellular delivery of proteins in intact plants via fusion peptides.</a> PLoS ONE. 11, e0154081(2016).</li>
<li>Lakshmanan, M., Kodama, Y., Yoshizumi, T., Sudesh, K., Numata, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+efficient+gene+delivery+into+plant+cells+using+designed+peptide+carriers%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Rapid and efficient gene delivery into plant cells using designed peptide carriers.</a> Biomacromolecules. 14, 10-16 (2012).</li>
<li>Lakshmanan, M., Yoshizumi, T., Sudesh, K., Kodama, Y., Numata, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double-stranded+DNA+introduction+into+intact+plants+using+peptide-DNA+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Double-stranded DNA introduction into intact plants using peptide-DNA complexes.</a> Plant Biotechnol. 32, 39-45 (2015).</li>
<li>Numata, K., Ohtani, M., Yoshizumi, T., Demura, T., Kodama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+gene+silencing+in+plants+via+synthetic+dsRNA+and+carrier+peptide%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Biotechnol.+J%22%5BJournal%5D)">Local gene silencing in plants via synthetic dsRNA and carrier peptide.</a> Plant Biotechnol. J. 12, 1027-1034 (2014).</li>
<li>Numata, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+degradation+processes+of+poly%5B%28R%29-3-hydroxybutyric+acid%5D+and+poly%5B%28R%29-3-hydroxybutyric+acid-co-%28R%29-3-hydroxyvaleric+acid%5D+single+crystals+revealed+by+atomic+force+microscopy%3A+effects+of+molecular+weight+and+second-monomer+composition+on+erosion+rates%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Enzymatic degradation processes of poly[(R)-3-hydroxybutyric acid] and poly[(R)-3-hydroxybutyric acid-co-(R)-3-hydroxyvaleric acid] single crystals revealed by atomic force microscopy: effects of molecular weight and second-monomer composition on erosion rates.</a> Biomacromolecules. 6, 2008-2016 (2005).</li>
<li>Numata, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adsorption+of+biopolyester+depolymerase+on+silicon+wafer+and+poly%5B%28R%29-3-hydroxybutyric+acid%5D+single+crystal+revealed+by+real-time+AFM%5BTitle%5D)+AND+%22Macromol.+Biosci%22%5BJournal%5D)">Adsorption of biopolyester depolymerase on silicon wafer and poly[(R)-3-hydroxybutyric acid] single crystal revealed by real-time AFM.</a> Macromol. Biosci. 6, 41-50 (2006).</li>
<li>Kawai, S., Nishizawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+procedure+for+DNA+transfection+with+polycation+and+dimethyl+sulfoxide%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">New procedure for DNA transfection with polycation and dimethyl sulfoxide.</a> Mol. Cell. Biol. 4, 1172-1174 (1984).</li>
<li>Liu, F., Song, Y., Liu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrodynamics-based+transfection+in+animals+by+systemic+administration+of+plasmid+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Hydrodynamics-based transfection in animals by systemic administration of plasmid DNA.</a> Gene Ther. 6, 1258-1266 (1999).</li>
<li>Luo, D., Saltzman, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancement+of+transfection+by+physical+concentration+of+DNA+at+the+cell+surface%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Enhancement of transfection by physical concentration of DNA at the cell surface.</a> Nat. Biotechnol. 18, 893-895 (2000).</li>
<li>Boynton, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chloroplast+transformation+in+Chlamydomonas+with+high+velocity+microprojectiles%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Chloroplast transformation in Chlamydomonas with high velocity microprojectiles.</a> Science. 240, 1534-1538 (1988).</li>
<li>Sikdar, R. S., Serino, G., Chaudhuri, S., Maliga, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plastid+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Arabidopsis+thaliana+Plant+Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Plastid transformation.</a> Arabidopsis thaliana Plant Cell Rep. 18, 20-24 (1998).</li>
<li>Svab, Z., Hajdukiewicz, P., Maliga, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+transformation+of+plastids+in+higher+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Stable transformation of plastids in higher plants.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 87, 8526-8530 (1990).</li>
<li>Liu, Y. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complementation+of+plant+mutants+with+large+genomic+DNA+fragments+by+a+transformation-competent+artificial+chromosome+vector+accelerates+positional+cloning%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Complementation of plant mutants with large genomic DNA fragments by a transformation-competent artificial chromosome vector accelerates positional cloning.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96, 6535-6540 (1999).</li>
<li>Park, H. S., Lee, B. M., Salas, G. M., Srivatanakul, M., Smith, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shorter+T-DNA+or+additional+virulence+genes+improve+Agrobactrium-mediated+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Theor.+Appl.+Genet%22%5BJournal%5D)">Shorter T-DNA or additional virulence genes improve Agrobactrium-mediated transformation.</a> Theor. Appl. Genet. 101, 1015-1020 (2000).</li>
<li>Frary, A., Hamilton, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficiency+and+stability+of+high+molecular+weight+DNA+transformation%3A+an+analysis+in+tomato%5BTitle%5D)+AND+%22Transgenic+Res%22%5BJournal%5D)">Efficiency and stability of high molecular weight DNA transformation: an analysis in tomato.</a> Transgenic Res. 10, 121-132 (2001).</li>
<li>Que, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maize+transformation+technology+development+for+commercial+event+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">Maize transformation technology development for commercial event generation.</a> Front. Plant Sci. 5, 379(2014).</li>
<li>Miranda, A., Janssen, G., Hodges, L., Peralta, E. G., Ream, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agrobacterium+tumefaciens+transfers+extremely+long+T-DNAs+by+a+unidirectional+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Agrobacterium tumefaciens transfers extremely long T-DNAs by a unidirectional mechanism.</a> J. Bacteriol. 174, 2288-2297 (1992).</li>
<li>Loeb, T. A., Spring, L. M., Steck, T. R., Reynolds, T. L. Transgenic wheat (Triticum spp.). <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLoeb%2C+TA+%22Transgenic+Crops+I%22">Transgenic Crops I</a>. Bajaj, Y. P. S. , Springer. 14-36 (2000).</li>
</ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à dévoiler.

Les étapes critiques au sein du protocole qui ont été identifiées de façon empirique sont discutées. Par infiltration seringue, les formulations à base de peptides sont introduits dans les espaces aériens à l&#39;intérieur de la feuille de la plante à travers les stomates. Pour assurer l&#39; absorption maximale de la solution, le processus d&#39;infiltration doit être effectuée lorsque les plantes sont dans des conditions qui sont propices à l&#39; ouverture stomatique ie., Fournis avec suffisamment d&#39; eau et pendant la période de lumière. En ce qui concerne la préparation des complexes de transfection, pour les formulations qui impliquent une combinaison de deux peptides (pour la délivrance d&#39;ADN mitochondrial ciblée), la séquence d&#39;addition de chaque composant est essentielle et ne doit pas être inversée. Il existe de nombreuses modifications vraisemblables de la procédure. Une autre option pour l&#39;infiltration des cellules végétales est l&#39;utilisation d&#39;une infiltration sous vide, qui est capable d&#39;introduire la solution du complexe dans des plantes entières et / ou partielles, y compris les tissusméristème apical. Pour cette procédure alternative, les plants sont submergées dans la solution de transfection, et en fonction de la pression générée par le vide, les complexes de peptide-cargo sont contraints par les stomates et dans les cellules végétales (Yoshizumi, T., données non publiées). L&#39; expression transitoire du gène, basée sur des études utilisant des cellules animales, a été démontré que l&#39;augmentation des concentrations d&#39; ADN plus élevées avec 29-31. Il est important de noter que le rapport du peptide à l&#39; ADN affecte les propriétés biophysiques (taille, la charge de surface) , des complexes (figure 4), qui influe sur l&#39; efficacité de transfection; Par conséquent, le rapport optimal doit être maintenu, même avec une concentration accrue de l&#39;ADN. L&#39;un des principaux avantages de l&#39;utilisation des peptides comme un agent de prestation gène / protéine est que sa séquence est prête à accorder à remplir une fonction souhaitée. Par exemple, le domaine de ciblage mitochondrial du peptide de support décrit dans ce ploty peuvent être remplacées par des séquences chloroplastiques ou peroxysomaux ciblage pour la localisation de ces organites. Tandis que la transformation de chloroplastes est possible de plusieurs plantes en utilisant la biolistique 32-34, ni Agrobacterium , ni la méthode biolistique pourraient introduire des gènes dans les mitochondries et autres organites en dehors du noyau (tableau 2). Il n&#39;y a pas de limitations gamme d&#39; hôtes rigides pour la transfection à base de peptides, à la différence de la méthode à base d&#39; Agrobacterium (tableau 2). Jusqu&#39;à présent, les formulations pour la transfection de A. thaliana, N. benthamiana et le peuplier ont été optimisés (tableau 1), mais la méthode peut également être appliquée pour Nicotiana tabacum, cultivar de tomate micro-Tom, le riz (à partir d&#39;expériences préliminaires) et d&#39;autres plantes mono- et dicotylédones. Jusqu&#39;à présent, il n&#39;y a pas de limitation connue de la taille du transgène lorsque les peptides sont utilisés, undes vecteurs de transfection. En revanche, les grandes molécules d&#39;ADN ont été trouvés pour réduire l&#39;efficacité de transformation médiées par Agrobacterium méthodes 35,36, et une limite de taille supérieure pour les transgènes d&#39;environ 200 kb a été rapportée 37-39. En utilisant la biolistique, d&#39;autre part, de grands fragments d&#39;ADN peuvent être cisaillées lors de la préparation ou de la livraison dans des plantes 38. Bien qu&#39;aucune limite supérieure n&#39;a été déterminée pour une transformation biolistique jusqu&#39;à présent, des contraintes physiques ont été trouvées pour limiter la taille de l&#39; ADN qui peut être transféré à moins de 150 kb 40. Les principaux avantages de l&#39; utilisation du système à base de peptides pour le transfert de gènes par rapport aux approches existantes employant soit Agrobacterium ou le bombardement de microprojectiles, discutées ci - dessus, sont résumés dans le tableau 2. Quelques limitations existent pour cette méthode telle qu&#39;elle est. En premier lieu, la livraison de l&#39;ADNp ciblé vers des organites spécifiques, tels que la mitochondria, a été prouvée possible par une simple combinaison de séquences de pénétration des cellules et un organite transit liaison à l&#39;ADN, bien que l&#39;efficacité a été faible. L&#39;expression du transgène peut être détectée, par microscopie confocale, seule une petite population de cellules au sein de la mitochondrie. Par conséquent, d&#39;autres modifications sont nécessaires pour: (i) améliorer la translocation des plus complexes à travers la cellule / membrane des organites, et (ii) améliorer la dissociation et le transfert de ADNp du peptide porteur dans l&#39;organite cible pour l&#39;expression. En second lieu, l&#39;utilisation de ce système de délivrance d&#39;ADN, l&#39;expression transitoire des gènes rapporteurs exogènes a été atteint avec succès dans le compartiment cytosolique et mitochondriale des cellules. incorporation stable et l&#39;expression des gènes introduits dans le nucléaire de la plante / génome organites ont pas encore été établie mais, en raison de l&#39;absence de stratégies de sélection appropriés. Tout en reconnaissant qu&#39;il existe des zones d&#39;amélioration ou encore développement, la stratégie de peptide dérivé décrit ici reste une technique simple et polyvalent qui a ouvert la voie à la livraison de divers cargaisons en types de plantes diverses.

Le génie génétique végétal est classiquement utilisé pour transférer des caractères bénéfiques aux plantes. Ces dernières années, cette technologie a été appliquée pour convertir des plantes en bio-usines pour la production de protéines pharmaceutiquement importantes et commercialement précieuses, dont beaucoup ne peuvent pas être synthétisées chimiquement et sont très coûteuses à produire à l’aide de systèmes animaux ou microbiens1. Grâce à l’introduction de nouveaux gènes, le métabolisme de la plante peut être manipulé pour la production de divers produits biopharmaceutiques tels que des anticorps, des enzymes métaboliques, des hormones, des antigènes ou un vaccin2.
Les technologies de transfert de gènes établies pour les plantes sont l’administration3 médiée par Agrobacterium, le bombardement avec des microprojectiles enrobés d’ADN (biolistiques)4, et le traitement par électroporation5 ou polyéthylène glycol6 des protoplastes. Les techniques nécessitant des protoplastes sont généralement évitées car elles prennent du temps, sont lourdes et donnent des résultats incohérents7. En conséquence, pratiquement tous les travaux de modification des plantes utilisent actuellement soit Agrobacterium, soit des microprojectiles pour le transfert de gènes. La méthode Agrobacterium est plus largement utilisée, mais ne s’applique pas à de nombreuses espèces végétales économiquement importantes. Pendant ce temps, le bombardement de microprojectiles est plus polyvalent en raison d’un large éventail de plantes sensibles, mais nécessite un équipement spécialisé et cause souvent de graves lésions tissulaires. De plus, ces méthodes impliquent un mécanisme d’administration aléatoire (biolistique) ou complexe (Agrobacterium) et ont des taux de transformation variables8. Par conséquent, une nouvelle technologie de transformation des plantes, simple mais efficace, et applicable à différents types de plantes est nécessaire.
Actuellement, les plantes sont soumises à une modification génétique principalement par l’administration d’ADN exogène codant pour un caractère souhaité, plutôt que par l’administration directe d’une protéine cible. La plus grande stabilité de l’ADN par rapport aux protéines est un avantage primordial ; néanmoins, les problèmes potentiels associés à l’administration de l’ADN comprennent l’insertion aléatoire d’ADN exogène dans le génome de la plante et la transmission involontaire de gènes de résistance aux antibiotiques à des bactéries pathogènes via le transfert horizontal de gènes9. À des fins d’édition du génome, la possibilité de modifier les génomes des plantes sans introduire d’ADN étranger dans les cellules peut contourner les préoccupations réglementaires liées aux plantes génétiquement modifiées. Ainsi, une stratégie alternative sans ADN pour la modification des plantes par livraison directe de protéines pourra répondre à ces besoins.
Ici, nous présentons un système à base de peptides, développé à l’origine pour la thérapie génique humaine10-14, pour l’administration ciblée de gènes ou de protéines exogènes dans des plantes intactes. Les peptides sont capables de protéger l’ADN de la dégradation des nucléases et peuvent médier le transfert de gènes à travers les membranes cellulaires et organellaires15-17. Ils ont également des propriétés diverses et réglables en plus d’être non cytotoxiques18-20. Plus important encore, avec l’utilisation de peptides, les gènes peuvent être ciblés avec précision sur les organites intracellulaires tels que les mitochondries21 ou les plastes (chloroplastes)22 pour l’expression - une tâche qui n’est pas réalisable par transformation biolistique ou médiée par Agrobacterium. Selon le type de cargaison, cette nouvelle technologie de modification de la plante peut être exploitée pour délivrer des protéines23 et exprimer (plasmide21,24 ou ADN double brin25) ou réguler à la baisse (ARN double brin26) des gènes spécifiques au sein de la plante, dans son espace cytosolique24-26 ou dans un compartiment organellaire spécifique21. Les peptides porteurs conçus sont constitués d’un domaine cationique sous la forme de polylysine (K8) ou de polylysine-co-histidine (KH)9 pour la liaison et/ou la condensation de cargaisons chargées négativement, qui est conjugué à des séquences pénétrantes dans les cellules (peptide BP100) ou mitochondriales (peptide Cytcox).

<table><tbody><tr><td>Peptide (KH)9-BP100</td><td>Synthétisé sur mesure par RIKEN Brain Science Institute</td><td>N/A</td><td>Séquence : KHKHKHKHKHKHKHKH- KHKKLFKKILKYL</td></tr><tr><td>(BP100)2-K8 peptide</td><td>Synthétisé sur mesure par RIKEN Brain Science Institute</td><td>N/A</td><td>Séquence : KKLFKKILKYLKKLFKKIL- </td>peptide KYLKKKKKKKK</tr><tr><td>BP100</td><td>Synthétisé sur mesure par RIKEN Brain Science Institute</td><td>N/A</td><td>Séquence : KKLFKKILKYL</td></tr><tr><td>Cytcox-(KH)9 Peptide</td><td>Synthétisé sur mesure par RIKEN Brain Science Institute</td><td>N/A</td><td>Séquence : MLSLRQSIRFFKKHKHKH- KHKHKHKHKHKH</td></tr><tr><td>P35S-GFP(S65T)-TNOS et P35S-RLuc-TNOS</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Code pour les gènes de la protéine fluorescente verte et de la Renilla luciferase, respectivement, sous le contrôle du promoteur constitutif du CaMV 35S (Réf. : Lakshmanan et al. Biomacromolécules 2013, 14, 10)</td></tr><tr><td>pDONR-cox2 :gfp et pDONR-cox2 :rluc</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Codage pour la protéine fluorescente verte et les gènes de la Renilla luciferase, respectivement, sous le contrôle du promoteur spécifique mitochondrial de la cox2 (Réf. : Chuah et al. Sci Rep 2015, 5, 7751)</td></tr><tr><td>ADNdb (amplifié par PCR à partir de pBI221-P35S-Rluc-TNOS)</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Encode la protéine fluorescente verte et des gènes Renilla luciferase, respectivement, sous le contrôle du promoteur constitutif CaMV 35S (Réf : Lakshmanan et al. Plant Biotechnol 2015, 32, 39)</td></tr><tr><td>GFP5 siRNA</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Pour le silençage médié par interférence ARN de la protéine fluorescente verte (Réf : Numata et al. Plant Biotechnol J 2014, 12, 1027)</td></tr><tr><td>CHS siRNA</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Pour le silençage médié par interférence ARN de la chalcone synthase (Réf : Numata et al Plant Biotechnol J 2014, 12, 1027)</td></tr><tr><td>Seringues en plastique de 1 ml et 10 ml</td><td>TERUMO Corporation</td><td>SS-01T, SS-10ESZ</td><td></td></tr><tr><td>Tube de microcentrifugation de 1,5 ml</td><td>AS ONE Corporation</td><td>151212</td><td></td></tr><tr><td>plaque à fond plat à 96 puits</td><td>Asahi Glass Co., Ltd.</td><td>3860-096</td><td></td></tr><tr><td>Ruban adhésif</td><td>Sekisui Chemical Co., Ltd.</td><td>N° 835</td><td></td></tr><tr><td>Alcool déshydrogénase</td><td>Sigma-Aldrich Co., LLC.</td><td>A-7011</td><td></td></tr><tr><td>Microscope à force atomique</td><td>Seiko Instruments Inc.</td><td>SPI3800, Microscope à force atomique SPA 300HV</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Hitachi High-Tech Science Corporation</td><td>AFM5300E</td><td></td></tr><tr><td>Kit de dosage des protéines BCA</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td><td>23227</td><td></td></tr> Microscope confocal à balayage laser <tr><td>K-A102001593</td><td></td>en<td>porte-à-faux</td><td>Hitachi High-Tech Science Corporation</td></tr><tr><td></td><td>Carl Zeiss</td><td>LSM700</td><td></td></tr><tr><td>Perceuse de liège</td><td>Sigma-Aldrich Co., LLC.</td><td>Z165220</td><td>Pour l’excision des feuilles en disques de 1 cm</td></tr><tr><td>de diamètre Coverslip</td><td>Matsunami Glass Ind., Ltd.</td><td>C02261</td><td></td></tr><tr><td>Cuvette</td><td>Sarstedt</td><td>759116</td><td></td></tr><tr><td>Cellule capillaire pliée</td><td>Malvern Instruments, Ltd.</td><td></td><td></td>DTS1070</tr><tr><td>Forceps</td><td>Shimizu Akira Inc.</td><td>Pince en acier inoxydable 150</td><td></td></tr><tr><td>Homogénéisation Pilon</td><td>Ieda Trading Corp.</td><td>9993</td><td></td></tr><tr><td>Mica</td><td>Nisshin EM Co., Ltd.</td>Microcentrifugeuse <td>LC23Z</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Beckman Coulter</td><td>BKA46472</td><td></td></tr><tr><td>Lecteur de microplaques</td><td>Molecular Devices Corporation</td><td>Spectra MAX M3</td><td></td></tr><tr><td>Lame de microscope</td><td>Matsunami Glass Ind., Ltd.</td><td></td><td></td>S011120</tr><tr><td>Pipette</td><td>Eppendorf Research&reg ; plus</td><td>3120000909</td><td></td></tr><tr><td>Pointes de pipette</td><td>AS ONE Corporation</td><td>2-5138-01, 2-5138-02, 2-5138-03</td><td></td></tr><tr><td>Boîte de Pétri en plastique</td><td>AS ONE Corporation</td><td>1-7484-01</td><td></td></tr><tr><td>Renilla Luciferase Kit de dosage</td><td>Promega corporation</td><td>E2810</td><td></td></tr><tr><td>Isothiocyanate</td> <td>de rhodamine BSigma-Aldrich Co., LLC.</td><td></td><td></td>283924</tr><tr><td>Eau sans RNase</td><td>Qiagen</td><td>129112</td><td></td></tr><tr><td>Carbonate de sodium</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td><td>199-01585</td><td></td></tr><tr><td>Lame et manche chirurgicaux</td><td>FEATHER Safety Razor Co., Ltd.</td><td>Acier inoxydable n° 14 (lame), n° 3L (poignée)</td><td></td></tr><tr><td>Capuchon d’embout de seringue</td><td>Musashi Engineering Inc.</td><td>NC-3E</td><td></td></tr><tr><td>Balance de pesage</td><td>Sartorius</td><td>CPA225D</td><td></td></tr><tr><td>Potentiomètre Zeta</td><td>Malvern Instruments, Ltd.</td><td>Zetasizer Nano-ZS</td><td></td></tr></tbody></table>

peptide dérivé méthode du transport des gènes et des protéines across cellulaire et obstacles organites dans les plantes

Peptide-derived Method to Transport Genes and Proteins Across Cellular and Organellar Barriers in Plants

La capacité d’introduire des protéines exogènes et d’exprimer (ou de réguler à la baisse) des gènes spécifiques chez les plantes constitue un outil puissant pour la recherche fondamentale ainsi que pour de nouvelles applications dans le domaine de la biotechnologie végétale. Les méthodes viables qui existent actuellement pour le transfert de protéines ou de gènes dans les cellules végétales, à savoir Agrobacterium et le bombardement de microprojectiles, présentent les inconvénients d’une faible fréquence de transformation, d’une gamme d’hôtes limitée ou d’un coût élevé d’équipement et de microvecteurs. Le protocole suivant décrit une méthode simple et polyvalente, qui utilise des peptides conçus rationnellement comme agents d’administration pour une variété de cargaisons à base d’acides nucléiques et de protéines dans les plantes. Les peptides sont sélectionnés comme outils pour le développement du système en raison de leur biodégradabilité, de leur taille réduite, de leurs propriétés diverses et réglables ainsi que de leur capacité à obtenir un accès intracellulaire/organulé. La préparation, la caractérisation et l’application de formulations optimisées pour chaque type de la large gamme de cargaisons livrées (ADN plasmidique, ADN ou ARN double brin et protéines) sont décrites. Les étapes critiques du protocole, les modifications possibles et les limites existantes de la méthode sont également abordées.

Un tableau de protéines et acides nucléiques cargaisons ont été introduits avec succès dans diverses plantes en utilisant les peptides conçus comme vecteurs de délivrance. Des interactions électrostatiques entre les peptides cationiques et les marchandises chargées négativement ont donné lieu à la formation de complexes de transfection qui peuvent être directement infiltrés dans les feuilles des plantes à l&#39; aide d&#39; une seringue sans aiguille (figure 1). Formulations optimisées (empiriquement déterminées dans ces études 21,23-26) pour la transfection de cellules végétales sont répertoriées dans le tableau 1, où chaque type de la vaste gamme de marchandises livrées (ADNp, ADNdb, ARNdb et de protéines) est représenté. Les diamètres moyens de toutes les formulations à base de peptides étaient dans la gamme approximative de 150-300 nm. Sur la base de l&#39;analyse DLS, toutes les formulations affichées polydispersité relativement faible taille, ce qui indique que les agrégats de peptides cargo formés ont une répartition granulométrique uniforme. Les morphologiescomplexes entre le peptide et ADNp (figure 2A) ou de la protéine (figure 2B), le mica, ont été imagées par AFM. des complexes globulaires homogènes ont été observées pour les deux combinaisons de peptides ADNp et du peptide-protéine, en accord avec les données provenant des mesures DLS. En termes de potentiel zêta des complexes (tableau 1), pDNA- et complexes dsDNA dérivés avaient des charges nettes de surface négative tandis que les complexes à base de ARNdb avaient une charge quasi neutre surface. des complexes peptide-protéine, d&#39;autre part, ont été chargés positivement. Les rendements de peptide-ADNp et formulations peptide-ADNdb dans la médiation de la transfection de A. thaliana ou N. benthamiana en tant que systèmes modèles de plantes ont été évalués quantitativement et qualitativement. Le dosage de l&#39; expression du gène Rluc a été utilisé pour la quantification des niveaux d&#39;expression des gènes (tableau 1), par conséquent, pour cette expérience ADNp ouADN double brin codant pour le gène Rluc doit être utilisé pour la complexation avec les peptides porteurs respectifs. En utilisant le (KH) 9 -BP100 / formulation de l&#39; ADNp, la livraison et l&#39; expression de l&#39; ADNp nucléaire ciblée peut être atteint, après une période d&#39;incubation de 12 h, avec un RLU / mg valeur estimée d&#39;environ 1 × 10 5. Pour la livraison mitochondriale ciblée et l&#39; expression de l&#39; ADNp, une combinaison de peptides, Cytcox- (KH) , et BP100 9, est nécessaire pour la formation du complexe. Avec la même période d&#39;incubation optimale de 12 heures, cependant, un taux beaucoup plus faible de transfection (environ 1 x 10 3 RLU / mg) a été atteint. Pendant ce temps, la même période d&#39;incubation (12 heures) et le niveau d&#39;expression du gène (environ 1 x 10 3 RLU / mg) ont été nécessaires / enregistrées pour les complexes à base d&#39;ADN double brin, a également formulé en utilisant le (KH) 9 -BP100 peptide. Les évaluations qualitatives de l&#39;expression des gènes ont été réalisées par l&#39;observation microscopique directe de feuilles traitées avec des complexes prépared utilisant ADNp ou dsDNA codant pour le gène rapporteur GFP. Dans les cellules transfectées avec des complexes non ciblés peptide ADNp, diffuse la fluorescence verte correspondant à l&#39; expression de la GFP a été clairement observée et on a trouvé localiser dans le cytosol (figure 3A). nettes différences dans le modèle de localisation de la fluorescence de la GFP étaient évidents dans les cellules infiltrées avec des complexes de peptide-ADNp mitochondriales ciblée. Ici, la fluorescence verte punctiformes qui colocalisent avec le colorant mitochondrial était visible, ce qui confirme la spécificité de l&#39; expression du gène exclusivement dans le compartiment mitochondriale des cellules (figure 3B). Dans le cas de formulations de peptide-protéine, la conjugaison de la cargaison de la protéine (ADH) à un fluorophore (Rhb) permettra la visualisation de la protéine délivrée dans le compartiment intracellulaire. Au sein d&#39;une courte période d&#39;incubation de 6 heures, la protéine ADH-RhB (bleu) a été trouvé pour être distribué dansle cytosol et la vacuole des cellules infiltrées (figure 3C). Pendant ce temps, une régulation rapide et efficace de l&#39;expression génique peut être réalisée dans diverses plantes en utilisant des formulations de peptides ARNdb. Dans la première expérience, A. thaliana feuille a été infiltrée avec le peptide-ARNdb Complexes pour réduire au silence le gène de la chalcone synthase (CHS) responsable de l&#39; anthocyanine (pigment rouge) biosynthèse dans des conditions de sécheresse. La différence dans l&#39; apparence de A. thaliana laisse sous la normale (Figure 3D, a) et des conditions de sécheresse (Figure 3D, b) fourni un moyen facile d&#39;évaluer le SHC silencieux en utilisant la formulation peptide-ARNdb optimisé (flèche 1 indique la région infiltrée). Dans la deuxième expérience, les complexes de peptide-ARNdb ont été infiltrés dans les feuilles d&#39;Arabidopsis thaliana transgénique exprimant la protéine fluorescente jaune (YFP). Une réduction apparente de l&#39;expression YFP peut être vu dans les cellules de l&#39;épiderme 9 h post-transfection (Figure 3E, F). L&#39;efficacité de la formulation dans l&#39; expression du gène de régulation négative dans un système de plante différente (peuplier, 12 heures après la transfection) a également été vérifiée (figure 3G, H). <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/54972/54972fig1.jpg" /> Figure 1: Formulations à base de peptides pour la livraison de l&#39; acide nucléique et des cargaisons de protéines dans les plantes vivantes. Les peptides porteurs conçus sont constitués de polycations conjugués à pénétrant cellulaire ou des séquences de transit organites. Polycations permettent la liaison et / ou de la condensation des cargaisons chargées négativement, ainsi que l&#39;évasion du compartiment endosomal suivante intériorisation dans les cellules. Livraison des cargaisons dans des cellules et par la suite à des organites spécifiques est médiée par des séquences de pénétration des cellules et des séquences de transit organites, respectivement. Diverses cargaisons qui pourraient être successfully livrés à l&#39;usine comprennent des acides nucléiques tels que l&#39;ADNp, et ADNdb ARNdb, ainsi que des protéines modèles, comme l&#39;albumine de sérum bovin (BSA), l&#39;alcool déshydrogénase (ADH) et citrin (une variante de la protéine fluorescente jaune). Molécules bioactives sont capables de former des complexes de transfection avec des conjugués peptide par l&#39; intermédiaire d&#39; interactions électrostatiques, qui sont introduits dans les feuilles des plantes par une seringue infiltration. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54972/54972fig1large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/54972/54972fig2.jpg" /> Figure 2: Morphologies des formulations à base de peptides. (A) AFM amplitude image (KH) 9 -BP100 formulation / ADNp à N / P 0,5. (B) de l&#39; image de la hauteur de l&#39; AFM de (BP100) 2 K 8 / formulation ADH à rati molaireo 10. Reproduit avec la permission de sources 23,24 publiées. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54972/54972fig2large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/54972/54972fig3.jpg" /> Figure 3: Microscopique Évaluation de Transfection efficacités utilisant Formulations à base de peptides optimisés. (A) l&#39; expression cytosolique de la GFP (vert), distingue nettement de l&#39; autofluorescence des chloroplastes (rouge), a été observée dans les cellules du mésophylle spongieuses de A. thaliana feuilles infiltrées avec (KH) 9 formulation -BP100 / ADNp (N / P 0,5; 12 h ). (B) expression de la GFP (vert) a été détectée dans les mitochondries (rouge) dans les cellules de l&#39; épiderme de la feuille A. thaliana infiltrée par Cytcox- (KH) 9 / BP100 / formulation ADNp (N / P 0,5 pour chaque peptide; 12 h). images agrandies des mitochondries avec l&#39;expression de la GFP sont présentés dans le panneau extrême droite. (C) La livraison de ADH-RhB (bleu) dans les cellules du mésophylle spongieux de A. thaliana feuilles médiée par (BP100) 2 K 8 à un rapport molaire peptide / protéine de 10, visualisé 6 heures après l&#39;infiltration. (D) feuille A. thaliana avant (a) et après (b) le traitement avec (KH) 9 -BP100 / formulation ARNdb (rapport molaire 2; 48 h), ce qui a entraîné la suppression de la voie de biosynthèse des anthocyanes. Une formulation similaire contenant GFP5 ARNdb a été infiltré dans la feuille comme contrôle négatif (c). Les flèches 1 et 3 indiquent la zone infiltrée tandis que les flèches 2 et 4 indiquent la zone non infiltrée à l&#39;intérieur de la feuille. (E) A. thaliana laisse exprimer la protéine fluorescente jaune (YFP) et (F) la fluorescence YFP diminuée suivant l&#39; infiltration avec<html> (KH) 9 -BP100 / formulation ARNdb (rapport molaire 2; 9 h). (G) des feuilles de peuplier transgéniques exprimant la protéine fluorescente jaune (YFP) et (H) la YFP fluorescence d&#39;infiltration suivante diminuée avec (KH) 9 formulation -BP100 / ARNdb (rapport molaire 2; 12 h). Reproduit avec la permission de sources 21,23,24,26 publiées. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54972/54972fig3large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/54972/54972fig4.jpg" /> Figure 4: Variation de Peptide-à-ADN (N / P) Ratio et l&#39;effet sur les propriétés biophysiques des Complexes. Avec l&#39;augmentation de peptide ratio d&#39;ADN, des formulations à base de peptides diminuent en taille alors que leur potentiel zêta des valeurs de transition du négatif au positif./files/ftp_upload/54972/54972fig4large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. <img alt="Tableau 1" src="/files/ftp_upload/54972/54972table1.jpg" /> Tableau 1: Caractérisation et évaluation des différentes formulations à base de peptides. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54972/54972table1large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette table.</a> <img alt="Tableau 2" src="/files/ftp_upload/54972/54972table2.jpg" /> Tableau 2: Comparaison des technologies existantes ADN de livraison Peptide-base et d&#39; autres pour les plantes intactes. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54972/54972table2large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette table.</a>

Les méthodes existantes pour la modification des plantes ont une applicabilité limitée. La nouvelle technologie dérivée des peptides proposée ici promet à la fois simplicité et efficacité dans l’introduction de protéines ou de gènes exogènes dans les compartiments intracellulaires souhaités de plantes intactes.

Peptide dérivé Méthode du transport des gènes et des protéines Across cellulaire et obstacles organites dans les plantes

The capacity to introduce exogenous proteins and express (or down-regulate) specific genes in plants provides a powerful tool for fundamental research as ...

Le but général de cette méthode dérivée de peptides est de transporter des gènes et des protéines à travers les barrières cellulaires et organellaires chez les plantes. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés en modifiant les plantes à l’aide de conjugués peptidiques conçus de manière rationnelle, qui délivrent divers gènes et protéines afin de réguler l’expression de gènes spécifiques. L’avantage immédiat de cette technique réside dans l’utilisation d’une procédure de transfection simple assistée par seringue sur des feuilles de plantes, basée sur des peptides capables de franchir les limites cellulaires et organellaires.Nous avons mis au point cette méthode de transformation végétale simple, efficace et nouvelle car les méthodes conventionnelles sont coûteuses, inapplicables à certains types de plantes et incapables de cibler les organites intracellulaires. Jo-Ann Church démontrera la procédure avec Yoko Horii, une technicienne de mon laboratoire. Préparez la formulation ADN-plasma peptidique comme décrit dans le protocole écrit.Lorsque le peptide est ajouté à l'ADN plasmatique, une solution trouble se forme. Le mélange devient clair après dilution avec de l'eau ultrapure jusqu'au volume final indiqué dans le protocole du texte. Transférez 800 microlitres de la solution diluée dans une cuvette pour l'analyse de diffusion dynamique de la lumière.Déterminez le diamètre hydrodynamique et l'indice de polydispersité des complexes formés à l'aide d'un zétananosizer. Utilisez un laser hélium-néon de 633 nanomètres à 25 degrés Celsius avec un angle de détection en rétrodiffusion de 173 degrés. Après les mesures de taille, transférez la solution dans une cellule capillaire pliée pour les mesures de potentiel zêta aux paramètres par défaut de la constante diélectrique, de l'indice de réfraction et de la viscosité de l'eau à 25 degrés Celsius.Pour observer la solution complexe par microscopie à force atomique, déposez 10 microlitres sur la surface fraîchement exposée et clivée d'une feuille de mica et laissez sécher à l'air libre toute la nuit dans une boîte de Petri en plastique couverte. Acquérez une image des complexes en air à 25 degrés Celsius à l'aide d'un levier en silicium ayant une constante de ressort de 1,3 newton par mètre, en mode oscillation. Utilisez des Arabidopsis thaliana âgés de trois semaines, cultivés selon un cycle de 16 heures de lumière et 8 heures d'obscurité, à 22 degrés Celsius.Choisissez au moins trois feuilles pour la transfection afin d'obtenir des essais en triple pour la quantification de l'expression génique. Chargez une seringue en plastique d'un millilitre sans aiguille avec 100 microlitres de solution complexe pour la transfection d'une feuille. Ensuite, positionnez l'extrémité de la seringue sur la surface abaxiale de la feuille.Appuyez légèrement la pointe de la seringue contre la feuille et enfoncez lentement le piston de la seringue tout en exerçant une pression contrariée avec l'index d'une main gantée en latex placée du côté opposé. Une infiltration réussie peut être observée par l'extension d'une zone imbibée d'eau sur la feuille. Étiquetez les feuilles infiltrées afin de faciliter leur identification.Incuber la plante transfectée par l'ADN plasmatique du peptide pendant 12 heures dans une chambre de croissance. Pour évaluer l'efficacité de la transfection, exciser d'abord toute la feuille transfectée. Pour les expériences de transfection utilisant le vecteur rapporteur de la luciférase de Renilla, déterminer quantitativement l'efficacité de transfection à l'aide d'un kit d'essai de la luciférase de Renilla.Placez d'abord chaque feuille excisée dans un tube microcentrifuge de 1,5 millilitre. Ajoutez 100 microlitres de tampon de lyse 1X par tube. De la même manière, préparez les lysats de feuilles témoins non transfectées en triple exemplaire.Broyer la feuille à l’aide d’un pilon d’homogénéisation et incuber le lysat obtenu à 25 degrés Celsius pendant six à dix heures. Après l’incubation, centrifuger le lysat à 12 470 ×g dans une microcentrifugeuse pendant une minute. Transférer 20 microlitres du lysat clarifié dans un puits d’une microplaque de 96 puits.Utilisez le volume restant pour la quantification de la concentration totale de protéines à l’aide d’un kit de dosage des protéines BCA, conformément au protocole du fabricant. Ensuite, ajoutez 100 microlitres de substrat de dosage de la luciférase Renilla à une concentration d’une fois dans le puits et mélangez par pipetage lent. Placez la microplaque dans un lecteur de microplaque multimode et lancez la mesure.Pour les expériences de transfection utilisant un vecteur rapporteur de protéine fluorescente verte, observez la fluorescence à l’aide d’un microscope confocal à balayage laser. Commencez par découper les bords d’une feuille entière afin de faciliter l’élimination des espaces aériens. Ensuite, retirez le piston d’une seringue de 10 millilitres et placez chaque feuille ou section de feuille excisée dans la seringue.Remettez le piston en place et poussez-le doucement jusqu'au fond de la seringue sans écraser la feuille. Aspirez de l'eau dans la seringue jusqu'à ce qu'elle soit environ à moitié pleine. Orientez la seringue vers le haut et appuyez sur le piston pour chasser l'air de la seringue par l'extrémité.Ensuite, couvrez l'extrémité de la seringue et tirez lentement le piston vers le bas pour expulser l'air de la feuille. Répétez ce processus plusieurs fois jusqu'à ce que la feuille devienne translucide. Ensuite, recouvrez la surface d'une lame de microscope avec du ruban adhésif.Découpez une zone carrée sur le ruban suffisamment grande pour accueillir l'échantillon de feuille à l'aide d'une lame, puis retirez délicatement le morceau carré de ruban avec une pince pour créer une chambre d'échantillon. Le ruban servira d'espacement entre la lame et la lamelle. Placez la feuille dans la chambre avec la surface abaxiale tournée vers le haut et remplissez l'espace restant dans la chambre avec de l'eau.Scellez la feuille à l'intérieur de la chambre avec une lame de verre et fixez les bords de la lame avec du ruban adhésif. Examinez l'échantillon de feuille à l'aide d'un microscope confocal à balayage laser avec un objectif 40x ou un objectif à immersion dans l'eau 63x. La fluorescence de la GFP peut être visualisée à une longueur d'onde d'excitation de 488 nanomètres.Une préparation optimale de la formulation d'ADN plasmatique avec le peptide à un rapport peptide/ADN de 0,5 devrait présenter un diamètre moyen d'environ 290 nanomètres et un faible indice de polydispersité d'environ 0,3, ce qui indique une distribution homogène des tailles. De plus, les complexes doivent présenter un potentiel zêta d'environ 30 millivolts. Une image représentative obtenue par microscopie à force atomique des complexes de peptide, plasma et ADN est présentée ici.Des complexes globulaires homogènes ont été observés. En utilisant la formulation d'ADN plasmidique avec le peptide, une délivrance ciblée vers le noyau et une expression de l'ADN plasmidique peuvent être obtenues chez Arabidopsis thaliana avec une valeur estimée de luciférase Renilla par milligramme d'environ 100 000. Une observation microscopique a été réalisée sur des feuilles traitées avec des complexes préparés à l'aide d'ADN plasmidique codant pour le rapporteur GFP afin d'évaluer l'expression génique.Les images ont révélé que dans les cellules transfectées avec des complexes ADN plasmidique et peptide non ciblés, une fluorescence verte diffuse correspondant à l'expression de la GFP était clairement observée et localisée dans le cytosol. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs du domaine de la biotechnologie végétale pour délivrer diverses cargaisons à base de protéines et d'acides nucléiques dans des plantes vivantes. Après avoir visionné cette vidéo et lu le protocole écrit, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de préparer, de caractériser et d'appliquer diverses formulations optimisées pour chaque type de cargaison, incluant l'ADN plasmidique, l'ADN ou l'ARN double brin, et les protéines.

peptide-derived-method-to-transport-genes-proteins-across-cellular

Research

Recherche

JoVE Journal

Genetics

Génétique

Le trafic entre les cellules végétales macromoléculaire peut être évaluée par transitoirement exprimant une protéine fluorescente-marqués d'intérêt et d'analyser sa distribution intra-et intercellulaires par microscopie confocale.

Une cellule à cellule essai de transport macromoléculaire In planta Utilisant bombardement biolistique

Les plantes offrent un nouveau système pour la production de protéines pharmaceutiques à l'échelle commerciale qui est plus évolutive, rentable et sûre de paradigmes d'expression actuels. Dans cette étude, nous présentons une approche simple et pratique, mais évolutive pour introduire du gène cible...

Agroinfiltration efficace des plantes pour l&#39;expression transitoire de haut niveau de protéines recombinantes

Ce travail décrit un nouveau procédé pour cibler sélectivement des organelles sous-cellulaires dans les plantes, dosés par la BioRad Gene Gun.

Transient expression des gènes dans le tabac en utilisant Assemblée Gibson et le Gene Gun

Domaines à doigt de zinc sont intrinsèquement perméable cellule et capable de médier la délivrance de protéines dans une large gamme de types de cellules de mammifères. Ici, un protocole étape par étape détaillé pour la mise en œuvre de la technologie à doigt de zinc pour la livraison de protéine intracellulaire est présenté.

Protein livraison directe aux cellules de mammifères en utilisant la cellule perméable Cys<sub&gt; 2</sub&gt; -His<sub&gt; 2</sub&gt; Domaines doigt de zinc

Usine de connexions intercellulaires, les plasmodesmes (DP), jouent un rôle central dans l’usine des interactions plante-virus et physiologie. Critique de transport Pd sont tri signaux qui dirigent les protéines à Pd. Cependant, nos connaissances sur ces séquences est encore à ses balbutiements. Nous décrivons une stratégie visant à identifier les signaux de localisation de Pd dans les protéines ciblées Pd.

Identification de séquences de localisation Plasmodesmal en protéines In Planta

Nous avons développé un protocole simple et efficace pour la préparation de grandes quantités de protoplastes de soja afin d’étudier les mécanismes réglementaires et signalisation complexes dans des cellules vivantes.

Une méthode Simple pour l’isolement de protoplastes de soja et Application aux Analyses d’Expression génétique transitoire

Nous avons développé une nouvelle méthode pour exprimer conjointement plusieurs protéines chimériques fluorescentes fusion chez les plantes à surmonter les difficultés des méthodes conventionnelles. Il prend avantage d’utiliser un plasmide d’expression unique qui contient plusieurs protéines fonctionnellement indépendant exprimant des cassettes pour atteindre la co-expression de protéine.

La co-expression de multiples protéines chimériques fluorescentes Fusion de façon efficace dans les plantes

Nous décrivons une méthode pour la caractérisation des transporteurs de membrane proton-conduits dans les préparations de vésicule de membrane produites par l'expression hétérologue dans E. coli et lysis des cellules utilisant une presse Français.

Caractérisation des transporteurs de membrane par l'expression hétérologue dans E. coli et la production de vésicules membranaires

Ce manuscrit décrit un nouveau dispositif d’infusion directe de plantes pour cribler l’efficacité de molécules contre la bactérie (Candidatus Liberibacter asiaticus) ou son insecte vecteur (Diaphorina citri, Kuwayama) qui, en combinaison, sont associées à la maladie des agrumes de Huanglongbing.

DISPOSITIF DE PERFUSION DIRECTE POUR ADMINISTRATION DE MOLÉCULES DANS LES PLANTES

Ce protocole décrit la sélection de marqueurs plasmodesmaux optimaux pour les analyses basées sur la microscopie confocale du ciblage des protéines sur les plasmodesmes lors d’interactions virus-plasmodesmes ou de transport plasmodesmal.

Analyse par microscopie confocale du tri des protéines vers les plasmodesmes chez Nicotiana benthamiana

Découvrez une méthode peptidique innovante pour transporter gènes et protéines à travers les barrières cellulaires et organellaires chez Arabidopsis thaliana. Cette technique simplifie la transformation végétale avec une transfection assistée par seringue.

Peptide dérivé Méthode du transport des gènes et des protéines Across cellulaire et obstacles organites dans les plantes

Explorer plus de vidéos