Name: Une méthode efficace pour lisolement de lARN hautement purifiées de semences pour une utilisation dans quantitative transcriptome Analyse (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 31 s
Description: Apprenez une méthode d'extraction d'ARN hautement purifié à partir de semences végétales riches en huiles et polyphénols. Cette technique améliorée facilite l'analyse de l'expression génique en biologie moléculaire végétale.

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Nous remercions le personnel de Génomique Fonctionnelle Facility et spectrographie et Bioimaging Facility, Nibb de base des installations de recherche, et des installations Model Plant Research, Nibb bioressources Center.

1. Extraction de l&#39;ARN total à partir de graines végétales <ol><li> Préparer des ensembles de tampons, des colonnes de spin, 1,5 et 2,0 ml tubes en polypropylène, et des tubes de 1,5 mL polypropylène sans nucléase. </li><li> Ajouter 1% (p / v) de polyvinylpyrrolidone de grade biologie moléculaire (appelé ci-après PVP) à la cellule tampon de lyse pour extraction d&#39;ARN et vortexer vigoureusement. Incuber pendant 20 min à 25 ° C pour dissoudre complètement. Au bout de 20 minutes d&#39;incubation, mélanger doucement le tampon en faisant tourner le tube à l&#39;envers pour empêcher la formation de bulles. Stocker à température ambiante (15-25 ° C) avant utilisation. </li><li> Fruits de récolte de plantes d&#39; Arabidopsis thaliana et les placer dans 1,5 ml polypropylène tubes sur la glace. Placer les fruits sur des plaques d&#39;aluminium maintenues à 4 ° C et à isoler les graines des fruits sous un microscope stéréo. <ol><li> Placez les graines isolées (environ 200 graines) dans 1,5 ml des tubes en polypropylène qui ont été stockés dans un rack d&#39;aluminium sur la glace et placer les tubes dans un liquide n immédiatementitrogen. </li></ol></li><li> Retirer les tubes de l&#39;azote liquide et les retourner à la grille d&#39;aluminium sur la glace. Ajouter 100 pi de tampon contenant 1% de PVP et centrifuger pendant 1 min à 1000 x g à 4 ° C. </li><li> Homogénéiser l&#39;échantillon avec un pilon en acier inoxydable en utilisant un moteur broyeur pendant 60 secondes tout en maintenant le tube dans la grille en aluminium sur la glace. </li><li> Ajouter 550 pi de tampon contenant 1% de PVP, mélanger le tampon doucement en tournant le tube à l&#39;envers, et incuber pendant 10 min à 25 ° C. </li><li> Centrifuger pendant 5 min à 8000 x g à 25 ° C et de transfert 550 ul du surnageant dans un nouveau tube de polypropylene de 1,5 ml. </li><li> Centrifuger pendant 5 min à 10 000 g à 25 ° C et de transfert 450 ul du surnageant dans un nouveau tube de polypropylene de 1,5 ml. </li><li> En utilisant le surnageant comme le lysat cellulaire pour l&#39;extraction d&#39;ARN. Ci-après, suivre la procédure décrite dans les instructions du fabricant dans le kit disponible dans le commerce. </li><li> éluerL&#39;ARN en utilisant un volume minimal de tampon d&#39;élution afin d&#39;assurer une concentration suffisamment élevée de l&#39;ARN pour surveiller les profils d&#39;expression des transcrits de bas niveau. Stocker l&#39;ARN dans un congélateur jusqu&#39;à utilisation. </li></ol> 2. Vérification de l&#39;ARN Qualité <ol><li> Décongeler l&#39;ARN total, mélanger en tapotant doucement et placer le tube dans un rack en aluminium sur la glace. </li><li> Mesurer la concentration d&#39;ARN, le rapport A260 / A280 et le rapport A260 / A230 en utilisant un spectrophotomètre microvolume. </li><li> Diluer l&#39;ARN total dans l&#39;eau sans RNase à une concentration finale de 70 ng / ul. </li></ol> 3. Transcription inverse de l&#39;ARN total à partir de graines <ol><li> Décongeler les ARN et tampons totaux ensembles à partir du kit commercial. Gardez les enzymes du kit sur la glace après tapotant doucement. Préparer des tubes de 0,2 mL polypropylène sans nucléase. </li><li> Ajouter 5 ul de l&#39;ARN total, 1 pl de Oligo dT (50 uM), et 1 uM de Random 6-mer (50 uM) à la mL polypropy 0,2tube lene sur la glace. </li><li> Incuber pendant 15 min à 37 ° C et placer sur la glace. </li><li> Ci-après, suivre la procédure décrite dans les instructions du fabricant dans le kit de transcription PCR inverse. </li><li> Placer les produits de transcription inverse sur la glace avant utilisation. </li></ol> 4. Analyse quantitative PCR en temps réel <ol><li> Construire des plasmides hébergeant les séquences du gène cible en utilisant le protocole du fabricant. </li><li> Ajustez les concentrations de 100-500,000 copies / ul pour les modèles d&#39;ADN pour les courbes standard. </li><li> La dilution des solutions d&#39;ADNc (1: 100) avec de l&#39;eau distillée. </li><li> Ajouter 2 ul des solutions d&#39;ADNc dilué et les plasmides pour les courbes standard au mélange maître de la trousse quantitative PCR en temps réel. </li><li> Mettre en place la PCR en temps réel en utilisant les conditions suivantes à vélo: 95 ° C pendant 30 s, puis 40 cycles à 95 ° C pendant 5 s et 60 ° C pendant 35 s. </li><li> Analyser les nombres de copies selon l&#39;hommeles instructions données par le fabricant du système de PCR en temps réel. </li></ol>

<ol><li>Hills, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+storage-product+synthesis+in+seeds%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Control of storage-product synthesis in seeds.</a> Curr Opin Plant Biol. 7 (3), 302-308 (2004).</li>
<li>Li-Beisson, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acyl-lipid+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Arabidopsis+Book%22%5BJournal%5D)">Acyl-lipid metabolism.</a> Arabidopsis Book. 11, e0161(2013).</li>
<li>Bates, P. D., Stymne, S., Ohlrogge, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+pathways+in+seed+oil+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Biochemical pathways in seed oil synthesis.</a> Curr Opin Plant Biol. 16 (3), 358-364 (2013).</li>
<li>Santos-Mendoza, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deciphering+gene+regulatory+networks+that+control+seed+development+and+maturation+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Deciphering gene regulatory networks that control seed development and maturation in Arabidopsis.</a> Plant J. 54 (4), 608-620 (2008).</li>
<li>Durrett, T. P., Benning, C., Ohlrogge, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+triacylglycerols+as+feedstocks+for+the+production+of+biofuels%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Plant triacylglycerols as feedstocks for the production of biofuels.</a> Plant J. 54 (4), 593-607 (2008).</li>
<li>Kanai, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Plastidic+DEAD-box+RNA+helicase+22%2C+HS3%2C+is+essential+for+plastid+functions+both+in+seed+development+and+in+seedling+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">The Plastidic DEAD-box RNA helicase 22, HS3, is essential for plastid functions both in seed development and in seedling growth.</a> Plant Cell Physiol. 54 (9), 1431-1440 (2013).</li>
<li>Kanai, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extension+of+oil+biosynthesis+during+the+mid-phase+of+seed+development+enhances+oil+content+in+Arabidopsis+seeds%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Biotechnol+J%22%5BJournal%5D)">Extension of oil biosynthesis during the mid-phase of seed development enhances oil content in Arabidopsis seeds.</a> Plant Biotechnol J. 14 (5), 1241-1250 (2016).</li>
<li>Dekkers, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+reference+genes+for+RT-qPCR+expression+analysis+in+Arabidopsis+and+tomato+seeds%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Identification of reference genes for RT-qPCR expression analysis in Arabidopsis and tomato seeds.</a> Plant Cell Physiol. 53 (1), 28-37 (2012).</li>
<li>Salzman, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+RNA+isolation+method+for+plant+tissues+containing+high+levels+of+phenolic+compounds+or+carbohydrates%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Mol+Biol+Rep%22%5BJournal%5D)">An improved RNA isolation method for plant tissues containing high levels of phenolic compounds or carbohydrates.</a> Plant Mol Biol Rep. 17 (1), 11-17 (1999).</li>
<li>Vicient, C. M., Delseny, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+total+RNA+from+Arabidopsis+thaliana+seeds%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Isolation of total RNA from Arabidopsis thaliana seeds.</a> Anal Biochem. 268 (2), 412-413 (1999).</li>
<li>Wang, G. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+high+quality+RNA+from+cereal+seeds+containing+high+levels+of+starch%5BTitle%5D)+AND+%22Phytochem+Analysis%22%5BJournal%5D)">Isolation of high quality RNA from cereal seeds containing high levels of starch.</a> Phytochem Analysis. 23 (2), 159-163 (2012).</li>
<li>Birtic, S., Kranner, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+high-quality+RNA+from+polyphenol-%2C+polysaccharide-+and+lipid-rich+seeds%5BTitle%5D)+AND+%22Phytochem+Analysis%22%5BJournal%5D)">Isolation of high-quality RNA from polyphenol-, polysaccharide- and lipid-rich seeds.</a> Phytochem Analysis. 17 (3), 144-148 (2006).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

les profils d&#39;expression des gènes contribuent à notre compréhension de la physiologie des plantes; Par conséquent, les méthodes d&#39;isolement d&#39;ARN spécifiques ont été développés pour chaque condition échantillon 9-12. Nous avons étudié les processus qui ont été inhibée lors de l&#39;isolement de l&#39;ARN à partir de graines et ont trouvé que la liaison ARN aux membranes de silice a été sévèrement inhibée. De grandes quantités d&#39;huile, les protéines et les polyphénols inhibent l&#39;isolement ...

Les plantes produisent des graines, qui donnent naissance à la prochaine génération. Graines accumulent de grandes quantités de réserves de stockage, tels que des huiles, des glucides et des protéines, pour la croissance post-germinative. Les humains utilisent les semences des réserves de stockage en tant que sources d&#39;alimentation humaine et animale, et donc des graines de plantes sont l&#39;un des principaux fournisseurs de la matière organique comestible dans le monde entier. L&#39;augmentation des rendements de semences est un défi important dans la science des plantes. Puisque les réserves de stockage des semences sont des sources de valeur commerciale de nourriture et de matériaux industriels, les mécanismes moléculaires sous - jacents de la régulation du métabolisme de ces réserves ont été largement étudiés 1-6. élucidant En outre, ces mécanismes seront utiles pour augmenter les rendements de semences dans les cultures. Les graines se développent dans les ovaires de la plante après la fécondation, et ils mûrissent à travers une série de stades de développement 1,6,7. comprendre en outre le développement de mécanisme moléculaire sous-jacent de semences nécessite détaillée, Les profils d&#39;expression génique précises d&#39;une série de graines en développement à produire. Toutefois, les grandes quantités d&#39;huiles, des protéines, des glucides et des polyphénols dans les graines de la plante, il est difficile d&#39;isoler l&#39;ARN hautement purifié, ce qui empêche le profilage précis de l&#39;expression génique. Ici, nous présentons un procédé efficace pour l&#39;isolement d&#39;ARN à partir de graines oléagineuses contenant de grandes quantités d&#39;huiles, de protéines et de polyphénols. En utilisant cette méthode, les chercheurs seront en mesure de préparer l&#39;ARN hautement purifié. Un tel ARN sera utile pour le suivi des changements de transcription dans les gènes clés qui contrôlent la régulation métabolique des réserves de stockage des semences dans le développement et les oléagineux matures.

<table><tbody><tr><td>RNeasy Plant Mini Kit</td><td>QIAGEN</td><td>74904</td><td></td></tr><tr><td>polyvinylpyrrolidone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5288-100G</td><td></td></tr><tr><td>HOMOGÉNÉISATEUR S-303</td><td>AS ONE</td><td>1-1133-02</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop Lite</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-NDL-US-CAN</td><td></td></tr><tr><td>PrimeScript RT reagent kit (Perfect Real Time)</td><td>TAKARA</td><td>RR037A</td><td></td></tr><tr><td>KAPA SYBR Kit qPCR rapide</td><td>Kapa biosystems</td><td>KK4601</td><td></td></tr></tbody></table>

une méthode efficace pour l&#39;isolement de l&#39;arn hautement purifiées de semences pour une utilisation dans quantitative transcriptome analyse

An Efficient Method for the Isolation of Highly Purified RNA from Seeds for Use in Quantitative Transcriptome Analysis

Les graines de plantes accumulent de grandes quantités de réserves de stockage composées de matière organique biodégradable. Les humains dépendent des réserves de stockage de graines pour se nourrir et comme matériaux industriels. Les profils d’expression génique sont des outils puissants pour étudier la régulation métabolique dans les cellules végétales. Par conséquent, des profils d’expression génique détaillés et précis pendant le développement des semences sont nécessaires pour la sélection des cultures. L’acquisition d’ARN hautement purifié est essentielle à la production de ces profils. Des méthodes efficaces sont nécessaires pour isoler l’ARN hautement purifié des graines. Ici, nous décrivons une méthode pour isoler l’ARN de graines contenant de grandes quantités d’huiles, de protéines et de polyphénols, qui ont des effets inhibiteurs sur l’isolement d’ARN de haute pureté. Notre méthode permet d’obtenir de l’ARN hautement purifié à partir de graines sans utiliser de phénol, de chloroforme ou de procédés supplémentaires pour la purification de l’ARN. Cette méthode est applicable aux graines d’Arabidopsis, de colza et de soja. Notre méthode sera utile pour suivre les profils d’expression des transcrits de faible niveau dans les graines en développement et matures.

Nous avons d&#39; abord étudié la concentration optimale de PVP à l&#39; aide de graines matures Arabidopsis. L&#39;ARN total a été isolé à partir d&#39;environ 1000 graines selon le protocole décrit ci-dessus en utilisant un tampon de lyse cellulaire contenant 0%, 0,25%, 0,5%, 1,0% ou 2,0% de PVP. Après homogénéisation et centrifugation, le surnageant a été recueilli , tout en évitant la couche d&#39;huile et des débris de graines (figure 1A). <p class="jov...

Nous avons réussi à établir une méthode d’isolement de l’ARN à partir de graines de plantes contenant de grandes quantités d’huiles, de protéines et de polyphénols, qui ont des effets inhibiteurs sur l’isolement d’ARN de haute pureté. Notre méthode est adaptée au suivi de l’expression de gènes avec des transcrits de faible niveau dans les graines.

Une méthode efficace pour l&#39;isolement de l&#39;ARN hautement purifiées de semences pour une utilisation dans quantitative transcriptome Analyse

Plant seeds accumulate large amounts of storage reserves comprising biodegradable organic matter. Humans rely on seed storage reserves for food and as ...

L’objectif global de cette procédure est d’extraire de l’ARN de haute pureté à partir de graines de plantes. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie des céréales, telles que la compréhension des profils génétiques, contenant les transcrits originaux dans les graines. Le principal avantage de cette technique est que les chercheurs sont en mesure de préparer de l’ARN hautement purifié avec une légère modification de la méthode basée sur la colonne de spin.En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode auront du mal car la grande quantité d’huiles, de protéines, de glucides et de polyphénols dans le tamis avant rend difficile l’isolement de l’ARN hautement purifié ; Kazumi Hikino, un technicien de notre laboratoire, fera la démonstration de la procédure. Pour commencer l’expérience, ajoutez un pour cent de poids par volume de PVP de biologie moléculaire au tampon de lyse cellulaire pour l’extraction de l’ARN, et agitez vigoureusement le mélange. Incuber le PVP pendant 20 minutes à 25 degrés Celsius pour le dissoudre complètement.Après 20 minutes d’incubation, mélangez doucement le tampon en retournant le tube pour éviter la formation de bulles. Récoltez les fruits des plantes d’Arabidopsis thaliana et placez-les dans deux tubes en polypropylène de 1,5 millimètre sur de la glace, puis placez les fruits sur des plaques d’aluminium maintenues à quatre degrés Celsius et isolez les graines des fruits au microscope stéréoscopique. Ensuite, placez environ 200 graines isolées dans des tubes en polypropylène de 1,5 millilitre qui ont été préalablement stockés dans une grille en aluminium sur de la glace, et placez immédiatement les tubes dans de l’azote liquide.Retirez les tubes de l’azote liquide et remettez-les dans la grille en aluminium sur de la glace. Ajoutez 100 microlitres de tampon PVP à un pour cent dans chaque tube et centrifugez les tubes pendant une minute à 1000 fois G, à quatre degrés Celsius. Après centrifugation, homogénéiser l’échantillon à l’aide d’un pilon en acier inoxydable à l’aide d’un broyeur à moteur pendant 60 secondes tout en maintenant le tube dans la grille en aluminium sur de la glace ; Ensuite, ajoutez 550 microlitres de tampon 100 % PVP et retournez doucement le tube pour mélanger et incuber le tube.Après l’incubation, centrifugez la solution, puis transférez 550 microlitres de surnageant dans un nouveau tube en polypropylène de 1,5 millimètre et centrifugez le surnageant. Transférez 450 microlitres de surnageant dans un nouveau tube en polypropylène de 1,5 millimètre. Utilisez le surnageant comme lysat cellulaire pour l’extraction de l’ARN à l’aide d’un kit disponible dans le commerce.Préparez une grille en aluminium sur de la glace et décongelez le mélange total d’ARN en tapotant doucement, puis placez le tube sur la grille. Mesurez la concentration d’ARN à l’aide d’un spectrophotomètre à microvolume. Diluez ensuite l’ARN total dans de l’eau sans RNase.Décongelez l’ARN total et les ensembles de tampons du kit commercial, conservez les enzymes du kit sur de la glace après un léger tapotement. Préparez des tubes en polypropylène stérilisés sans nucléases de 0,2 millilitre pour une analyse ultérieure. Sur glace, combinez cinq microlitres d’ARN total, un microlitre ou 50 micromolaires d’amorce oligo DT et un microlitre, ou 50 micromolaires aléatoires de six mères dans le tube de polypropylène de 0,2 millilitre.Incuber le mélange pendant 15 minutes à 37 degrés Celsius, puis placer le tube sur de la glace. Ajustez les concentrations plasmidiques des matrices d’ADN pour les courbes standard. Ensuite, diluez les solutions d’ADNC à une température de un à 100 avec de l’eau distillée, puis ajoutez deux microlitres de solutions d’ADNC diluées et les plasmides préalablement préparés pour les courbes standard au mélange maître du kit de PCR quantitative en temps réel.Enfin, configurez la PCR en temps réel et insérez les échantillons. L’ARN total a été isolé à partir d’environ 1 000 graines à l’aide de concentrations variables de tampon de lyse cellulaire, PVP. Les quantités et la pureté des ARN isolés démontrent que 1,0 % de PVP est la concentration la plus efficace pour isoler de grandes quantités d’ARN purifié à partir de graines.Les concentrations, les rapports A260 et A280 et les rapports A260 A230 d’ARN isolé à partir de 200 graines ont montré que cette méthode était la meilleure pour isoler l’ARN hautement purifié de huit et 12 jours après la floraison, ou les graines DAF. Bien que les quantités de transcrits ridés et dépendants du sucre soient relativement faibles dans les graines en développement, il a été possible de détecter des changements d’expression entre les graines à différents stades de développement par PCR en temps réel ; Cette méthode convient également à d’autres graines oléagineuses, comme le montre ce tableau. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la biologie végétale pour explorer les profils d’expression génique à haute concentration de réserves stockées, telles que les graines et les fruits.

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