Utilisation de cristallographie aux rayons X, biophysique, et des tests fonctionnels pour déterminer les mécanismes d'administration des lymphocytes T Reconnaissance des récepteurs du cancer Antigènes

L’objectif global de cette procédure est de générer des protéines régulbinaires solubles du récepteur des lymphocytes T et des protéines peptidiques HLA de qualité suffisante pour être utilisées dans l’analyse biophysique et structurale. Cette méthode pourrait aider à répondre aux questions dans le domaine de l’immunologie des lymphocytes T. Par exemple, pourquoi les lymphocytes T ne répondent-ils pas de manière robuste au cancer ?

Le principal avantage de cette technique est que nous obtenons des données mécanistes à très haute résolution expliquant comment les récepteurs des lymphocytes T reconnaissent leurs cibles, ce qui conduit à des réponses immunitaires médiées par les lymphocytes T. Les implications de cette technique s’étendent au traitement ou au diagnostic de pratiquement toutes les maladies humaines, car les lymphocytes T jouent un rôle central dans la plupart des réponses immunitaires. Bien que cette méthode puisse donner un aperçu des réponses immunitaires des lymphocytes T, elle peut également être appliquée à d’autres systèmes contrôlés par les interactions entre les ligands des récepteurs.

En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode auront du mal car il est très difficile de générer des protéines solubles et actives de qualité suffisante pour des expériences biophysiques et structurelles. Pour commencer la procédure de repliement du peptide HLA à six millilitres de tampon de guanidine avec 10 milomètres de dithiothréitol, ajoutez 30 milligrammes de corps d’inclusion HLA-A2, 30 milligrammes de corps d’inclusion bêta 2-M et quatre milligrammes du peptide d’intérêt souhaité. Incuber le mélange pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius.

Ensuite, diluez le mélange avec un litre de tampon de repliement HLA, pré-refroidi à quatre degrés Celsius et remuez le mélange pendant trois heures à cette température. Dialysez le mélange deux fois contre 20 litres de tris de 10 millimolaires, pH 8,1, pendant 24 heures chacun. Pour commencer la procédure de repliement TCR, à six millilitres de tampon de guanidine avec 10 millimolaires de dithiothréitol, ajoutez 30 milligrammes chacun de TCR Alpha et de chaîne bêta IB.

Incuber le mélange pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius et diluer le mélange dans un litre de tampon de repliage TCR pré-réfrigéré. Mélangez et dialysez le mélange de repliement TCR dilué de la même manière que le mélange de peptides HLA. Filtrez les deux mélanges dialysés repliés à travers un filtre à membrane de 0,45 micromètre.

Ensuite, chargez l’une des préparations de repliement filtrées sur une colonne de résine échangeuse d’anions de 7,9 millilitres de 50 micromètres, pré-équilibrée avec 20 millilitres de tris de 10 millimolaires, pH 8,1. Éluer la protéine avec un système tampon de gradient de sel à cinq millilitres par minute. Collectez des fractions d’un millilitre et analysez-les avec SDS-Page.

Combinez les fractions contenant la protéine repliée. Placez le mélange de protéines dans un concentrateur centrifuge de coupure de poids moléculaire de 10 kilodaltons. Centrifugez le mélange pendant 20 minutes ou aussi longtemps que nécessaire, à 4000 fois g, pour concentrer le mélange à 500 microlitres.

Jetez le flux. Moulez la préparation protéique concentrée dans une boucle d’injection de deux millilitres et injectez la protéine dans une colonne de chromatographie d’exclusion de 24 millilitres, pré-équilibrée avec le tampon d’élusion approprié. Éluer la protéine avec une colonne de volume de tampon à 0,5 millilitre par minute.

Collectez des fractions d’un millilitre, analysez les fractions avec SDS-Page et combinez les fractions contenant la protéine d’intérêt. Préparer 10 dilutions en série de la solution de TCR, dans une plage de concentration allant de 10 fois au-dessus à 10 fois au-dessous du KD de l’interaction HLA du peptide spécifique du TCR si elle est connue. Sinon, commencez à partir d’une concentration TCR de 200 micromolaires.

Ensuite, activez une puce de capteur recouverte de dextran carboxyméthylé en faisant couler un à un mélange de 100 millimolaires et de N-hydroxysuccinimide et de 400 millimolaires d’EDC sur la puce à un débit de 10 microlitres par minute pendant 10 minutes, à 25 degrés Celsius. Ensuite, chargez 110 microlitres de 200 microgrammes par millilitre de streptavidine et 10 millimolaires d’acétate pH 4,5 dans les quatre cellules d’écoulement pour fonctionnaliser la surface de la puce. Désactivez tous les groupes réactifs restants avec 100 microlitres d’une molaire de chlorhydrate d’éthanolamide.

Ensuite, faites couler une solution d’environ un peptide micromolaire HLA dans le tampon fourni par le fabricant de la puce sur la surface de la puce à 10 microlitres par minute jusqu’à ce que le nombre d’unités de réponse augmente de 500 à 600. Saturez la surface de la puce avec une biotine millimolaire et un tampon fourni par le fabricant pendant 60 secondes. Ensuite, injectez les 10 dilutions en série de la solution TCR à 30 microlitres par minute à 25 degrés Celsius.

Calculez la constante de liaison à l’équilibre et exécutez une analyse cinétique. Effectuez une série d’expériences SPR de cette manière, en ne faisant varier que la température à laquelle les dilutions TCR sont injectées. Déterminez la constante de liaison à l’équilibre pour chaque température et calculez les énergies de Gibbs et d’autres paramètres thermodynamiques.

Branchez les énergies de Gibbs en fonction de la température à l’aide d’un ajustement de régression non linéaire. Concentrer la solution peptidique HLA à 0,2 millimolaire et le tampon de cristallisation par centrifugation à 3 000 fois g, dans un concentrateur centrifuge de coupure de poids moléculaire de 10 kilodaltons. Préparez une solution de 0,1 millimolaire de TCR un à un et de peptide HLA pour la cristallisation co-complexe.

À l’aide d’un robot de cristallisation et d’un kit de dépistage, préparez des essais de cristallisation en utilisant la technique de la goutte assise dans une plaque à 96 puits. Avec 60 microlitres de tampon de cristallisation dans chaque réservoir, et chaque goutte étant composée de 200 nanolitres de solution protéique et de tampon. Faites pousser les cristaux à 18 degrés Celsius.

Score pour les cristaux au microscope après 24 heures, 48 heures, 72 heures, puis chaque semaine. Une fois que les monocristaux de qualité suffisante ont poussé, récoltez les monocristaux avec une boucle compatible avec le cryogène et stockez les cristaux dans de l’azote liquide. Effectuez la diffraction synchrotron des rayons X sous un flux d’azote gazeux à 100 kelvins, analysez les données et résolvez les structures avec le logiciel approprié.

Calculez les contacts, la complémentarité de surface et l’angle de croisement des structures résolues. À l’aide de ces méthodes, les molécules TCR et peptidique HLA ont été exprimées et repliées sous une forme soluble. Le peptide dans les molécules peptidiques HLA était l’antigène gp100.

La SPR a été utilisée pour déterminer l’affinité de liaison du TCR PMEL17 pour l’antigène à différentes températures. La SPR et le titrage calorimétrique isotherme ont ensuite été utilisés, pour déterminer les paramètres thermodynamiques de l’interaction protéine-protéine. Le complexe PMEL17 TCR A2-YLE-9V a été cristallisé et évalué par diffraction synchrotron des rayons X.

Les boucles CDR du TCR et les résidus HLA peptidiques contactés par la protéine TCR ont tous deux été identifiés et la nature des contacts a été étudiée. Les molécules HLA du peptide avec des formes mutées du peptide ont également été purifiées et cristallisées de cette manière. Étudier les différences structurelles qui pourraient empêcher les interactions de liaison avec le TCR.

Il a été constaté que la mutation du troisième ou cinquième résidu modifiait considérablement la position de la proline quatre, ce qui perturberait de nombreux contacts avec la boucle alpha TCR CDR-3. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de ne sélectionner que les protéines les plus pures pour une analyse plus approfondie. À la suite de cette procédure, d’autres méthodes, telles que la coloration peptidique du tétramère HLA, peuvent être réalisées à l’aide des protéines solubles afin d’isoler les cellules T spécifiques de l’antigène du sang du patient à des fins de diagnostic et d’analyse plus approfondie.

Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de l’immunologie des lymphocytes T pour explorer la liaison du peptide HLA TCR dans les moindres détails, permettant ainsi le développement de nouveaux médicaments contre le cancer et d’autres maladies humaines. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de générer des protéines TCR et peptidiques HLA de qualité suffisante pour effectuer une analyse biophysique et structurale.