Name: Production de réplication défectueuse Rétrovirus par transfection transitoire de cellules 293T (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-12-04T04:22:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: Découvrez la production de rétrovirus à réplication défectueuse par transfection transitoire de cellules 293T pour modéliser les maladies myéloprolifératives induites par des oncogènes humains chez la souris.

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<ol><li> Le soir, avant la transformation des cellules plaque, au 293T 3-5x10 6 cellules / tissus 6 cultureplate cm. Note: Nous utilisons des cellules 293T pour leur facilité de transfection et les cellules produisant le virus efficacyas. Ces cellules sont déficientes en emballage le virus moins un plasmide auxiliaire est introduite. </li><li> Le premier matin, retirer délicatement les moyennes et les remplacer avec 4 ml de cellules 293T med contenant 25 mM de chloroquine. Mettez dans un incubateur pendant 1 heure. Remarque: la plaque devrait être d&#39;environ 80% de confluence. </li><li> Pendant ce temps, préparer le virus de prise de mélange pour 2 plaques à la fois, dans des tubes de 5 ml: <ol><li> 2 x 10 mg de construire plasmidique retroviral </li><li> 2 x 5 mg d&#39;emballage de construire (EcoPak), </li><li> 2 x 62 ml de CaCl </li><li> complète à 1 ml avec stériles O 2 ddH Note: Bien que le plasmide rétroviral codant l&#39;oncogène d&#39;intérêt et un marqueur, EcoPak encode gag-pol-env. Ensemble avec les cellules 293T, ils vont produire un rétrovirus écotrope (RV) spécifique des cellules de souris, mais pas infectieux pour les cellules humaines. Fois à la chloroquine et du CaCl 2 a été démontré pour augmenter l&#39;efficacité de la transfection. </li></ol></li><li> Ajouter 1ml de sterileHBS 2x goutte à goutte au mélange, tout doucement le tube vortex. </li><li> Immédiatement ajouter cette solution à 2 plaques, 1 ml chacun, doucement, goutte à goutte. </li><li> Mettez dans un incubateur pendant 7 à 11 heures. </li><li> Dans la soirée (7 à 11 heures. Ultérieurement), retirer délicatement les moyennes, et très doucement remplacer par 5 ml de milieu 293T frais. Mettre en incubateur jusqu&#39;à midi, le lendemain. Remarque: cette étape est importante, car vous avez besoin pour décoller de la chloroquine à partir des cellules. Si on les garde pour des périodes de temps prolongées, la chloroquine est toxique. La solution dans les plaques semble floue, en raison d&#39;une très fine, comme de la poussière précipitation du mélange de transfection. Note: Il est important de faire tous les changements des médias avec une douceur extrême, comme les cellules ont été sensibilisés par la chloroquine, et peut facilement se détacher de la plaque. </li><li> Le lendemain, 18 à 24 heures. avant de récupérer le virus (vers midi), retirer délicatement les moyennes, et très doucement remplacer par 3 ml de milieu 293T frais. Remplacer dans l&#39;incubateur d&#39;O / N. </li><li> Le troisième matin (18 à 24 heures. Ultérieurement), doucement sucer le formulaire support les plaques avec une seringue de 10 ml muni d&#39;une aiguille de 18 G. Ce surnageant contient les rétrovirus. </li><li> Changer l&#39;aiguille à un filtre à seringue de 45 mm, inverser la seringue plusieurs fois pour mélanger la solution ainsi, passer le surnageant à travers le filtre, et de l&#39;aliquote pour cryotubes Note: Alternativement, si vous faites 3 ​​plaques + de virus, de la piscine tous les surnageants du même virus dans un 5 0 ml tube conique. Mélangez bien, puis les surnageants aliquote contenant le rétrovirus dans des cryotubes par filtrage. </li><li> Les tubes contenant les surnageants virus complets sont conservés dans -80 ° C jusqu&#39;à leur utilisation. </li></ol>

<ol><li>DuBridge, R. B., Tang, P., Hsia, H. C., Leong, P. M., Miller, J. H., Calos, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+mutation+in+human+cells+by+using+an+Epstein-Barr+virus+shuttle+system%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of mutation in human cells by using an Epstein-Barr virus shuttle system.</a> Mol Cell Biol. 7, 379-387 (1987).</li>
<li>Cherry, S. R., Biniszkiewicz, D., van Parijs, L., Baltimore, D., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retroviral+expression+in+embryonic+stem+cells+and+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Retroviral expression in embryonic stem cells and hematopoietic stem cells.</a> Mol Cell Biol. 20, 7419-7426 (2000).</li>
<li>Finer, M. H., Dull, T. J., Qin, L., Farson, D., Roberts, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((kat%3A+A+high-efficiency+retroviral+transduction+system+for+primary+human+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">kat: A high-efficiency retroviral transduction system for primary human T lymphocytes.</a> Blood. 83, 43-50 (1994).</li>
<li>Naviaux, R. K., Costanzi, E., Haas, M., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pCL+vector+system%3A+rapid+production+of+helper-free%2C+high-titer%2C+recombinant+retroviruses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">The pCL vector system: rapid production of helper-free, high-titer, recombinant retroviruses.</a> J Virol. 70, 5701-5705 (1996).</li>
<li>Pear, W. S., Miller, J. P., Xu, L., Pui, J. C., Soffer, B., Quackenbush, R. C., Pendergast, A. M., Bronson, R., Aster, J. C., Scott, M. L., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+and+rapid+induction+of+a+chronic+myelogenous+leukemia-like+myeloproliferative+disease+in+mice+receiving+P210+bcr%2Fabl-transduced+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Efficient and rapid induction of a chronic myelogenous leukemia-like myeloproliferative disease in mice receiving P210 bcr/abl-transduced bone marrow.</a> Blood. 92, 3780-3792 (1998).</li>
<li>Pear, W. S., Nolan, G. P., Scott, M. L., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+high-titer+helper-free+retroviruses+by+transient+transfection%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Production of high-titer helper-free retroviruses by transient transfection.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 90, 8392-8396 (1993).</li>
<li>Stocking, C., Kollek, R., Bergholz, U., Ostertag, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+terminal+repeat+sequences+impart+hematopoietic+transformation+properties+to+the+myeloproliferative+sarcoma+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Long terminal repeat sequences impart hematopoietic transformation properties to the myeloproliferative sarcoma virus.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 82, 5746-5750 (1985).</li>
<li>Van Etten, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Models+of+chronic+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Oncol+Rep%22%5BJournal%5D)">Models of chronic myeloid leukemia.</a> Curr Oncol Rep. 3, 228-237 (2001).</li>
<li>Van Etten, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+the+pathogenesis+of+BCR-ABL%2B+leukemia+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Studying the pathogenesis of BCR-ABL+ leukemia in mice.</a> Oncogene. 21, 8643-8651 (2002).</li>
</ol>

Quatre points essentiels seront d&#39;assurer la réussite d&#39;un bon stock viral: <ol><li> Les cellules 293T de production doivent être en très bonne santé, ce qui signifie qu&#39;ils ont été séparés sur un calendrier très régulière, n&#39;ont jamais été envahi, et sont étalées à la densité optimale de 3,5 à 5000000 pour 6 cm de plaque de culture tissulaire, afin qu&#39;ils atteignent une densité de 80% de la plaque sur le matin de la transfection. </li><li> L&#39;addition de chloroquine améliore l&#39;efficacité de transf...

Tous les réactifs utilisés pour la transfection doit être stérilisée par filtration (CaCl 2, 2x HBS, miliQ H 2 O) et maintenu stérile.

production de réplication défectueuse rétrovirus par transfection transitoire de cellules 293t

Production of Replication-Defective Retrovirus by Transient Transfection of 293T cells

Nos études de laboratoire humaine myéloprolifératifs induite par les oncogènes tels que Bcr-Abl ou facteur de croissance dérivé des récepteurs oncogènes (ZNF198-FGFR1, Bcr-PDGFRα, etc.) Nous sommes capables de modéliser et d&#39;étudier une maladie humaine, comme dans notre modèle de souris, par la transplantation de cellules de moelle osseuse préalablement infectés par un rétrovirus exprimant l&#39;oncogène d&#39;intérêt. La réplication des rétrovirus défectifs codant pour une oncogène humain et un marqueur (GFP, RFP, gène de résistance aux antibiotiques, etc) est produit par un protocole de transfection transitoire en utilisant des cellules 293T, une lignée de cellules épithéliales rénales transformés par le produit du gène E1A d&#39;adénovirus. 293 cellules ont la propriété inhabituelle d&#39;être très transfectables par phosphate de calcium (Capo 4), avec un maximum à 50-80% d&#39;efficacité de transfection facilement réalisable. Ici, nous avons co-transfecter 293 cellules avec un vecteur rétroviral exprimant l&#39;oncogène d&#39;intérêt et un plasmide qui exprime les fonctions de conditionnement gag-pol-env, tel que le génome unique emballage construit kat ou PCL, dans ce cas le EcoPak plasmide. La transfection initiale est encore améliorée par l&#39;utilisation de la chloroquine. Les stocks de virus de écotrope, recueillis dans le surnageant de culture de 48 heures. post-transfection, peuvent être conservés à -80 ° C et utilisés pour l&#39;infection de lignées cellulaires en vue de la transformation et des études in vitro, ou des cellules primaires tels que les cellules de la moelle osseuse de souris, qui peuvent ensuite être utilisés pour une transplantation dans notre modèle de souris .

Cette technique démontre d&#39;une manière efficace de se préparer à réplication déficiente stocks rétroviraux codant pour une oncogène humain, et par la suite utilisé pour l&#39;induction de syndromes myéloprolifératifs dans le modèle murin.

Production de réplication défectueuse Rétrovirus par transfection transitoire de cellules 293T

Notre laboratoire étudie les maladies myéloprolifératives humaines induites par des oncogènes tels que Bcr-Abl ou des oncogènes dérivés de récepteurs de facteurs de croissance (ZNF198-FGFR1, ...

Nous sommes ici à l'Institut de recherche en oncologie moléculaire du centre médical Tufts New England. Je m'appelle Christina Lesco et je suis chercheuse postdoctorale dans le laboratoire du Dr. Rick Van. Notre laboratoire étudie la leucémie immunogène humaine, la LMC et les maladies de type LMC.Nous modélisons cette maladie humaine chez la souris, et la méthode que nous utilisons consiste à introduire l'oncogène humain au moyen d'un vecteur rétroviral. La première étape pour introduire cet oncogène humain dans des cellules de souris consiste donc à produire le virus lui-même. L'étape suivante consistera à concentrer effectivement le virus.Voici donc ma plaque de cellules souches 293T. Je vais devoir éliminer le milieu avec du PBS. Les cellules 293T sont des cellules adhérentes, cependant elles ne sont pas fortement adhérentes, donc chaque manipulation doit être très douce. Une fois le lavage effectué, nous allons remplacer le PBS par de la trypsine.Afin de détacher les cellules de la plaque, nous devons replacer la plaque dans l'incubateur pendant environ trois minutes. Après ces deux à trois minutes, les cellules sont effectivement en suspension. Nous allons ajouter quelques mil

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Pour faire des lentivirus, des vecteurs d'ADN sont transfectés dans les cellules humaines 293. Après la récolte et la concentration du surnageant, le titre viral est déterminé par l'expression de fluorescence avec un cytomètre en flux.

La production de lentivirus

Les lentivirus sont un précieux outil de recherche pour explorer la fonction des gènes, mais les chercheurs peuvent souhaiter éviter la production de l'encodage des lentivirus pantropique connus ou soupçonnés oncogènes. Comme alternative, nous présentons un protocole de sécurité pour l'utilisation de lentivirus écotrope sur des cellules humaines modifiées pour exprimer des récepteurs mSlc7a1 écotrope.

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Dans ce protocole, nous décrivons la production, la purification et le titrage des vecteurs lentiviraux. Nous donnons un exemple de transfert de gènes lentiviraux vecteur médiation dans neurones en culture primaire et les astrocytes. Nos méthodes peuvent également s'appliquer à d'autres types...

La production de vecteurs lentiviraux pour les cellules de transduction du Système Nerveux Central

L'interférence ARN (ARNi) possède de nombreux avantages sur inactivation du gène et a été largement utilisé comme un outil dans les études fonctionnelles de gènes. L'invention de l'ADN à base de vecteurs ARNi la technologie a fait à long terme et inactivation génique inductible possible, et a également augmenté la faisabilité de l'inactivation du...

ADN vecteur basé sur l&#39;interférence ARN pour étudier la fonction des gènes dans le cancer

Ici, nous utilisons transduction rétrovirale et transfection concatémérique pour créer une lignée cellulaire qui peut exprimer les composantes d'un vecteur lentivirus (LV) en l'absence de tétracycline. Ce LV code pour la GFP et est pseudotypé avec une glycoprotéine, SVGmu, qui est spécifique d'un récepteur sur les cellules dendritiques.

Un régulée par la tetracycline lignée cellulaire produit vecteurs lentiviraux titre élevé qui ciblent spécifiquement les cellules dendritiques

Le système / cas9 CRISPR offre la possibilité de faire éditer génome ciblé accessible et abordable pour la communauté scientifique. Ce protocole vise à démontrer comment créer des virus qui Knockout un gène d'intérêt en utilisant le système / cas9 CRISPR, puis les injecter stéréotaxique dans le cerveau de souris adulte.

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Ici, nous présentons un protocole pour la conversion directe de fibroblastes embryonnaires murins en cellules souches trophoblastiques pleinement fonctionnelles et stables par surexpression de dix jours de Tfap2c, Gata3, Eomes et Ets2.

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Ce manuscrit décrit un protocole détaillé pour la génération et la purification de vecteurs viraux adéno-associés à l’aide d’une méthode de chromatographie d’affinité optimisée basée sur l’héparine. Il s’agit d’une approche simple, évolutive et rentable, qui élimine le besoin d’ultracentrifugation. Les vecteurs résultants présentent une pureté et une activité biologique élevées, ce qui prouve leur valeur dans les études précliniques.

Isolement de vecteurs viraux adéno-associés au moyen d’un protocole de chromatographie d’affinité d’héparine en une seule étape et semi-automatisé

Découvrez la production de rétrovirus à réplication défectueuse par transfection transitoire de cellules 293T pour modéliser les maladies myéloprolifératives induites par des oncogènes humains chez la souris.

Production de réplication défectueuse Rétrovirus par transfection transitoire de cellules 293T

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