Identification des événements intracellulaires de signalisation induite dans les cellules viables par interaction avec les cellules voisines Subissant la mort cellulaire apoptotique

L’objectif global de cette procédure est d’identifier les événements de signalisation induits et les cellules répondeuses viables suite à leur interaction physique avec les cellules mortes voisines. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans les domaines de la biologie cellulaire, de la pathologie et de la physiologie, telles que l’influence que les cellules mortes ou mourantes exercent sur leurs voisins vivants. Les principaux avantages de cette technique sont qu’elle est simple et peu coûteuse, et qu’elle peut être appliquée pour étudier les effets biologiques induits dans les cellules vivantes suite à leur interaction avec les cellules voisines subissant l’apoptose.

Lanfei Feng, un technicien de mon laboratoire, fera la démonstration de la technique. Pour commencer cette procédure après avoir passé les cellules BUNPT dans des boîtes de culture tissulaire traitées au plasma de gaz sous vide de 100 millimètres, cultivez-les dans un milieu de culture A jusqu’à la confluence et une atmosphère humidifiée à 5 % de dioxyde de carbone à 37 degrés Celsius. Ensuite, induisez l’apoptose en incubant les cellules dans le milieu de culture B, contenant de la staurosporine, un inhibiteur non sélectif de la protéine kinase, pendant 3 heures à 37 degrés Celsius.

Après 3 heures, récupérez le milieu contenant les cellules apoptotiques flottantes qui se sont détachées de la monocouche. Ensuite, centrifugez ce milieu pendant dix minutes à 500 fois G.Ensuite, jetez le surnageant, lavez la pastille trois fois avec le milieu de culture B, avant de l’ajouter à nouveau aux cellules adhérentes. Après cette étape de lavage, détachez les cellules adhérentes restantes en ajoutant 5 millimolaires d’EDTA dans 1X sans calcium ni magnésium.

Prélevez le milieu contenant les cellules apoptotiques détachées et placez les cellules détachées avec les cellules apoptotiques flottantes dans un tube à centrifuger stérile en polystyrène de 15 millilitres. Ensuite, laver les cellules apoptotiques trois fois par centrifugation pendant dix minutes à 500 x G.Suivi d’une remise en suspension dans dix millilitres de 1X DPBS sans calcium et magnésium par lavage. Après le dernier lavage, suspendre les cellules apoptotiques dans le milieu de culture frais B à 5x10^6 cellules par millilitre, avant de les utiliser pour stimuler les cellules répondeuses.

Alternativement, fixez les cellules apoptotiques lavées dans 0,4 paraformaldéhyde dans 1X DPBS pendant 30 minutes, puis lavez-les trois fois avec le milieu de culture B, et suspendez-les dans celui-ci à 5x10^6 cellules par millilitre avant de les utiliser pour stimuler les cellules répondeuses. Après avoir passé les cellules BUNPT dans des boîtes de culture tissulaire sous vide en polystyrène stérile de 100 millimètres de diamètre, traitées, cultivez-les jusqu’à la confluence et humidifiez une atmosphère de dioxyde de carbone à 5 % dans des conditions permissives. Rincer ensuite la monocouche cellulaire adhérente trois fois avec 10 ml de milieu de culture B par rinçage.

Par la suite, détachez les cellules en ajoutant 5 mM d’EDTA dans 1X DPBS sans calcium et sans magnésium. Prélever les cellules détachées du milieu contenant de l’EDTA et ajouter la suspension cellulaire dans un tube à centrifuger stérile en polystyrène de 15 ml. Ensuite, lavez les cellules trois fois par centrifugation pendant dix minutes à 500 fois G et remettez en suspension dans 10 mL de DPBS sans calcium et sans magnésium par lavage.

Après le dernier lavage, suspendre les cellules dans le milieu de culture frais B à 5x10^6 cellules par millilitre. Ensuite, induisez la nécrose en chauffant les cellules à 70 degrés Celsius pendant 45 minutes dans un bain-marie, en faisant doucement tourbillonner cette suspension cellulaire toutes les dix minutes. Après l’induction de la nécrose, incubez les cellules pendant deux heures dans une atmosphère humidifiée à 5 % de dioxyde de carbone à 37 degrés Celsius, et faites doucement tourbillonner la suspension cellulaire toutes les 15 minutes.

Dans cette procédure, cultivez les cellules BUNPT dans des boîtes de culture de tissus stériles de 100 millimètres dans des conditions permissives, jusqu’à ce qu’elles atteignent une confluence d’environ 85 %. Ensuite, aspirez le milieu de culture A et rincez les cellules trois fois avec 10 ml de milieu de culture B par rinçage. Ensuite, le sérum affame les cellules du milieu de culture B pendant 18 à 24 heures dans une atmosphère humidifiée à 5 % de dioxyde de carbone dans des conditions non permissives, afin d’induire la quiescence.

Étiquetez une boîte de culture tissulaire distincte de cellules BUNPT confluentes pour les six conditions expérimentales de la procédure suivante. Maintenant, aspirez le milieu de culture B à partir des boîtes pré-étiquetées de cellules répondeuses BUNPT quiescentes. Pour préparer les boîtes de 100 millimètres dans différentes conditions, ajoutez deux mL du milieu de culture B sans cellules, de la suspension cellulaire apoptotique à 5X10^6 cellules par millilitre dans le milieu de culture B, ou de la suspension de cellules nécrotiques à 5X10^6 cellules par mL dans le milieu de culture B.Obtenez un rapport de un à un des cellules mortes par rapport aux cellules répondantes en ajoutant à un mL de cellules mortes à 5X10^6 cellules par millilitre à un Boîte confluente de 100 millimètres, qui contient 10X10^6 cellules.

Faites tourner doucement la vaisselle. Ensuite, incubez-les à 37 degrés Celsius dans l’atmosphère humidifiée à 5 % de dioxyde de carbone. Après 30 minutes, stimulez les cellules répondeuses avec soit le véhicule, soit avec 15 nMOL EGF, selon le pré-étiquetage de la boîte de culture.

Incuber les cellules pendant 15 minutes à 37 degrés Celsius dans une atmosphère humidifiée à 5 % de dioxyde de carbone. Ensuite, lavez les cellules mortes en ajoutant cinq millimètres de DPBS glacé. Faites tourner le plat et aspirez le liquide de lavage.

Répétez le lavage trois fois. Ensuite, placez immédiatement les boîtes de cellule d’intervention sur de la glace pour un traitement ultérieur. Cette figure montre que l’exposition des répondeurs BUNPT quiescents aux cellules apoptotiques pendant 30 minutes a fortement inhibé la phosphorylation basale de GSK3 alpha bêta.

Pour éviter l’interaction physique entre les répondeurs BUNPT et les cellules apoptotiques, les répondeurs BUNPT ont été cultivés dans un système de support perméable et séparés des cibles apoptotiques par une membrane en polycarbonate de 0,4 micron. La prévention de l’interaction physique entre les répondeurs BUNPT et les cellules apoptotiques a aboli la capacité des cibles apoptotiques à inhiber la phosphorylation de GSK3 alpha bêta. Pour évaluer le rôle de la phagocytose, l’inhibiteur du cytosquelette, la cytochalasine D, a été utilisé pour empêcher l’absorption phagocytaire des cellules mortes.

L’inhibition de la phosphorylation de GSK3 alpha bêta en réponse aux cellules apoptotiques s’est produite en l’absence de phagocytose. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en 4 à 6 heures si elle est correctement exécutée, à l’exclusion du temps nécessaire à l’électrophorèse sur gel et à l’immunobuvardage. En tentant cette procédure, il est important de se rappeler que l’utilisation d’une suspension cellulaire par opposition à un ligand soluble comme stimulus pose plusieurs obstacles expérimentaux inhérents et largement inévitables.

En utilisant la même procédure, on peut étudier d’autres fonctions cellulaires, telles que la survie, la prolifération ou la croissance cellulaire, afin de déterminer les conséquences fonctionnelles des événements de signalisation qui sont induits dans les cellules répondantes vivantes suite à leur interaction avec les cellules mortes voisines. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’identifier des événements de signalisation spécifiques qui sont induits dans les cellules répondeuses viables suite à leur interaction physique avec les cellules mortes voisines.