Une méthode pour mesurer le métabolisme dans des communautés triées sous-populations cellulaires complexes Utilisation Stable Isotope Tracing
4 février 2017
Cet article décrit une méthode d’étude du métabolisme cellulaire dans des communautés complexes de plusieurs types de cellules, en utilisant une combinaison de traçage d’isotopes stables, de tri cellulaire pour isoler des types de cellules spécifiques et de spectrométrie de masse.
L’objectif global de cette méthode est d’utiliser le traçage isotopique pour mesurer le métabolisme de populations triées de communautés cellulaires complexes. Ainsi, avec cette méthode, nous pouvons étudier les différences métaboliques entre les sous-populations de communautés cellulaires complexes, ainsi que la collaboration métabolique entre ces sous-populations. Le principal avantage de cette technique est qu’en combinant le traçage isotopique avec le tri cellulaire, nous pouvons obtenir une mesure plus fiable du métabolisme, et nous pouvons également valider la fiabilité de la méthode.
La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car elle combine différentes techniques, et la façon dont les cellules sont manipulées et la durée de la procédure peuvent affecter le métabolisme cellulaire. Pour l’extraction de métabolites à partir d’une boîte, cultivez d’abord des cellules dans une plaque à six puits dans un milieu de culture marqué à isotope stable contenant des suppléments dialysés. Lorsque les cellules atteignent 75 % de confluence, rincez les puits deux fois avec 500 microlitres de HBSS froid contenant du glucose uniformément marqué.
Ajoutez ensuite 600 microlitres de méthanol prérefroidi à 100 % de glace sèche dans chaque puits et transférez la plaque sur la glace sèche. À l’aide d’un grattoir cellulaire, détachez les cellules, puis transférez soigneusement les extraits de chaque puits dans des tubes de microcentrifugation individuels. Stocker les cellules à moins 80 degrés Celsius jusqu’à l’analyse par spectrométrie de masse.
Pour l’extraction des métabolites des cellules triées, cultivez les cellules dans une boîte de 100 millimètres dans un milieu de culture étiqueté avec des suppléments dialysés, de sorte qu’elles atteignent 75 % de confluence le jour du tri. Pour le marquage par impulsion des cellules triées par cycle cellulaire, cultivez les cellules dans un milieu non marqué contenant des suppléments dialysés jusqu’à ce qu’elles atteignent 75 % de confluence. Ensuite, étiquetez les cellules par impulsion pendant deux heures en remplaçant le milieu par un milieu de culture fraîchement étiqueté.
Rincez le plat avec du HBSS chaud contenant du glucose uniformément étiqueté et détachez les cellules avec 1,5 millilitre de trypsine EDTA à 37 degrés Celsius. Après quatre minutes, désactivez la trypsine avec trois millilitres de HBSS glacé contenant du glucose marqué et des suppléments dialysés, et transférez les cellules dans un tube conique de 15 millilitres pour la centrifugation. Remettez en suspension la pastille dans un HBSS contenant du glucose marqué, des suppléments dialysés et de l’EDTA à une concentration de 1 à deux fois 10 à six cellules par millilitre, et filtrez les cellules à travers une passoire de 40 microns pour obtenir une suspension à cellule unique.
Transférez les cellules dans un tube de cinq millilitres et triez-les sur un cytomètre en flux. Pour l’extraction des métabolites à partir de cellules triées fictives, sortez les débris et ne triez que les singulets. Pour l’extraction des métabolites à partir de cellules triées par cycle cellulaire, sortez les débris et les doublets, et triez les cellules en G1 et SG2M, en fonction de la fluorescence de la sonde de géminine.
A la fin du tri, récupérez les cellules par centrifugation et remettez en suspension la pastille dans 50 microlitres d’eau distillée glacée pour obtenir une pastille homogène. Ensuite, extrayez rapidement les métabolites en ajoutant 540 microlitres de méthanol refroidi à la glace sèche. Conservez l’échantillon à moins 80 degrés Celsius jusqu’à l’analyse LCMS.
L’extraction des métabolites à partir de cellules triées doit être bien planifiée à l’avance, les travaux expérimentaux étant terminés le plus rapidement possible afin de minimiser les altérations métaboliques. Pour l’analyse des métabolites extraits, il faut d’abord sélectionner un certain nombre de métabolites avec des étalons disponibles correspondants qui présentent des pics d’échantillon de bonne qualité. Ensuite, vérifiez la qualité des pics en prenant soin de ne pas inclure de faux isotopes.
Calculez l’isotope de masse à partir de nos fractions pour les échantillons marqués d’isotopes en divisant la surface des pics de chaque isotope de masse de notre fraction par les surfaces totales des pics de tous les isotopes de masse de nos fractions. Ensuite, calculez les fractions de carbone étiquetées pour l’enrichissement en carbone 13 à l’aide de la formule d’enrichissement en carbone. Enfin, calculez les fractions d’azote marquées pour l’enrichissement en azote 15 à l’aide de la formule d’enrichissement en azote.
Dans cette expérience représentative, 66 métabolites sélectionnés à partir de l’analyse des données étaient présents dans les cellules triées fictives, dont 60 semblaient être marqués avec un isotope de masse similaire à partir de nos distributions entre les extraits de boîte et les cellules triées simulées. Par exemple, l’isotope de masse de notre distribution de glutamate est similaire entre la boîte et les extraits triés fictifs, ce qui indique que l’isotope de masse de glutamate de notre distribution est également fiable dans les populations de cellules triées. L’analyse des cellules HELA classées en stades du cycle cellulaire G0, G1 ou SG2M à l’aide de la sonde géminine FUCCI révèle un marquage de la cytidine dans les deux populations avec un enrichissement plus élevé au stade SG2M, compatible avec une synthèse de novo accrue des nucléotides pendant la phase S.
Dans cette expérience, l’isotope de masse de notre distribution a présenté le même schéma dans les deux fractions triées du cycle cellulaire, ce qui suggère que la même voie de synthèse est utilisée, mais qu’elle est plus active au stade SG2M, démontrant que les différences métaboliques sont facilement détectables par cette méthode, même entre des sous-populations étroitement liées. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’extraire les métabolites des fractions triées et comprendre les mises en garde. Lors de cette procédure, il est important de se rappeler de manipuler rapidement les cellules lors du tri et de l’extraction des métabolites, car la manière et la durée de manipulation des cellules peuvent affecter leur métabolisme.
Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en cinq heures. Cette procédure peut être appliquée à d’autres types de cellules. Par exemple, des sous-ensembles de cellules immunitaires dans le sang, ou différents types de cellules au sein d’une tumeur, en utilisant une variété de sondes, d’anticorps ou de méthodes de coloration pour le tri.
Consultez la transcription complète et accédez à des milliers de vidéos scientifiques
Aperçu
Cet article décrit une méthode pour étudier le métabolisme cellulaire dans des communautés complexes de plusieurs types de cellules. La technique combine le traçage d'isotopes stables, le tri cellulaire et la spectrométrie de masse pour analyser les différences métaboliques et les collaborations entre les sous-populations.
Composants clés de l'étude
Domaine de la science
- Métabolisme cellulaire
- Traçage d'isotopes
- Spectrométrie de masse
Contexte
- Comprendre le métabolisme dans les communautés cellulaires complexes est crucial pour diverses études biologiques.
- Le traçage d'isotopes permet une analyse détaillée des voies métaboliques.
- Le tri cellulaire aide à isoler des types de cellules spécifiques pour des mesures plus précises.
- La spectrométrie de masse fournit une détection sensible des métabolites.
Objectif de l'étude
- Mesurer le métabolisme des populations triées au sein de communautés cellulaires complexes.
- Investiguer les différences métaboliques entre les sous-populations.
- Explorer les collaborations métaboliques entre différents types de cellules.
Méthodes utilisées
- Cultiver des cellules dans un milieu marqué par des isotopes stables.
- Trier des types de cellules spécifiques en utilisant des techniques de tri cellulaire.
- Utiliser la spectrométrie de masse pour l'analyse des métabolites.
- Valider la fiabilité de la méthode par des démonstrations visuelles.
Résultats principaux
- Meilleure compréhension des différences métaboliques dans les sous-populations cellulaires.
- Collaboration démontrée dans le métabolisme entre différents types de cellules.
- Validation de la fiabilité de la méthode combinée.
- Fourniture d'un cadre visuel pour la procédure et son impact sur le métabolisme cellulaire.
Conclusions
- La méthode offre une approche robuste pour étudier le métabolisme cellulaire.
- La combinaison du traçage d'isotopes avec le tri cellulaire fournit des données métaboliques fiables.
- Cette technique peut être appliquée à divers domaines de recherche impliquant des interactions cellulaires complexes.
Questions fréquemment posées
Executive Industry Relevance
This method addresses a key challenge in discovery biology: obtaining reliable metabolic measurements from heterogeneous cell populations without introducing sorting-induced artifacts. By leveraging stable isotope tracing and mass isotopomer distributions (MIDs), it enables de-risking of target validation through more confident assessment of subpopulation-specific pathway activity. The approach supports predictive confidence in early discovery by distinguishing true metabolic differences from procedural noise, informing go/no-go decisions in portfolio triage.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by revealing metabolic differences between subpopulations, such as elevated nucleotide synthesis in SG2M versus G1 phases.
- Operational Value: Provides a validation step using mock-sorted controls to confirm that MIDs remain unaltered by sorting stress, ensuring data integrity before downstream analysis.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking by confirming pathway consistency (e.g., nucleotide synthesis) while quantifying activity differences across closely related states.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates quantitative, reproducible MID readouts from sorted fractions that are amenable to high-resolution mass spectrometry and scalable across sample sets.
- Screening Readiness: Prepares validated biological systems for compound evaluation by establishing baseline metabolic profiles in defined subpopulations.
- Platform Reuse: The workflow—combining isotope labeling, sorting, and LC-HRMS—can be adapted to immune subsets or tumor microenvironments using alternative probes or staining methods.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery-phase metabolic profiling to preclinical validation by enabling consistent measurement of pathway activity in sorted populations across experimental models.
- Risk-Adjusted Advancement: Facilitates prioritization of targets or mechanisms based on subpopulation-specific metabolic dependencies, reducing false leads in later stages.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from hypothesis testing to lead identification, providing metabolic resolution that complements genomic and proteomic subpopulation analysis.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification and biological de-risking by isolating metabolic signals specific to sorted subpopulations, such as cell cycle phases.
- Screening: Delivers assay-ready, quantitative metabolite enrichment data that enable reliable comparison of compound effects across defined fractions.
- Analytics: Generates mass isotopomer distributions and labeled carbon/nitrogen fractions that serve as stable, time-integrated readouts for pathway flux assessment.
- Translational Research: Enables continuity from sorted population analysis in vitro to preclinical models by preserving metabolic state fidelity through MID-based validation.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for metabolic phenotyping of any sortable subpopulation, reducing redundant method development across projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in heterogeneous systems.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization through internal controls (mock-sorted samples) that verify methodological robustness.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling earlier, more accurate go/no-go decisions based on subpopulation-specific metabolic dependencies.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by highlighting metabolic vulnerabilities in distinct cell states, informing combination therapy or biomarker strategies.
Implementation Considerations
- Requires expertise in stable isotope labeling, flow cytometry sorting, and LC-HRMS data analysis for metabolite enrichment calculations.
- Depends on access to cell sorters, mass spectrometry platforms, and isotope-labeled media with dialyzed supplements.
- Necessitates standardized handling procedures to minimize metabolic drift during sorting and extraction, particularly for time-sensitive samples.
- Involves adaptation considerations when applying the method to primary cells or tissues with varying fragility or sorting efficiency.
- Includes practical limitations such as the need for rapid metabolite extraction post-sort to prevent ex vivo metabolic alterations, as noted in the protocol.
