Production de réplication défectueuse Rétrovirus par transfection transitoire de cellules 293T

Nous sommes ici à l'Institut de recherche en oncologie moléculaire du centre médical Tufts New England. Je m'appelle Christina Lesco et je suis chercheuse postdoctorale dans le laboratoire du Dr. Rick Van. Notre laboratoire étudie la leucémie immunogène humaine, la LMC et les maladies de type LMC.

Nous modélisons cette maladie humaine chez la souris, et la méthode que nous utilisons consiste à introduire l'oncogène humain au moyen d'un vecteur rétroviral. La première étape pour introduire cet oncogène humain dans des cellules de souris consiste donc à produire le virus lui-même. L'étape suivante consistera à concentrer effectivement le virus.

Voici donc ma plaque de cellules souches 293T. Je vais devoir éliminer le milieu avec du PBS. Les cellules 293T sont des cellules adhérentes, cependant elles ne sont pas fortement adhérentes, donc chaque manipulation doit être très douce. Une fois le lavage effectué, nous allons remplacer le PBS par de la trypsine.

Afin de détacher les cellules de la plaque, nous devons replacer la plaque dans l'incubateur pendant environ trois minutes. Après ces deux à trois minutes, les cellules sont effectivement en suspension. Nous allons ajouter quelques millilitres supplémentaires de milieu ordinaire.

Cela va neutraliser la tripsine. À ce stade, nous effectuons des pipetages répétés afin de bien maintenir toutes les cellules en suspension, puis nous transférons la suspension dans un tube de 50 ml pour compter les cellules en présence de bleu de trypan, en utilisant un hémocytomètre pour effectuer le dénombrement manuellement. Je réalise donc maintenant ma dilution selon le calcul, puis je vais ensemencer trois fois dix puissance six cellules par plaque.

Dans 4 ml de milieu, nous nous assurons que les cellules sont bien ensemencées, puis nous remettrons les plaques dans l'incubateur pendant 16 à 18 heures, généralement jusqu'au lendemain matin. Nous sommes donc maintenant à 48 heures post-infection par le virus GFP. La chloroquine est utilisée afin d'augmenter l'incorporation de l'ADN que nous allons ajouter sur les cellules.

Nous avons doucement aspiré le milieu des cellules, qui se sont maintenant fixées délicatement aux plaques sur le côté de la plaque. À ce stade, nous allons replacer les plaques dans les incubateurs pendant environ une heure. Pendant ce temps, nous allons préparer notre mélange d'ADN à appliquer sur les cellules : un premier fragment exprimant un gène de résistance à la néomycine et un autre exprimant effectivement la GFPI, en utilisant de l'ADN XI afin de contrôler toute la transfection.

Enfin, nous ajoutons du chlorure de calcium. L'utilisation de chlorure de calcium augmente considérablement l'efficacité de la transfection. Nous sommes maintenant une heure plus tard. Nous avons récupéré les plaques avec le milieu contenant la chloroquine et nous allons y ajouter notre solution de transfection.

La dernière étape que nous devons effectuer consiste à ajouter effectivement un ml de HBS stérile 2 x tout en ajoutant la solution H2XHBS. Nous devons agiter le tube au vortex en même temps et procéder lentement, goutte à goutte. Cela permet d'éviter les précipitations ; répartissez immédiatement un ml de solution dans la plaque d'intérêt, et nous effectuons à nouveau cette opération goutte à goutte.

À ce stade, les cellules 293T sont très sensibilisées en raison du milieu contenant de la chloroquine. Il est nécessaire de maintenir toute la zone couverte et de déplacer les plaques le moins possible. Étiquetez la plaque avec le construct que vous avez ajouté et répétez l'opération pour le construct suivant.

À ce stade, remettez les plaques dans l'incubateur pendant sept à onze heures. Au moins sept heures, mais pas plus de onze, car les cellules sont très sensibilisées en raison de la chloroquine, et nous devrons changer le milieu après ce délai. Nous sommes désormais à environ 30 heures après la transfection.

Il s'agit de notre dernier changement de milieu à ce stade, les cellules 2 9 3 C3 T ayant atteint la confluence. Nous devons, encore une fois, être très délicats lors de l'ajout du nouveau milieu sur le côté de la plaque. J'utilise une seringue de 10 ml munie d'une aiguille.

Je vais remplacer l'aiguille par un filtre, donc je mélange bien le milieu. À ce stade, nous avons collecté notre virus et nous pouvons le placer à moins 80 degrés jusqu'à son utilisation. La première chose à faire est en réalité de concentrer le virus. Il existe plusieurs étapes sensibles lors de la production de virus, et la première consiste à avoir la bonne concentration de cellules 293T.

Nous les mettons en culture à raison de trois fois dix puissance six cellules par plaque, car après 18 heures, elles seront environ à 80 % de confluence. Cela leur laisse encore du temps pour continuer à croître, de sorte qu'après 24 heures suivant la transfection, elles atteindront 100 % de confluence. Il a été démontré que cela est très important pour obtenir un titre viral excellent.

L'étape suivante consiste à utiliser de la chloroquine, qui sensibilise en réalité les cellules 2 9 3, et tous les changements de milieu doivent être effectués très délicatement afin que la couche complète de cellules 2 9 3 T ne se détache pas de la plaque. Enfin, l'ADN utilisé pour produire le virus doit être extrêmement pur. Nous utilisons de l'ADN C banded.

Une fois que nous avons notre virus, nous le conservons à moins 80 degrés. Nous effectuons généralement une seule amplification par chaque passage, ce qui réduit la concentration du virus de moitié. Par conséquent, nous préférons congeler le virus que nous avons produit avant de procéder à la détermination réelle de la concentration virale.

En fonction des virus, nous pouvons avoir soit une expression de GFP avec le virus afin de suivre les cellules réellement infectées, soit une résistance à la néomycine. Il est très important de disposer de la titration du virus avant de l'utiliser, afin de pouvoir assurer la comparabilité entre les expériences ou entre différents mutants.