Name: Production de réplication défectueuse Rétrovirus par transfection transitoire de cellules 293T (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-12-04T04:22:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: Découvrez la production de rétrovirus à réplication défectueuse par transfection transitoire de cellules 293T pour modéliser les maladies myéloprolifératives induites par des oncogènes humains chez la souris.

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<ol><li> Le soir, avant la transformation des cellules plaque, au 293T 3-5x10 6 cellules / tissus 6 cultureplate cm. Note: Nous utilisons des cellules 293T pour leur facilité de transfection et les cellules produisant le virus efficacyas. Ces cellules sont déficientes en emballage le virus moins un plasmide auxiliaire est introduite. </li><li> Le premier matin, retirer délicatement les moyennes et les remplacer avec 4 ml de cellules 293T med contenant 25 mM de chloroquine. Mettez dans un incubateur pendant 1 heure. Remarque: la plaque devrait être d&#39;environ 80% de confluence. </li><li> Pendant ce temps, préparer le virus de prise de mélange pour 2 plaques à la fois, dans des tubes de 5 ml: <ol><li> 2 x 10 mg de construire plasmidique retroviral </li><li> 2 x 5 mg d&#39;emballage de construire (EcoPak), </li><li> 2 x 62 ml de CaCl </li><li> complète à 1 ml avec stériles O 2 ddH Note: Bien que le plasmide rétroviral codant l&#39;oncogène d&#39;intérêt et un marqueur, EcoPak encode gag-pol-env. Ensemble avec les cellules 293T, ils vont produire un rétrovirus écotrope (RV) spécifique des cellules de souris, mais pas infectieux pour les cellules humaines. Fois à la chloroquine et du CaCl 2 a été démontré pour augmenter l&#39;efficacité de la transfection. </li></ol></li><li> Ajouter 1ml de sterileHBS 2x goutte à goutte au mélange, tout doucement le tube vortex. </li><li> Immédiatement ajouter cette solution à 2 plaques, 1 ml chacun, doucement, goutte à goutte. </li><li> Mettez dans un incubateur pendant 7 à 11 heures. </li><li> Dans la soirée (7 à 11 heures. Ultérieurement), retirer délicatement les moyennes, et très doucement remplacer par 5 ml de milieu 293T frais. Mettre en incubateur jusqu&#39;à midi, le lendemain. Remarque: cette étape est importante, car vous avez besoin pour décoller de la chloroquine à partir des cellules. Si on les garde pour des périodes de temps prolongées, la chloroquine est toxique. La solution dans les plaques semble floue, en raison d&#39;une très fine, comme de la poussière précipitation du mélange de transfection. Note: Il est important de faire tous les changements des médias avec une douceur extrême, comme les cellules ont été sensibilisés par la chloroquine, et peut facilement se détacher de la plaque. </li><li> Le lendemain, 18 à 24 heures. avant de récupérer le virus (vers midi), retirer délicatement les moyennes, et très doucement remplacer par 3 ml de milieu 293T frais. Remplacer dans l&#39;incubateur d&#39;O / N. </li><li> Le troisième matin (18 à 24 heures. Ultérieurement), doucement sucer le formulaire support les plaques avec une seringue de 10 ml muni d&#39;une aiguille de 18 G. Ce surnageant contient les rétrovirus. </li><li> Changer l&#39;aiguille à un filtre à seringue de 45 mm, inverser la seringue plusieurs fois pour mélanger la solution ainsi, passer le surnageant à travers le filtre, et de l&#39;aliquote pour cryotubes Note: Alternativement, si vous faites 3 ​​plaques + de virus, de la piscine tous les surnageants du même virus dans un 5 0 ml tube conique. Mélangez bien, puis les surnageants aliquote contenant le rétrovirus dans des cryotubes par filtrage. </li><li> Les tubes contenant les surnageants virus complets sont conservés dans -80 ° C jusqu&#39;à leur utilisation. </li></ol>

<ol><li>DuBridge, R. B., Tang, P., Hsia, H. C., Leong, P. M., Miller, J. H., Calos, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+mutation+in+human+cells+by+using+an+Epstein-Barr+virus+shuttle+system%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of mutation in human cells by using an Epstein-Barr virus shuttle system.</a> Mol Cell Biol. 7, 379-387 (1987).</li>
<li>Cherry, S. R., Biniszkiewicz, D., van Parijs, L., Baltimore, D., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retroviral+expression+in+embryonic+stem+cells+and+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Retroviral expression in embryonic stem cells and hematopoietic stem cells.</a> Mol Cell Biol. 20, 7419-7426 (2000).</li>
<li>Finer, M. H., Dull, T. J., Qin, L., Farson, D., Roberts, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((kat%3A+A+high-efficiency+retroviral+transduction+system+for+primary+human+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">kat: A high-efficiency retroviral transduction system for primary human T lymphocytes.</a> Blood. 83, 43-50 (1994).</li>
<li>Naviaux, R. K., Costanzi, E., Haas, M., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pCL+vector+system%3A+rapid+production+of+helper-free%2C+high-titer%2C+recombinant+retroviruses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">The pCL vector system: rapid production of helper-free, high-titer, recombinant retroviruses.</a> J Virol. 70, 5701-5705 (1996).</li>
<li>Pear, W. S., Miller, J. P., Xu, L., Pui, J. C., Soffer, B., Quackenbush, R. C., Pendergast, A. M., Bronson, R., Aster, J. C., Scott, M. L., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+and+rapid+induction+of+a+chronic+myelogenous+leukemia-like+myeloproliferative+disease+in+mice+receiving+P210+bcr%2Fabl-transduced+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Efficient and rapid induction of a chronic myelogenous leukemia-like myeloproliferative disease in mice receiving P210 bcr/abl-transduced bone marrow.</a> Blood. 92, 3780-3792 (1998).</li>
<li>Pear, W. S., Nolan, G. P., Scott, M. L., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+high-titer+helper-free+retroviruses+by+transient+transfection%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Production of high-titer helper-free retroviruses by transient transfection.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 90, 8392-8396 (1993).</li>
<li>Stocking, C., Kollek, R., Bergholz, U., Ostertag, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+terminal+repeat+sequences+impart+hematopoietic+transformation+properties+to+the+myeloproliferative+sarcoma+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Long terminal repeat sequences impart hematopoietic transformation properties to the myeloproliferative sarcoma virus.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 82, 5746-5750 (1985).</li>
<li>Van Etten, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Models+of+chronic+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Oncol+Rep%22%5BJournal%5D)">Models of chronic myeloid leukemia.</a> Curr Oncol Rep. 3, 228-237 (2001).</li>
<li>Van Etten, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+the+pathogenesis+of+BCR-ABL%2B+leukemia+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Studying the pathogenesis of BCR-ABL+ leukemia in mice.</a> Oncogene. 21, 8643-8651 (2002).</li>
</ol>

Quatre points essentiels seront d&#39;assurer la réussite d&#39;un bon stock viral: <ol><li> Les cellules 293T de production doivent être en très bonne santé, ce qui signifie qu&#39;ils ont été séparés sur un calendrier très régulière, n&#39;ont jamais été envahi, et sont étalées à la densité optimale de 3,5 à 5000000 pour 6 cm de plaque de culture tissulaire, afin qu&#39;ils atteignent une densité de 80% de la plaque sur le matin de la transfection. </li><li> L&#39;addition de chloroquine améliore l&#39;efficacité de transf...

Tous les réactifs utilisés pour la transfection doit être stérilisée par filtration (CaCl 2, 2x HBS, miliQ H 2 O) et maintenu stérile.

production de réplication défectueuse rétrovirus par transfection transitoire de cellules 293t

Production of Replication-Defective Retrovirus by Transient Transfection of 293T cells

Nos études de laboratoire humaine myéloprolifératifs induite par les oncogènes tels que Bcr-Abl ou facteur de croissance dérivé des récepteurs oncogènes (ZNF198-FGFR1, Bcr-PDGFRα, etc.) Nous sommes capables de modéliser et d&#39;étudier une maladie humaine, comme dans notre modèle de souris, par la transplantation de cellules de moelle osseuse préalablement infectés par un rétrovirus exprimant l&#39;oncogène d&#39;intérêt. La réplication des rétrovirus défectifs codant pour une oncogène humain et un marqueur (GFP, RFP, gène de résistance aux antibiotiques, etc) est produit par un protocole de transfection transitoire en utilisant des cellules 293T, une lignée de cellules épithéliales rénales transformés par le produit du gène E1A d&#39;adénovirus. 293 cellules ont la propriété inhabituelle d&#39;être très transfectables par phosphate de calcium (Capo 4), avec un maximum à 50-80% d&#39;efficacité de transfection facilement réalisable. Ici, nous avons co-transfecter 293 cellules avec un vecteur rétroviral exprimant l&#39;oncogène d&#39;intérêt et un plasmide qui exprime les fonctions de conditionnement gag-pol-env, tel que le génome unique emballage construit kat ou PCL, dans ce cas le EcoPak plasmide. La transfection initiale est encore améliorée par l&#39;utilisation de la chloroquine. Les stocks de virus de écotrope, recueillis dans le surnageant de culture de 48 heures. post-transfection, peuvent être conservés à -80 ° C et utilisés pour l&#39;infection de lignées cellulaires en vue de la transformation et des études in vitro, ou des cellules primaires tels que les cellules de la moelle osseuse de souris, qui peuvent ensuite être utilisés pour une transplantation dans notre modèle de souris .

Cette technique démontre d&#39;une manière efficace de se préparer à réplication déficiente stocks rétroviraux codant pour une oncogène humain, et par la suite utilisé pour l&#39;induction de syndromes myéloprolifératifs dans le modèle murin.

Production de réplication défectueuse Rétrovirus par transfection transitoire de cellules 293T

Notre laboratoire étudie les maladies myéloprolifératives humaines induites par des oncogènes tels que Bcr-Abl ou des oncogènes dérivés de récepteurs de facteurs de croissance (ZNF198-FGFR1, ...

Nous sommes ici à l'Institut de recherche en oncologie moléculaire du centre médical Tufts New England. Je m'appelle Christina Lesco et je suis chercheuse postdoctorale dans le laboratoire du Dr. Rick Van. Notre laboratoire étudie la leucémie immunogène humaine, la LMC et les maladies de type LMC.Nous modélisons cette maladie humaine chez la souris, et la méthode que nous utilisons consiste à introduire l'oncogène humain au moyen d'un vecteur rétroviral. La première étape pour introduire cet oncogène humain dans des cellules de souris consiste donc à produire le virus lui-même. L'étape suivante consistera à concentrer effectivement le virus.Voici donc ma plaque de cellules souches 293T. Je vais devoir éliminer le milieu avec du PBS. Les cellules 293T sont des cellules adhérentes, cependant elles ne sont pas fortement adhérentes, donc chaque manipulation doit être très douce. Une fois le lavage effectué, nous allons remplacer le PBS par de la trypsine.Afin de détacher les cellules de la plaque, nous devons replacer la plaque dans l'incubateur pendant environ trois minutes. Après ces deux à trois minutes, les cellules sont effectivement en suspension. Nous allons ajouter quelques millilitres supplémentaires de milieu ordinaire.Cela va neutraliser la tripsine. À ce stade, nous effectuons des pipetages répétés afin de bien maintenir toutes les cellules en suspension, puis nous transférons la suspension dans un tube de 50 ml pour compter les cellules en présence de bleu de trypan, en utilisant un hémocytomètre pour effectuer le dénombrement manuellement. Je réalise donc maintenant ma dilution selon le calcul, puis je vais ensemencer trois fois dix puissance six cellules par plaque.Dans 4 ml de milieu, nous nous assurons que les cellules sont bien ensemencées, puis nous remettrons les plaques dans l'incubateur pendant 16 à 18 heures, généralement jusqu'au lendemain matin. Nous sommes donc maintenant à 48 heures post-infection par le virus GFP. La chloroquine est utilisée afin d'augmenter l'incorporation de l'ADN que nous allons ajouter sur les cellules.Nous avons doucement aspiré le milieu des cellules, qui se sont maintenant fixées délicatement aux plaques sur le côté de la plaque. À ce stade, nous allons replacer les plaques dans les incubateurs pendant environ une heure. Pendant ce temps, nous allons préparer notre mélange d'ADN à appliquer sur les cellules : un premier fragment exprimant un gène de résistance à la néomycine et un autre exprimant effectivement la GFPI, en utilisant de l'ADN XI afin de contrôler toute la transfection.Enfin, nous ajoutons du chlorure de calcium. L'utilisation de chlorure de calcium augmente considérablement l'efficacité de la transfection. Nous sommes maintenant une heure plus tard. Nous avons récupéré les plaques avec le milieu contenant la chloroquine et nous allons y ajouter notre solution de transfection.La dernière étape que nous devons effectuer consiste à ajouter effectivement un ml de HBS stérile 2 x tout en ajoutant la solution H2XHBS. Nous devons agiter le tube au vortex en même temps et procéder lentement, goutte à goutte. Cela permet d'éviter les précipitations ; répartissez immédiatement un ml de solution dans la plaque d'intérêt, et nous effectuons à nouveau cette opération goutte à goutte.À ce stade, les cellules 293T sont très sensibilisées en raison du milieu contenant de la chloroquine. Il est nécessaire de maintenir toute la zone couverte et de déplacer les plaques le moins possible. Étiquetez la plaque avec le construct que vous avez ajouté et répétez l'opération pour le construct suivant.À ce stade, remettez les plaques dans l'incubateur pendant sept à onze heures. Au moins sept heures, mais pas plus de onze, car les cellules sont très sensibilisées en raison de la chloroquine, et nous devrons changer le milieu après ce délai. Nous sommes désormais à environ 30 heures après la transfection.Il s'agit de notre dernier changement de milieu à ce stade, les cellules 2 9 3 C3 T ayant atteint la confluence. Nous devons, encore une fois, être très délicats lors de l'ajout du nouveau milieu sur le côté de la plaque. J'utilise une seringue de 10 ml munie d'une aiguille.Je vais remplacer l'aiguille par un filtre, donc je mélange bien le milieu. À ce stade, nous avons collecté notre virus et nous pouvons le placer à moins 80 degrés jusqu'à son utilisation. La première chose à faire est en réalité de concentrer le virus. Il existe plusieurs étapes sensibles lors de la production de virus, et la première consiste à avoir la bonne concentration de cellules 293T.Nous les mettons en culture à raison de trois fois dix puissance six cellules par plaque, car après 18 heures, elles seront environ à 80 % de confluence. Cela leur laisse encore du temps pour continuer à croître, de sorte qu'après 24 heures suivant la transfection, elles atteindront 100 % de confluence. Il a été démontré que cela est très important pour obtenir un titre viral excellent.L'étape suivante consiste à utiliser de la chloroquine, qui sensibilise en réalité les cellules 2 9 3, et tous les changements de milieu doivent être effectués très délicatement afin que la couche complète de cellules 2 9 3 T ne se détache pas de la plaque. Enfin, l'ADN utilisé pour produire le virus doit être extrêmement pur. Nous utilisons de l'ADN C banded.Une fois que nous avons notre virus, nous le conservons à moins 80 degrés. Nous effectuons généralement une seule amplification par chaque passage, ce qui réduit la concentration du virus de moitié. Par conséquent, nous préférons congeler le virus que nous avons produit avant de procéder à la détermination réelle de la concentration virale.En fonction des virus, nous pouvons avoir soit une expression de GFP avec le virus afin de suivre les cellules réellement infectées, soit une résistance à la néomycine. Il est très important de disposer de la titration du virus avant de l'utiliser, afin de pouvoir assurer la comparabilité entre les expériences ou entre différents mutants.

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