Peptide dérivé Méthode du transport des gènes et des protéines Across cellulaire et obstacles organites dans les plantes

Le but général de cette méthode dérivée de peptides est de transporter des gènes et des protéines à travers les barrières cellulaires et organellaires chez les plantes. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés en modifiant les plantes à l’aide de conjugués peptidiques conçus de manière rationnelle, qui délivrent divers gènes et protéines afin de réguler l’expression de gènes spécifiques. L’avantage immédiat de cette technique réside dans l’utilisation d’une procédure de transfection simple assistée par seringue sur des feuilles de plantes, basée sur des peptides capables de franchir les limites cellulaires et organellaires.

Nous avons mis au point cette méthode de transformation végétale simple, efficace et nouvelle car les méthodes conventionnelles sont coûteuses, inapplicables à certains types de plantes et incapables de cibler les organites intracellulaires. Jo-Ann Church démontrera la procédure avec Yoko Horii, une technicienne de mon laboratoire. Préparez la formulation ADN-plasma peptidique comme décrit dans le protocole écrit.

Lorsque le peptide est ajouté à l'ADN plasmatique, une solution trouble se forme. Le mélange devient clair après dilution avec de l'eau ultrapure jusqu'au volume final indiqué dans le protocole du texte. Transférez 800 microlitres de la solution diluée dans une cuvette pour l'analyse de diffusion dynamique de la lumière.

Déterminez le diamètre hydrodynamique et l'indice de polydispersité des complexes formés à l'aide d'un zétananosizer. Utilisez un laser hélium-néon de 633 nanomètres à 25 degrés Celsius avec un angle de détection en rétrodiffusion de 173 degrés. Après les mesures de taille, transférez la solution dans une cellule capillaire pliée pour les mesures de potentiel zêta aux paramètres par défaut de la constante diélectrique, de l'indice de réfraction et de la viscosité de l'eau à 25 degrés Celsius.

Pour observer la solution complexe par microscopie à force atomique, déposez 10 microlitres sur la surface fraîchement exposée et clivée d'une feuille de mica et laissez sécher à l'air libre toute la nuit dans une boîte de Petri en plastique couverte. Acquérez une image des complexes en air à 25 degrés Celsius à l'aide d'un levier en silicium ayant une constante de ressort de 1,3 newton par mètre, en mode oscillation. Utilisez des Arabidopsis thaliana âgés de trois semaines, cultivés selon un cycle de 16 heures de lumière et 8 heures d'obscurité, à 22 degrés Celsius.

Choisissez au moins trois feuilles pour la transfection afin d'obtenir des essais en triple pour la quantification de l'expression génique. Chargez une seringue en plastique d'un millilitre sans aiguille avec 100 microlitres de solution complexe pour la transfection d'une feuille. Ensuite, positionnez l'extrémité de la seringue sur la surface abaxiale de la feuille.

Appuyez légèrement la pointe de la seringue contre la feuille et enfoncez lentement le piston de la seringue tout en exerçant une pression contrariée avec l'index d'une main gantée en latex placée du côté opposé. Une infiltration réussie peut être observée par l'extension d'une zone imbibée d'eau sur la feuille. Étiquetez les feuilles infiltrées afin de faciliter leur identification.

Incuber la plante transfectée par l'ADN plasmatique du peptide pendant 12 heures dans une chambre de croissance. Pour évaluer l'efficacité de la transfection, exciser d'abord toute la feuille transfectée. Pour les expériences de transfection utilisant le vecteur rapporteur de la luciférase de Renilla, déterminer quantitativement l'efficacité de transfection à l'aide d'un kit d'essai de la luciférase de Renilla.

Placez d'abord chaque feuille excisée dans un tube microcentrifuge de 1,5 millilitre. Ajoutez 100 microlitres de tampon de lyse 1X par tube. De la même manière, préparez les lysats de feuilles témoins non transfectées en triple exemplaire.

Broyer la feuille à l’aide d’un pilon d’homogénéisation et incuber le lysat obtenu à 25 degrés Celsius pendant six à dix heures. Après l’incubation, centrifuger le lysat à 12 470 ×g dans une microcentrifugeuse pendant une minute. Transférer 20 microlitres du lysat clarifié dans un puits d’une microplaque de 96 puits.

Utilisez le volume restant pour la quantification de la concentration totale de protéines à l’aide d’un kit de dosage des protéines BCA, conformément au protocole du fabricant. Ensuite, ajoutez 100 microlitres de substrat de dosage de la luciférase Renilla à une concentration d’une fois dans le puits et mélangez par pipetage lent. Placez la microplaque dans un lecteur de microplaque multimode et lancez la mesure.

Pour les expériences de transfection utilisant un vecteur rapporteur de protéine fluorescente verte, observez la fluorescence à l’aide d’un microscope confocal à balayage laser. Commencez par découper les bords d’une feuille entière afin de faciliter l’élimination des espaces aériens. Ensuite, retirez le piston d’une seringue de 10 millilitres et placez chaque feuille ou section de feuille excisée dans la seringue.

Remettez le piston en place et poussez-le doucement jusqu'au fond de la seringue sans écraser la feuille. Aspirez de l'eau dans la seringue jusqu'à ce qu'elle soit environ à moitié pleine. Orientez la seringue vers le haut et appuyez sur le piston pour chasser l'air de la seringue par l'extrémité.

Ensuite, couvrez l'extrémité de la seringue et tirez lentement le piston vers le bas pour expulser l'air de la feuille. Répétez ce processus plusieurs fois jusqu'à ce que la feuille devienne translucide. Ensuite, recouvrez la surface d'une lame de microscope avec du ruban adhésif.

Découpez une zone carrée sur le ruban suffisamment grande pour accueillir l'échantillon de feuille à l'aide d'une lame, puis retirez délicatement le morceau carré de ruban avec une pince pour créer une chambre d'échantillon. Le ruban servira d'espacement entre la lame et la lamelle. Placez la feuille dans la chambre avec la surface abaxiale tournée vers le haut et remplissez l'espace restant dans la chambre avec de l'eau.

Scellez la feuille à l'intérieur de la chambre avec une lame de verre et fixez les bords de la lame avec du ruban adhésif. Examinez l'échantillon de feuille à l'aide d'un microscope confocal à balayage laser avec un objectif 40x ou un objectif à immersion dans l'eau 63x. La fluorescence de la GFP peut être visualisée à une longueur d'onde d'excitation de 488 nanomètres.

Une préparation optimale de la formulation d'ADN plasmatique avec le peptide à un rapport peptide/ADN de 0,5 devrait présenter un diamètre moyen d'environ 290 nanomètres et un faible indice de polydispersité d'environ 0,3, ce qui indique une distribution homogène des tailles. De plus, les complexes doivent présenter un potentiel zêta d'environ 30 millivolts. Une image représentative obtenue par microscopie à force atomique des complexes de peptide, plasma et ADN est présentée ici.

Des complexes globulaires homogènes ont été observés. En utilisant la formulation d'ADN plasmidique avec le peptide, une délivrance ciblée vers le noyau et une expression de l'ADN plasmidique peuvent être obtenues chez Arabidopsis thaliana avec une valeur estimée de luciférase Renilla par milligramme d'environ 100 000. Une observation microscopique a été réalisée sur des feuilles traitées avec des complexes préparés à l'aide d'ADN plasmidique codant pour le rapporteur GFP afin d'évaluer l'expression génique.

Les images ont révélé que dans les cellules transfectées avec des complexes ADN plasmidique et peptide non ciblés, une fluorescence verte diffuse correspondant à l'expression de la GFP était clairement observée et localisée dans le cytosol. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs du domaine de la biotechnologie végétale pour délivrer diverses cargaisons à base de protéines et d'acides nucléiques dans des plantes vivantes. Après avoir visionné cette vidéo et lu le protocole écrit, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de préparer, de caractériser et d'appliquer diverses formulations optimisées pour chaque type de cargaison, incluant l'ADN plasmidique, l'ADN ou l'ARN double brin, et les protéines.