Name: Culture de murines embryonnaires Métatarsiens: un modèle physiologique de endochondrale ossification (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 23 s
Description: Découvrez la culture de métatarses embryonnaires murins pour étudier l'ossification endochondrale ex vivo. Ce modèle physiologique permet d'analyser la croissance osseuse et la minéralisation squelettique.

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Nous sommes reconnaissants envers le Conseil de recherches en biotechnologie et en sciences biologiques (BBSRC) pour le financement de DH (BB/J01446X/1), CF & VEM (Institute Strategic Programme Grant Funding BB/J004316/1). Nous remercions également Arthritis Research UK pour le financement de KAS (20413). Nous remercions Mlle Elaine Seawright pour son aide dans les expériences détaillées, le Dr Neil Mackenzie pour son aide avec les techniques lentivirales, et M. Darren Smith et M. Alex Robertson (Roslin Institute BRF) pour leur aide dans les études animales.

Les procédures impliquant des sujets animaux ont été menées dans le respect des animaux au Royaume-Uni (Scientific Procedures) Act 1986 et les animaux ont été maintenus en conformité avec le Home Office publié Code d&#39;usages pour le logement et les soins des animaux de race, fourni ou utilisé à des fins scientifiques. NOTE: Les expériences réalisées à l&#39;aide de type sauvage C57BL / 6J sont bien établis et décrits ci-dessous. Métatarsiens embryonnaires à partir de différentes souches de souris peuvent de même être cultivées in vitro, bien que leurs taux de croissance et la minéralisation peuvent différer de celles décrites ici. 1. Conditions Dissection et préparation des instruments <ol><li> Effectuer toute la préparation des médias, des tissus dissections et le travail de la culture dans une hotte à flux laminaire pour assurer la stérilité des médias et des ébauches embryonnaires. </li><li> Permettre la culture et dissection médias à équilibrer pendant au moins 1 h dans un 37 ° C, 5% de CO 2 incubateur avant utilisation. </li><li> Stériliser dissectionciseaux, Dumont # 5 et Dumont # 4 pinces à côté d&#39;une paire de SuperFine Vannas micro ciseaux (8 cm droites, lames 3 mm) par autoclavage. Après autoclavage, immerger le matériel de dissection dans 70% d&#39;éthanol avant utilisation. </li></ol> 2. Préparation de Dissection et de la culture des médias <ol><li> Préparer le milieu de dissection <ol><li> Diluer Essential Media α-minimum (sans nucléosides, aMEM) dans un tampon phosphate salin (PBS) (01h13) et resuspendre sérum albumine bovine (BSA) à 2 mg / m l avant filtre de stérilisation à travers une seringue de 0,22 um, 33 mm de diamètre filtre. NOTE: milieu Dissection peut être faite, stérilisé par filtration et stocké à -20 ° C indéfiniment. </li></ol></li><li> Préparer le milieu de culture <ol><li> Culture métatarsiens embryonnaires dans 300 ul de milieu de culture (dans chaque puits d&#39;une plaque de culture à 24 puits). Préparer le milieu de culture en y ajoutant 0,2% p / v de BSA; 5 ug / ml de L-ASCOphosphate acide RBIC; 1 mM β-glycérophosphate (βGP, en option - voir la section Résultats); 0,05 mg / ml de gentamicine et 1,25 pg d&#39;amphotéricine B à aMEM et stériliser par filtration à travers un filtre de diamètre de seringue de 0,22 um, 33 mm. </li></ol></li></ol> 3. murin Embryonic métatarsien Dissection et Culture <ol><li> Cull la souris enceinte, abritant 15 jours d&#39;âge des embryons, par dislocation cervicale, conformément aux directives de bureau à domicile au Royaume-Uni </li><li> Placez la supination animale et désinfecter la peau par pulvérisation avec 70% d&#39;éthanol. Utilisation des ciseaux de dissection font une grande incision sur la ligne médiane, pénétrant la peau et du péritoine pour exposer la cavité abdominale. </li><li> Localiser les deux cornes utérines de l&#39;animal dans la région dorsale de la cavité corporelle. Retirez les cornes utérines en libérant tout d&#39;abord chaque utérine du mésomètre par des incisions soignées avec des ciseaux de dissection et puis finalement couper les cornes utérines libre à leur base. Place utérines cornes en milieu de dissection. </li><li> Séparer chaque embryon en coupant entre les sites d&#39;implantation le long de la corne utérine et retirer les embryons de leurs sacs individuels en utilisant une pince. embryons Cull par décapitation, conformément aux directives de bureau à domicile au Royaume-Uni </li><li> Après désinfection de la peau par pulvérisation avec 70% d&#39;éthanol, utilisez Vannas micro ciseaux pour enlever les membres postérieurs des embryons par incision autour du fémur proximal. Ceci garantit que la majeure partie de la patte postérieure possible est supprimé. Placez les membres postérieurs dans une boîte de Pétri immergée dans un milieu de dissection avant métatarsien dissection. </li><li> Sous un microscope de dissection, commencer à enlever la peau entourant le pied embryonnaire, en pinçant et en tirant dessus en utilisant le # 5 pinces tout en tenant le membre postérieur stable en utilisant le # 4 pincettes. Ceci est le plus efficacement réalisé en saisissant la peau autour du niveau du tibia et en tirant vers les phalanges. L&#39;utilisation des ciseaux à ce stade, pour réduire lepeau très fine est pas nécessaire. </li><li> Tenez soigneusement les tarses du pied embryonnaire avec # 4 pinces et retirez les premier et cinquième métatarsiens par pincement à proximité des tarses en utilisant # 5 pinces et le jeter. </li><li> Avec le pied tenu dans la même position, utilisez la # 5 pinces pour perturber les tissus conjonctifs entre les trois phalanges restantes et métatarses. Insérez la pointe de # 5 pinces à l&#39;articulation entre les phalanges et des métatarses pour enlever les phalanges des métatarses. </li><li> Enfin, utilisez # 5 pinces pour perturber les tissus conjonctifs entre les tarses et métatarses. Encore une fois placer la pointe de # 5 pinces dans l&#39;espace commun entre les tarses et métatarses et doucement libres métatarsiens des tarses. </li><li> ramasser délicatement les métatarses maintenant libres avec # 4 pinces et lieu en milieu de dissection frais. NOTE: dissection minutieuse devrait fournir 6 métatarsiens de chaque embryon. </li><li> Lorsque tous les métatarses nécessaires ont été disséqués, savoully lieu métatarsiens individuellement dans les plaques à 24 puits pré-chauffé contenant 300 pi de milieu de culture. Métatarsiens de culture à 37 ° C dans un incubateur à CO2 à 5% pendant 14 jours. NOTE: Ne modifiez pas les médias de cultures E15 jusqu&#39;à au moins 5 jours de culture , car cela affecte leur capacité de minéralisation 26. Les raisons de ce ne sont pas claires, mais la croissance linéaire et minéralisation de la matrice peuvent dépendre de la stimulation par des facteurs de croissance libérés par les métatarses. </li></ol> 4. Analyse et manipulation des cultures métatarsien <ol><li> Le jour de la dissection (jour 0) effectuer des mesures initiales longitudinales à l&#39;aide d&#39;un microscope avec un logiciel de la caméra ci-joint et l&#39;analyse d&#39;image numérique. Mesurer la longueur de la zone de minéralisation centrale quand elle apparaît après quelques jours de culture. </li><li> Périodiquement, le cas échéant, effectuer d&#39; autres mesures (habituellement chaque jour 2 e) jusqu&#39;à ce que le dernier jour de la culture à quel point mos etatarsal sont traités dépend des résultats requis (discutés dans l&#39;introduction). </li><li> Moyen de supplément de cultures d&#39;organes métatarsien avec divers facteurs exogènes , par exemple des facteurs de croissance, des hormones et des agents pharmacologiques de jour 0 de la culture 22,24. Dans toutes les études de ce genre, le contrôle métatarsiens non traitées sont nécessaires. NOTE: Bien qu&#39;il soit souhaitable que les os de contrôle sont le rudiment équivalent de la jambe controlatérale, il n&#39;y a pas eu de différences dans la croissance linéaire ou potentiel de minéralisation de culture E15 2 e, 3 e et 4 e métatarsiens (voir ci - dessous, la figure 2) . </li></ol>

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

La culture de métatarsiens embryonnaires murines fournit un modèle très physiologique de la croissance endochondral et de la minéralisation. Les premières études ont validé que métatarsiens de souris E15 subissent un modèle normal de la croissance du squelette et la différenciation. Le cartilage (chondrocytes) et de l&#39; os (ostéoblastes et ostéoclastes) cellules et leurs matrices collagènes respectives sont indiscernables de ceux observés in vivo. Cependant, il existe certaines limitations reconnues de ce modèle. La vitesse de la différenciation des ostéoclastes est altérée en est la croissance osseuse (mais pas cartilage différenciation). La croissance osseuse est d&#39; environ 50% plus lente que celle observée in vivo et peut être due à des carences en facteurs systémiques qui influent sur la production de facteurs locaux (par exemple, l&#39; IGF-1, PGB, etc.) 31. En outre, il est bien reconnu que l&#39;os est sensible à son environnement mécanique et cela est également le cas pour les métatarses de culture, qui répondent à changements en mécanique de chargement 32,33. Par conséquent, dans des situations non chargées, comme décrit dans ce protocole, la minéralisation et la résorption minérale peut être compromise. Néanmoins, le modèle du métatarse offre la possibilité de mesurer directement la croissance osseuse linéaire , ce qui est impossible par l&#39; intermédiaire 2D et 3D dans les systèmes de culture in vitro. Nous avons fourni une description complète du protocole impliqué dans la dissection et la culture de E15 métatarsiens murins et , en fait, pour la première fois, confirmer la validité de la mise en commun des 2 e, 3 e et 4 e métatarsiens pour des expériences. Métatarsiens de E17 / E18 sont couramment utilisés pour étudier les mécanismes de la croissance osseuse en raison de leur extraordinaire potentiel de croître ex vivo pendant de longues périodes de temps (c. -à- delà de 14 jours dans la culture). Ils sont un modèle bien établi pour enquêter sur le rôle des facteurs de croissance sur la croissance embryonnaire osseuse longitudinale.En outre, la dissection et la culture des métatarsiens postnatals est couramment utilisés pour délimiter les mécanismes entourant la croissance osseuse postnatale comme il est entendu que la croissance osseuse post - natale et la croissance osseuse du fœtus sont réglementés différemment 21. La croissance osseuse observée dans métatarsiens postnatals culture est cependant nettement inférieure à celle observée dans les ébauches embryonnaires 25,34, ce qui limite leur potentiel dans des études à long terme et de mettre en évidence l&#39;influence plus systémique sur la croissance osseuse à ce stade postnatal. En effet, 3 jours anciens métatarsiens postnatals de souris sont généralement la dernière étape qui peut être utilisé pour obtenir 34 croissance mesurable. Nous décrivons ici notre protocole pour l&#39;isolement des os métatarsiens embryonnaires à E15. L&#39;absence d&#39;hydroxyapatite minérale dans E15 métatarsiens signifie qu&#39;ils fournissent un modèle sans égal pour étudier non seulement les mécanismes entourant la croissance osseuse longitudinal, mais aussi l&#39;ouverturede la minéralisation du squelette. La matrice minéralisée de la zone de chondrocytes hypertrophiques terminal fournit un échafaudage pour envahir ostéoblastes d&#39;établir une matrice osseuse spécifique (ostéoïde) qui est ensuite minéralisée, et en tant que telle , cette minéralisation initiale est vital pour la formation osseuse réussie et fonctionnelle 35. En effet , un certain nombre de rapports récents utilisant métatarsiens E15 ont confirmé leur capacité unique pour l&#39;enquête sur le 28,36,37 de processus de minéralisation. En outre, les chercheurs ont décrit l&#39;utilisation de métatarsiens E15 comme un modèle de l&#39; angiogenèse 38, mettant en évidence le potentiel des métatarsiens embryonnaires comme modèle en dehors du cadre croissance osseuse / minéralisation. Le protocole que nous décrivons ne nécessite qu&#39;un équipement de laboratoire standard , y compris une hotte à flux laminaire, un microscope à dissection pour effectuer la dissection, et un incubateur à CO2 pour la culture de rudiment excisées. En outre, un cul très basiqueture contenant du milieu aMEM, la BSA, des antibiotiques, des antimycotiques et de l&#39; acide L-ascorbique (un co-facteur dans la synthèse de l&#39; hydroxyproline et de l&#39; hydroxylysine, deux acides aminés essentiels pour la production de collagène 39) permet d&#39; éviter l&#39;utilisation d&#39;additifs non définis, tels que des sérums animaux . Traditionnellement, les chercheurs ont ajouté βGP aux médias utilisés pour la culture métatarsiens embryonnaires, mais comme l&#39;a révélé dans nos résultats, l&#39;utilisation d&#39;une source de phosphate supplémentaire ne sont pas requis pour la minéralisation du succès dans ce système de culture. Cette constatation est importante dans notre quête de la compréhension des mécanismes qui sous-tendent ECM minéralisation. Métatarsiens ont déjà été infectées par des adénovirus contenant des formes dominantes négatives de Smad2 pour explorer le rôle de facteur de croissance transformant β dans la régulation du développement des os longs 40. Ici, nous révélons également la transfection réussie de type sauvage os E15 métatarsiens avec des particules de virus de la GFP, ce qui indique ttechniques chapeau lentiviraux pourraient facilement être adoptées pour manipuler l&#39;expression des gènes dans les cultures du métatarse. De même, le système de culture d&#39;organe métatarsienne est un excellent modèle pour comparer la croissance des os chez des souris génétiquement modifiées pour mieux comprendre le rôle d&#39;un gène particulier dans le processus de croissance osseuse. Nos études antérieures ont utilisé le système de culture d&#39;organes métatarsien pour déterminer le rôle de suppresseur de cytokine de signalisation-2 (SOCS2) dans la croissance des os endochondral. Utilisation des os métatarsiens de souris déficientes en SOCS2, nous avons montré que l&#39; hormone de croissance est capable de simuler leur croissance longitudinale indépendante de l&#39; insuline comme facteur de croissance (IGF-1), à la différence des os métatarsiens de type sauvage qui ne répondent pas à la croissance un traitement hormonal 34, 41. Cela met en évidence la mesure dans laquelle les cultures du métatarse peuvent être manipulées pour examiner les effets des différents gènes et / ou de facteurs exogènes sur la croissance osseuse endochondrale. En résumé, nous avons detaiconduit un procédé pour l&#39;extraction réussie et la culture des métatarsiens embryonnaires qui peuvent être manipulées et examinées en utilisant une variété d&#39;analyses. Ce modèle ex vivo maintient cellule-cellule et les interactions cellule-matrice, ainsi que contient des chondrocytes dans les différentes phases de la chondrogenèse, fournissant ainsi un modèle plus physiologique que les cellules de la monocouche ou de la culture 3D. cultures d&#39;organes métatarsien sont donc un modèle unique pour étudier les mécanismes moléculaires responsables de l&#39;ossification endochondrale, et sont essentielles pour mieux comprendre à la fois la physiologie osseuse et la physiopathologie

Le squelette est un organe très complexe, dynamique et complexe qui dispose d&#39;une gamme de fonctions allant de l&#39;locomotion, à l&#39;homéostasie ionique. Constituée d&#39;os et de cartilage, le squelette se compose de populations de cellules fonctionnellement distinctes qui fonctionnent pour maintenir les structures, l&#39; intégrité mécanique et biochimique 1. L&#39;une des principales fonctions du squelette est son rôle dans le développement et la croissance. Ces procédés nécessitent l&#39;orchestration de plusieurs populations cellulaires qui sont réglementés par le biais du système endocrinien serré et le contrôle génétique. A l&#39;exception de l&#39;os plats par exemple omoplate, crâne et sternum, le squelette des mammifères est formé par le procédé connu sous le nom ossification endochondrale. Ce processus, à la fois réglementé moléculairement et spatialement, commence par la condensation des cellules mésenchymateuses dérivées principalement du mésoderme 2. Sous l&#39;influence du facteur SOX9 de transcription, les cellules de the intérieur des condensations se différencient en chondrocytes, exprimant et sécrétant des composants spécifiques du cartilage matrice extracellulaire (MEC), telles que le collagène de type II et de l&#39;aggrécane. Les cellules à la marge de la condensation, expriment collagène de type I et la forme du périchondre, délimitant l&#39;os prospective 3. Plus tard, les ostéoprogéniteurs du périchondre se différencier en ostéoblastes, réalisé par l&#39;expression des facteurs de transcription, et Runx2 osterix 4. Cela conduit à une prédominance des ostéoblastes et cette couche est renommé le périoste, qui forme une collerette osseuse minéralisée autour de la section médiane de l&#39;os. La pénétration vasculaire du périoste et de l&#39; invasion de l&#39;échafaudage cartilagineux se produit entraînant avec elle, haematopoetically dérivé des os, des cellules résorbant ostéoclastes qui résorbent les restes de chondrocytes et une grande partie de la matrice cartilagineuse 5. Les espaces formés sont remplis par ostéoprogéniteurs donnant lieu à l&#39;ossification primairecentre qui occupe progressivement le noyau de la diaphyse et se confond avec le périoste. D&#39;autres cellules donnent naissance à la moelle osseuse. Autour de la naissance, les vaisseaux sanguins et ostéoprogéniteurs pénètrent la matrice riche du cartilage de chaque côté (épiphyse) de la diaphyse de développement pour former le centre d&#39;ossification secondaire. Situé entre l&#39;épiphyse et la diaphyse à chaque extrémité des os longs est une bande de cartilage - la plaque de croissance épiphysaire - qui est chargé de coordonner la croissance linéaire de tous les os longs 6. Chondrocytes au sein de la plaque de croissance initialement prolifèrent et progressent ensuite à travers des zones morphologiquement distinctes, coordonnés par l&#39;expression séquentielle des facteurs de transcription et de croissance. L&#39;aboutissement de cette séquence d&#39;événements est la sortie du cycle cellulaire et de l&#39;hypertrophie des chondrocytes au centre de ce précurseur du cartilage. chondrocytes hypertrophiques expriment fortement collagène de type X et de la matrice métalloprotéinase-13 (MMP13) et leur élargissement considérable du volume dans le sens de la croissance longitudinale fournit la plus grande contribution à la croissance osseuse chez les mammifères 7,8. En outre, les chondrocytes hypertrophiques minéraliser les ECM environnant grâce à la libération des vésicules matricielles, des structures de membrane délimitée spécialisés pour la production de phosphate de calcium amorphe par l&#39;inclusion de phosphatases (tissu non-spécifique de la phosphatase alcaline (TNAP) et PHOSPHO1) et de calcium canaliser les protéines (annexines ) 9-11. Ce cartilage calcifié est envahi par les vaisseaux sanguins de la moelle sous-jacente résultant dans le recrutement des ostéoclastes et de la matrice de résorption. Elle est suivie par la migration des ostéoblastes et l&#39;alignement sur la surface des restes de cartilage calcifiés où ils déposent une couche de ostéoïde qui est rapidement minéralisé. L&#39;os tissé du spongieux primaire est ensuite remodelé à l&#39; os lamellaire du spongieuse secondaire 12. les résultats de la fusion dans le épiphysairescessation de l&#39; ossification endochondrale 13. Ossification endochondrale est sous une réglementation stricte par de nombreux endocrines et paracrines hormones et facteurs de croissance de manière à empêcher le développement de troubles et / ou la croissance osseuse longitudinale 14. Une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires et cellulaires qui sous-tendent ces processus est donc impératif dans notre quête de progrès cliniques vers bénéfice de l&#39;homme. Des recherches antérieures sur les similitudes et les différences entre les plaques de différents âges, les lieux et les espèces croissance ont grandement amélioré notre compréhension des mécanismes physiologiques dynamique de la plaque de croissance 15,16 environnantes. Cependant, l&#39;étude des chondrocytes isolés est difficile, comme l&#39; enlèvement des chondrocytes de leur environnement peut conduire à la dédifférenciation, accompagnée d&#39; une perte d&#39;expression de marqueurs clés tels que Col2a1 17. Le métatarsien de la souris explant d&#39;organe, pioneered par le Professeur Elisabeth Burger et ses collègues aux Pays - Bas, est un modèle ex vivo très physiologique pour étudier l&#39; ossification endochondrale et la croissance osseuse que le taux des os dans la culture imitent celle observée in vivo 18 de croissance. Exceptionnellement, la culture d&#39;organe métatarsien permet l&#39;examen des chondrocytes dans les différentes phases de la chondrogenèse et maintient la cellule-cellule et les interactions cellule-matrice, fournissant ainsi des conditions plus proches de la situation in vivo de cellules en culture 19-21. En outre, ce modèle permet un examen direct de la croissance osseuse linéaire qui est impossible dans les cultures de chondrocytes primaires. Il permet également la séparation des facteurs systémiques et locaux donc permettant l&#39;analyse spécifique des effets locaux sur la plaque de croissance. La culture de métatarsiens permet d&#39;enquêter sur de nombreux paramètres. Les mesures quotidiennes de la longueur totale et des régions minéraliséesles rudiments peuvent être réalisées avec un microscope à contraste de phase standard et des logiciels d&#39;analyse d&#39;images. Histologique, l&#39; hybridation in situ et la coloration immunohistologique en peut être aisément effectuée sur des coupes du métatarse, qui permet la résolution spatiale des deux entités moléculaires et cellulaires, un grand avantage par rapport aux procédés de culture cellulaire classiques. L&#39;approche immunohistochimique comprend la détection et la quantification de 5-bromo-2&#39;-désoxyuridine (BrdU) , l&#39; absorption par la prolifération des chondrocytes 22. De plus, le traitement ultérieur des tissus du métatarse peut être réalisée pour permettre une analyse en aval de l&#39;expression d&#39;ARNm (RT-qPCR), des protéines et analyse intracellulaire de signalisation (Western blot) ou de la composition lipidique (spectrométrie de masse). La plupart des études à ce jour utilisent métatarsiens embryonnaires cultivées plutôt que métatarses des animaux post-natal. Alors que les deux modèles peuvent être informatif, l&#39;étude des os embryonnaires présente plusieurs avantages: ils se développent plus rapidement et peut être exploité pour étudier l&#39;initiation et la progression du 23-25 de processus de minéralisation. Ce protocole décrit en détail la dissection complexe de métatarsiens embryonnaires du membre postérieur du jour embryonnaire 15 (E15) des embryons murins. En outre, la croissance et la minéralisation des métatarsiens anatomiquement distincts est représentée.

<table><tbody><tr><td>Ciseaux de dissection</td><td>World Precision Instruments</td><td>14393</td><td>Stérilisation en autoclave avant utilisation</td></tr><tr><td>Pince à épiler Dumont #5</td><td>World Precision Instruments</td><td>500342</td><td>Stérilisation en autoclave avant utilisation Pince</td></tr> à <tr><td>épiler Dumont #4</td><td>World Precision Instruments</td><td>500339</td><td>Stérilisation en autoclave avant utilisation</td></tr><tr><td>Ciseaux Vannas SuperFine</td><td>World Precision Instruments</td><td></td><td></td>501778</tr><tr><td>Éthanol absolu</td><td>Fisher Scientific</td><td>E/0650DF/17</td><td>Dilué à 70 % v/v en dH2O</td></tr><tr><td>&alpha ;-MEM sans nucléosides</td><td>Thermo Fischer Scientific&nbsp ;</td><td></td><td></td>22561021</tr><tr><td>Filtres à seringue d’albumine sérique bovine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A3059</td><td></td></tr><tr><td>(0,22 &mu ; m) 33 mm de diamètre</td><td>Merck Millipore</td><td>SLGP033RS</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de phosphocholine sel de calcium tétrahydraté</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P0378</td><td>Ajouter directement au milieu avant l’expérimentation</td></tr><tr><td>Acide l-ascorbique-2-phosphate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A8960</td><td>Compléter la soution de base à 5 mg/ml et aliquote à -20 &deg ; C</td></tr><tr><td>Chlorure de calcium dihydraté</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C5080</td><td>Stockage d’appoint à 150mM et aliquote à -20 &deg ; C</td></tr><tr><td>&beta ;-glycérophosphate disodium sel hydraté</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G9422</td><td>Maquillage stock soution à 1mM et aliquote à -20 &deg ; C</td></tr><tr><td>Gentamicine</td><td>Thermo Fischer Scientific&nbsp ;</td><td></td><td></td>15710049</tr><tr><td>amphotéricine B</td><td>Thermo Fischer Scientific&nbsp ;</td><td></td><td></td>15290018</tr><tr><td>Nunc (culture cellulaire) de plaques à 24 puits traitées par culture</td><td>cellulaire Thermo Fischer Scientific&nbsp ;</td><td></td><td></td>142475</tr><tr><td>Polybrène</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H9268</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermo Fischer Scientific&nbsp ;</td><td>D3571</td><td></td></tr></tbody></table>

culture de murines embryonnaires métatarsiens: un modèle physiologique de endochondrale ossification

Culture of Murine Embryonic Metatarsals: A Physiological Model of Endochondral Ossification

Le processus fondamental d’ossification endochondrale est soumis à une régulation stricte chez l’individu sain afin d’éviter un développement perturbé et/ou une croissance osseuse longitudinale. En tant que tel, il est impératif que nous approfondissions notre compréhension des mécanismes moléculaires sous-jacents impliqués dans de tels troubles afin de faire progresser le bénéfice des patients humains et animaux. La culture d’explants d’organes métatarsiens de souris est un modèle ex vivo hautement physiologique pour l’étude de l’ossification endochondrale et de la croissance osseuse, car le taux de croissance des os en culture imite celui observé in vivo. De manière unique, la culture d’organes métatarsiens permet l’examen des chondrocytes dans différentes phases de la chondrogenèse et maintient les interactions cellule-cellule et cellule-matrice, fournissant ainsi des conditions plus proches de la situation in vivo que les cellules en culture monocouche ou 3D. Ce protocole décrit en détail la dissection complexe des métatarses embryonnaires du membre postérieur d’embryons murins E15 et les analyses ultérieures qui peuvent être effectuées afin d’examiner l’ossification endochondrale et la croissance osseuse longitudinale.

Le but de cette méthode était d&#39;isoler les métatarses et la culture les embryons aux fins d&#39;examen de la croissance osseuse longitudinale et ECM minéralisation. En utilisant notre protocole décrit ici, métatarsiens embryonnaires ont été disséqués avec succès, comme visualisé par microscopie optique. Les mesures des os du métatarse, menées comme indiqué sur la figure 1, ont montré leur capacité à croître en longueur longitudinale et minéraliser leur ECM (figures 2 et 3). Minéralisation de la matrice est noté d&#39;abord dans le milieu de la diaphyse du rudiment d&#39;os et est facilement observé par microscopie optique. Aucune coloration est nécessaire, bien que l&#39;absorption de calcéine peut offrir une visualisation améliorée des minéraux nouvellement formé. Des études utilisant des métatarsiens embryonnaires à jour 22,27,28 ont mis en commun le disséqués 2 ème, 3 ème et 4 ème (centrale trois) métatarsiens, en supposant que la croissance in vitro et de la minéralisation soient comparables. In vivo de développement des métatarsiens murins, cependant, révèle que les 3 e et 4 e chiffres ont des preuves de la minéralisation avant tous les autres métatarsiens et des phalanges 29. L&#39; évaluation de la croissance et le potentiel de minéralisation de isolé individuellement et cultivées E15 2 e, 3 e et 4 e métatarsiens révélé aucune différence significative dans l&#39;apparition ou l&#39; étendue de la minéralisation après 7 jours de culture (figure 2). Aucune différence dans le pourcentage d&#39;augmentation de la ligne de base a été trouvé au cours de la période de culture. Comme aucune différence dans le potentiel de minéralisation a été noté le protocole standard de mise en commun des 2 e 3 e et 4 e métatarsiens semble valide pour les études futures. Traditionnellement, les chercheurs ont ajouté βGP aux médiasutilisé pour la culture métatarsiens embryonnaires pour promouvoir ECM minéralisation. Cependant, dans des études de culture cellulaire, il a été montré que , si TNAP enzyme est ajoutée aux milieux osteogenes contenant βGP ectopique dépôt de minéraux d&#39; hydroxyapatite persiste même en l&#39;absence de cellules 30. Pour examiner les effets de divers substrats et des agonistes minéralisation sur la capacité métatarsien de minéralisation, nous avons cultivé métatarsiens E15 dans les milieux de culture contenant une gamme de compléments, et les images et les mesures de longueur ont été enregistrés quotidiennement. Les résultats ont indiqué que E15 os du métatarse et se développent encore leur minéraliser ECM en l&#39;absence de βGP. E15 métatarsiens cultivées dans de l&#39; acide ascorbique seul média ont montré des augmentations comparables de longueur et de la minéralisation en tant métatarsiens cultivées en présence de βGP (Figure 3). Nous avons également démontré que les lentivirus peut être utilisée pour transfecter l&#39;ADN exogène dans metata cultivéesrsals. Ici , nous avons transfecté avec succès métatarsiens au jour 0 de la culture ( par exemple le jour de la dissection) avec 2 x 10 6 protéine fluorescente verte (GFP) , des particules virales par métatarsien. Pour activer la transduction du virus, polybrène a été simultanément ajouté aux cultures à 1: 500. Les cultures ont été laissées pendant 7 jours, sans changement de média tel que requis pour E15 métatarsien minéralisation se produire, avant d&#39;être mises en incubation avec 4 &#39;, 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) tache pendant 5 min, puis directement visualisées en utilisant un microscope confocal ( la figure 4). Notre preuve d&#39;expériences conceptuelles montrent clairement transduction efficace. Toutefois, il serait prudent d&#39;examiner les sections tout au long de la totalité de l&#39;os métatarsien pour évaluer leur manipulation génétique transfection et efficace. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/54978/54978fig1.jpg" /> Figure 1: Méthodologie standard utilisée pour mesurer la til Longueur et Minéralisation Zone de Embryonic Métatarsiens. (A) Total des mesures de longueur de métatarsiens E15 au jour 0 de la culture (jour de dissection) prise par le centre du métatarsien. (B) Les mesures de longueur longitudinale totale d&#39;un métatarsien après sept jours de culture. Notez la légère courbure dans le métatarsien. (C) Mesure de la longueur de la zone de minéralisation après sept jours de culture. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54978/54978fig1large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/54978/54978fig2.jpg" /> Figure 2: Croissance et Minéralisation Capacité de Anatomiquement Distinct E15 Métatarsiens Imaging et mesure de la 2e, 3e et 4e métatarsiens du membre postérieur de souris E15 w.interprété. (A) images de série de la 2e, 3e et 4e métatarsiens pendant toute la période de culture. (B) Pourcentage d&#39;augmentation de la longueur du jour 0 à chaque jour de culture. (C) Longueur minérale de la 2e, 3e et 4e métatarsiens sur la période de culture , exprimée en pourcentage de la longueur métatarsienne totale. Les données en sont représentés sous forme de moyenne ± erreur type de la moyenne (SEM), (n = 6). (D) C57BL / 6J longueurs métatarsiens à chaque jour de la culture. Les données sont représentées sous forme de moyenne ± écart type (n = 6). Noir bar = 1 mm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54978/54978fig2large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/54978/54978fig3.jpg" /> Figure 3: Croissance et Minéralisation Capacité de type sauvageE15 Métatarsiens Cultured dans divers médias ostéogénique. (A) images série de métatarsiens cultivées dans de l&#39; acide ascorbique seulement, 1 mM βGP, 3 mM phosphocholine, 1,5 mM de chlorure de calcium ou 3 mM de chlorure de calcium contenant des médias. (B) Pourcentage d&#39;augmentation de la longueur du jour 0 de métatarsiens cultivé avec les divers suppléments. (C) la longueur minérale de métatarsiens cultivées dans divers milieux , exprimée en pourcentage de la longueur totale du métatarse. Les données sont représentées en tant que moyenne ± écart-type de la moyenne (SEM), (n = 6). Noir bar = 1 mm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54978/54978fig3large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/54978/54978fig4.jpg" /> Figure 4: Transfection de E15 Métatarsiens avec GFP Virus Particles (A) . E15 métatarses ont été transfectées avec des particules de virus de la GFP pour la preuve du concept. (B) Bones ont été colorées avec du DAPI pour l&#39; ADN visualisation. (C) images doubles indiquent une transfection réussie du virus de la GFP à travers l&#39;ensemble des os du métatarse. Les barres blanches = 0,5 mm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54978/54978fig4large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>

Nous présentons un protocole pour disséquer et cultiver des os métatarsiens murins embryonnaires du jour 15 (E15). Ce modèle ex vivo hautement physiologique de l’ossification endochondrale offre des conditions plus proches de la situation in vivo que les cellules en monocouche ou en culture 3D et constitue un outil essentiel pour étudier la croissance et le développement osseux.

Culture de murines embryonnaires Métatarsiens: un modèle physiologique de endochondrale ossification

The fundamental process of endochondral ossification is under tight regulation in the healthy individual so as to prevent disturbed development and/or ...

L'objectif général de cette procédure est de disséquer et de cultiver des métatarses de souris embryonnaires afin de fournir un modèle ex vivo permettant l'étude de la croissance osseuse endochondrale et de la minéralisation. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés concernant l'ossification endochondrale, le processus par lequel les os longs grandissent. En particulier, elle est particulièrement adaptée pour étudier les mécanismes impliqués dans l'initiation de la minéralisation squelettique.Le principal avantage de cette technique est qu'elle fournit, grâce au maintien des interactions entre cellules et entre cellules et matrice, un modèle plus physiologique d'ossification endochondrale par rapport aux cellules cultivées en 2D ou en 3D. Pour commencer, préparez le milieu de dissection en diluant le milieu minimum essentiel alpha un à treize dans du PBS. Ensuite, resuspendez l'albumine sérique bovine à deux milligrammes par millilitre, puis stérilisez-la par filtration à l'aide d'un filtre à seringue.Ensuite, préparez le milieu de culture et stérilisez-le par filtration en utilisant le même type de filtre à seringue que celui utilisé pour l'albumine sérique bovine (BSA). Après avoir filtré le milieu de culture, ajoutez 300 microlitres de ce milieu dans chaque puits d'une plaque de culture 24 puits. Puis, placez la plaque de culture 24 puits contenant le milieu de culture et le milieu de dissection dans une étuve pendant au moins une heure afin de les équilibrer.Ensuite, immergez l'équipement de dissection stérilisé par autoclavage dans de l'éthanol à 70 %. Obtenez des embryons sauvages E15 C57 black 6J comme décrit dans le protocole textuel accompagnant et placez-les dans une boîte de Pétri contenant le milieu de dissection. Après la décapitation, lavez la peau avec de l'éthanol à 70 % et utilisez des micro-ciseaux de Vannas pour retirer les membres postérieurs des embryons en incisant autour du fémur proximal.Cela permet de retirer la plus grande partie possible de la patte postérieure. Placer les membres postérieurs dans une boîte de Pétri et les immerger dans du milieu de dissection avant la dissection des métatarsiens. Ensuite, les placer sous un microscope stéréoscopique.Utilisez une pince numéro quatre pour maintenir le membre en place tout en utilisant une pince numéro cinq pour retirer la peau entourant le pied embryonnaire. Cette manipulation est effectuée de manière optimale en saisissant la peau au niveau approximatif du tibia et en tirant vers les phalanges. Ensuite, utilisez la pince numéro quatre pour maintenir délicatement les os tarsiens du pied embryonnaire tout en utilisant la pince numéro cinq pour retirer et jeter les premier et cinquième métatarsiens.Avec le pied maintenu en position, utilisez la pince n°5 pour sectionner les tissus conjonctifs entre les trois phalanges et métatarsiens restants. Ensuite, insérez la pointe de la pince n°5 à l'articulation entre les phalanges et les métatarsiens afin de détacher les phalanges des métatarsiens. Enfin, utilisez la pince n°5 pour sectionner les tissus conjonctifs entre les os tarsiens et les métatarsiens.Placez à nouveau la pointe de la pince numéro cinq dans l'espace articulaire entre les tarses et les métatarses, puis détachez délicatement les métatarses des tarses. Ensuite, saisissez délicatement les métatarses désormais libres avec la pince numéro quatre et placez-les dans un milieu de dissection frais. Il est essentiel que les métatarses embryonnaires ne soient ni endommagés ni desséchés pendant les étapes de dissection et de manipulation.Les lésions des métatarsiens affectent leur croissance et leur minéralisation. Tous les tissus mous restants se détacheront des métatarsiens pendant la culture ; par conséquent, ne vous inquiétez pas outre mesure de leur élimination complète lors de la dissection. Une fois que tous les métatarsiens nécessaires ont été disséqués, placez soigneusement chaque métatarsien individuellement dans la plaque 24 puits préchauffée contenant 300 microlitres de milieu de culture.Ensuite, effectuez des mesures longitudinales initiales à l’aide d’un microscope équipé d’une caméra numérique et d’un logiciel d’analyse d’image. Cultivez les métatarses jusqu’à 14 jours. Toutefois, ne changez pas le milieu des cultures E15 avant le cinquième jour de culture, car cela affecte leur capacité de minéralisation.Après quelques jours en culture, mesurez la longueur de la zone de minéralisation centrale lorsqu'elle apparaît. Après quelques jours en culture, la minéralisation de la matrice se produit au niveau de la diaphyse médiane de l'élément osseux rudimentaire et est facilement observable en microscopie optique. Les métatarsiens deuxième, troisième et quatrième sont souvent regroupés pour les études embryonnaires.Au cours des sept jours de culture, les métatarsiens second, troisième et quatrième n'ont révélé aucune différence significative quant à l'aspect ou à l'étendue de la minéralisation, ce qui valide cette pratique. Afin d'examiner les effets de divers substrats de minéralisation et d'agonistes sur la capacité de minéralisation des métatarsiens, des métatarsiens E15 ont été cultivés dans des milieux contenant une gamme de suppléments, comme indiqué ici. Les images et les mesures de longueur ont été enregistrées quotidiennement.Par rapport à tous les substrats testés, l'acide ascorbique a augmenté la longueur du minéral au degré le plus élevé, comparable aux effets du bêta-glycérophosphate. La transfection par lentivirus du plasmide GFP dans des métatarses de stade E15 a entraîné une expression de la GFP dans tout le métatarse. Cela illustre l'utilisation du lentivirus pour transfecter avec succès des métatarses embryonnaires.Cette technique peut également être utilisée pour réduire ou surexprimer des gènes cibles. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de garder à l'esprit que les métatarses au stade E15 sont extrêmement fragiles. L'intégrité du métatarse est primordiale pour la réussite de la culture en aval.Après la dissection et la culture de métatarsiens à E15, de nombreuses analyses en aval peuvent être réalisées. Par exemple, l'expression des ARNm et des protéines peut être évaluée par RTQPCR et par immunotransfert, respectivement. En outre, l'immunohistochimie peut être utilisée pour localiser les protéines au sein du métatarsien.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de disséquer correctement les métatarses des membres postérieurs de souris au jour embryonnaire 15. Cette méthode peut être adaptée aux métatarses des jours embryonnaires 17 ou 18, qui sont plus utiles pour l'étude de la croissance osseuse.

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JoVE Journal

Developmental Biology

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