Débit Virometry pour l'analyse antigénique Spectra de virions et extracellulaires Vésicules

Les virus ou vésicules extracellulaires ont été immunocapturés avec des nanoparticules magnétiques de 15 nm couplées à des anticorps reconnaissant les antigènes de surface. Les virions ou vésicules capturés ont été marqués avec des anticorps fluorescents contre d’autres antigènes de surface. Les complexes résultants ont été séparés dans un champ magnétique élevé et analysés avec des cytomètres en flux conventionnels déclenchés en fluorescence.

L’objectif général de cette procédure est d’utiliser des particules magnétiques ou MNP pour identifier plusieurs antigènes à la surface de virions uniques ou de vésicules extracellulaires uniques avec un cytomètre en flux conventionnel. Cette méthode peut nous aider à déterminer la nature de la relation entre le phénotype et la fonction des vésicules et des virus dans les maladies humaines, en particulier dans les infections virales. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet d’analyser des virions uniques ou des vésicules extracellulaires uniques au lieu d’une analyse en vrac dans laquelle les propriétés individuelles de ces particules sont perdues.

Cette méthode peut donner un aperçu de la façon appropriée de tester les particules virales, mais elle peut également être appliquée à d’autres systèmes à condition que des anticorps appropriés soient disponibles. En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode auront du mal car toutes les étapes doivent être vérifiées et vérifiées avant l’analyse, y compris la configuration correcte du cytomètre en flux. Commencez par combiner 60 microlitres de MNP par condition, et cinq microlitres de fragments de FAB marqués spécifiques pour l’isotype de l’anticorps de capture d’intérêt dans un tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre.

Incuber la solution à température ambiante pendant 30 minutes en mélangeant continuellement. Ensuite, prémouillez un concentrateur 100K avec 300 microlitres de PBS et faites tourner le concentrateur dans la microcentrifugeuse. A la fin de la centrifugation, purifier les complexes marqués sur une colonne de 100K suivie d’une autre microcentrifugation en remettant en suspension la pastille dans 200 microlitres de PBS frais.

Pour capturer les particules d’intérêt, incubez les MNP marqués d’anticorps avec la particule d’intérêt pour la période d’incubation et la température appropriées. Ensuite, bloquez toute liaison FC non spécifique avec l’espèce appropriée d’anticorps IGG, agitez doucement et incubez la solution de particules pendant trois à cinq minutes à température ambiante. Ajouter ensuite la concentration recommandée par le fabricant de chaque anticorps de détection aux particules ou des anticorps de contrôle d’isotype à l’échantillon de contrôle d’isotype pour une incubation supplémentaire de 20 minutes à température ambiante.

Pour séparer les particules capturées par le MNP de l’anticorps non lié, placez d’abord une colonne de séparation magnétique dans un aimant séparateur et prémouillez la colonne avec 500 microlitres de tampon de lavage. Laissez le tampon de lavage s’écouler à travers la colonne, puis ajoutez les complexes de particules MNP à la colonne collectant le flux dans un conteneur à déchets. Lorsque toute la solution complexe a traversé la colonne, lavez la colonne trois fois avec 500 microlitres de tampon de lavage.

Transférez ensuite la colonne dans un tube de 12 x 75 millimètres. Après trois minutes, ajoutez 200 microlitres de PBS, en laissant les billes s’éluer par gravité. Lorsque tout le PBS a traversé la colonne, ajoutez 200 microlitres de PBS frais dans le tube et fixez les particules avec 200 microlitres de paraformaldéhyde à 4 %.

Ensuite, chargez du PBS filtré de 0,22 micron sur un cytomètre en flux et ajustez la tension PMT sur le cytomètre jusqu’à ce que le PBS filtré ne montre aucun ou très peu d’événements. Ensuite, exécutez les particules capturées par MNP à l’aide d’un faible débit avec un filtre en ligne de 0,04 micron pour le fluide de gaine placé en série derrière le filtre à gaine standard de 0,2 micron afin d’éliminer davantage tout faux événement. Avec la virométrie en flux, il est maintenant possible de visualiser des antigènes cellulaires sur des particules virales individuelles.

Par exemple, dans cette expérience, une forte hétérogénéité des virions du VIH-1 a été observée pour la présence de LFA-1 et HLA-DR avec une capture de particules virales dépendante des cellules qui répliquaient le virus. La maturation du virus de la dengue est associée à l’expression de protéines membranaires précurseurs sur les virions qui peuvent être distinguées par virométrie en flux comme nous venons de le démontrer. Dans cette expérience représentative, des vésicules extracellulaires ont été capturées à partir de plasma pauvre en plaquettes à l’aide de divers anticorps fluorescents couplés à des MNP pour étudier différents sous-ensembles de virus extracellulaires chez des patients atteints de syndrome coronarien aigu.

L’analyse virométrique en flux a déterminé que si le nombre global de vésicules extracellulaires était principalement augmenté chez les patients atteints de syndrome coronarien aigu par rapport aux témoins donneurs sains, l’ampleur de l’augmentation variait entre les différentes sous-populations de vésicules extracellulaires. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en deux heures si elle est exécutée correctement. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler de bien configurer votre cytomètre en flux avant de commencer l’analyse.

Le développement de cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la virologie et de la biologie extracellulaire pour étudier les rôles de ces particules dans les processus normaux et pathologiques dans le système in vitro et dans des échantillons humains et animaux. Après cette procédure, d’autres méthodes telles que la PCR ou la spectrométrie de masse peuvent être effectuées pour répondre à des questions supplémentaires telles que les protéines, l’ARN ou les molécules d’ADN que les VE ou les virus spécifiquement capturés transportent. J’espère qu’après avoir regardé cette vidéo, vous avez une bonne compréhension de la façon d’analyser la composition antigénique des virions individuels ou des vésicules extracellulaires individuelles.