Une méthode efficace pour l'isolement de l'ARN hautement purifiées de semences pour une utilisation dans quantitative transcriptome Analyse

L’objectif global de cette procédure est d’extraire de l’ARN de haute pureté à partir de graines de plantes. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie des céréales, telles que la compréhension des profils génétiques, contenant les transcrits originaux dans les graines. Le principal avantage de cette technique est que les chercheurs sont en mesure de préparer de l’ARN hautement purifié avec une légère modification de la méthode basée sur la colonne de spin.

En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode auront du mal car la grande quantité d’huiles, de protéines, de glucides et de polyphénols dans le tamis avant rend difficile l’isolement de l’ARN hautement purifié ; Kazumi Hikino, un technicien de notre laboratoire, fera la démonstration de la procédure. Pour commencer l’expérience, ajoutez un pour cent de poids par volume de PVP de biologie moléculaire au tampon de lyse cellulaire pour l’extraction de l’ARN, et agitez vigoureusement le mélange. Incuber le PVP pendant 20 minutes à 25 degrés Celsius pour le dissoudre complètement.

Après 20 minutes d’incubation, mélangez doucement le tampon en retournant le tube pour éviter la formation de bulles. Récoltez les fruits des plantes d’Arabidopsis thaliana et placez-les dans deux tubes en polypropylène de 1,5 millimètre sur de la glace, puis placez les fruits sur des plaques d’aluminium maintenues à quatre degrés Celsius et isolez les graines des fruits au microscope stéréoscopique. Ensuite, placez environ 200 graines isolées dans des tubes en polypropylène de 1,5 millilitre qui ont été préalablement stockés dans une grille en aluminium sur de la glace, et placez immédiatement les tubes dans de l’azote liquide.

Retirez les tubes de l’azote liquide et remettez-les dans la grille en aluminium sur de la glace. Ajoutez 100 microlitres de tampon PVP à un pour cent dans chaque tube et centrifugez les tubes pendant une minute à 1000 fois G, à quatre degrés Celsius. Après centrifugation, homogénéiser l’échantillon à l’aide d’un pilon en acier inoxydable à l’aide d’un broyeur à moteur pendant 60 secondes tout en maintenant le tube dans la grille en aluminium sur de la glace ; Ensuite, ajoutez 550 microlitres de tampon 100 % PVP et retournez doucement le tube pour mélanger et incuber le tube.

Après l’incubation, centrifugez la solution, puis transférez 550 microlitres de surnageant dans un nouveau tube en polypropylène de 1,5 millimètre et centrifugez le surnageant. Transférez 450 microlitres de surnageant dans un nouveau tube en polypropylène de 1,5 millimètre. Utilisez le surnageant comme lysat cellulaire pour l’extraction de l’ARN à l’aide d’un kit disponible dans le commerce.

Préparez une grille en aluminium sur de la glace et décongelez le mélange total d’ARN en tapotant doucement, puis placez le tube sur la grille. Mesurez la concentration d’ARN à l’aide d’un spectrophotomètre à microvolume. Diluez ensuite l’ARN total dans de l’eau sans RNase.

Décongelez l’ARN total et les ensembles de tampons du kit commercial, conservez les enzymes du kit sur de la glace après un léger tapotement. Préparez des tubes en polypropylène stérilisés sans nucléases de 0,2 millilitre pour une analyse ultérieure. Sur glace, combinez cinq microlitres d’ARN total, un microlitre ou 50 micromolaires d’amorce oligo DT et un microlitre, ou 50 micromolaires aléatoires de six mères dans le tube de polypropylène de 0,2 millilitre.

Incuber le mélange pendant 15 minutes à 37 degrés Celsius, puis placer le tube sur de la glace. Ajustez les concentrations plasmidiques des matrices d’ADN pour les courbes standard. Ensuite, diluez les solutions d’ADNC à une température de un à 100 avec de l’eau distillée, puis ajoutez deux microlitres de solutions d’ADNC diluées et les plasmides préalablement préparés pour les courbes standard au mélange maître du kit de PCR quantitative en temps réel.

Enfin, configurez la PCR en temps réel et insérez les échantillons. L’ARN total a été isolé à partir d’environ 1 000 graines à l’aide de concentrations variables de tampon de lyse cellulaire, PVP. Les quantités et la pureté des ARN isolés démontrent que 1,0 % de PVP est la concentration la plus efficace pour isoler de grandes quantités d’ARN purifié à partir de graines.

Les concentrations, les rapports A260 et A280 et les rapports A260 A230 d’ARN isolé à partir de 200 graines ont montré que cette méthode était la meilleure pour isoler l’ARN hautement purifié de huit et 12 jours après la floraison, ou les graines DAF. Bien que les quantités de transcrits ridés et dépendants du sucre soient relativement faibles dans les graines en développement, il a été possible de détecter des changements d’expression entre les graines à différents stades de développement par PCR en temps réel ; Cette méthode convient également à d’autres graines oléagineuses, comme le montre ce tableau. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la biologie végétale pour explorer les profils d’expression génique à haute concentration de réserves stockées, telles que les graines et les fruits.